• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    益腎化濕顆粒對(duì)糖尿病腎病小鼠中Yes相關(guān)蛋白的調(diào)控作用

    2023-10-23 01:35:20蔡小凡黃潔波符欣漪鄧躍毅鐘逸斐吳慧娟
    中國(guó)藥理學(xué)通報(bào) 2023年10期
    關(guān)鍵詞:系膜區(qū)皮質(zhì)尿蛋白

    蔡小凡,黃潔波,邢 玥,符欣漪,鄧躍毅,鐘逸斐,吳慧娟

    (1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,上海 200032; 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀區(qū)中心醫(yī)院,上海 200062;3.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理系,上海 200032)

    糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最為常見的微血管并發(fā)癥,發(fā)病率約為20%~40%,并已成為全球范圍內(nèi)導(dǎo)致慢性腎臟病及終末期腎病的首要病因[1-2]。DN在病程中可涉及腎小球及腎小管間質(zhì)的諸多病理變化,如細(xì)胞外基質(zhì)增多、足細(xì)胞表型改變及腎纖維化等,推動(dòng)著DN向終末期腎病的進(jìn)展。Yes相關(guān)蛋白(Yes associated protein,YAP)是Hippo信號(hào)通路下游的重要效應(yīng)分子[3],可直接調(diào)控包括結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[4]。其在慢性腎臟病中的作用近年來開始受到諸多學(xué)者的關(guān)注。DN的眾多病理進(jìn)程,如足細(xì)胞損傷、系膜細(xì)胞增生及腎間質(zhì)纖維化等[4-6]均有YAP的參與。

    益腎化濕顆粒(Yishen Huashi Granule,YSHS)(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090250)源于李東垣《脾胃論》中的經(jīng)典方劑“升陽益胃湯”,具有升陽補(bǔ)脾、益腎化濕、利水消腫的功效,主治以脾腎虧虛為主的DN,臨床療效及安全性較好[7]。國(guó)內(nèi)學(xué)者采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)YSHS主要成分進(jìn)行了準(zhǔn)確定性,共鑒定出包括香豆素類、三萜類、黃酮類化合物在內(nèi)的主要成分68個(gè)。其中,柴胡皂苷A、黃芪甲苷III/IV、澤瀉醇A等與腎病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)有良好的結(jié)合活性,并能參與晚期糖基化產(chǎn)物-中膜產(chǎn)物受體信號(hào)通路在內(nèi)的多條通路。說明該藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)[8]。另有研究表明,YSHS可上調(diào)DN小鼠nephrin、podocin等足細(xì)胞功能蛋白[9],而下調(diào)CTGF的過表達(dá)則能改善足細(xì)胞功能蛋白的表達(dá)減少[10]。本研究從YAP/CTGF信號(hào)通路入手,觀察YSHS對(duì)DN小鼠YAP的調(diào)控作用及由此對(duì)CTGF與足細(xì)胞功能蛋白nephrin、wilm′s tumor 1(WT1)及podocalyxin mRNA表達(dá)的影響, 探討該藥改善DN腎小球病理損傷的可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性C57BL6小鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量(22~25) g,購買自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SCXK(滬)2018-004,合格證號(hào):20180004025908。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中,環(huán)境溫度(23~25)℃,濕度40%~70%,分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)水,保持良好通風(fēng)環(huán)境,標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物干飼料,12 h交替照明。

    1.1.2藥物 益腎化濕顆粒(YSHS),由廣州康臣藥業(yè)有限公司提供。組分:人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、澤瀉、半夏、羌活、獨(dú)活、防風(fēng)、柴胡、黃連、白芍、陳皮、炙甘草、生姜、大棗,10 g/袋。維替泊芬(vertepofin,VP)(編號(hào)SML0534),購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

    1.1.3主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)(S0130)購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。小鼠血肌酐(serum creatinine,Scr)試劑盒(C011-2-1)、尿素氮(blood urea nitrogen,Bun)試劑盒(編號(hào)C013-2-1)及尿蛋白(urine protein,Upro)試劑盒(C035-2-1),均購自南京建成生物工程研究所。YAP抗體(14074T)及磷酸化-YAP絲氨酸127抗體(p-YAP S127)(13008T)均購自美國(guó)CST公司,CTGF抗體(ab6992)購自英國(guó)Abcam公司。

    1.2 方法

    1.2.1模型建立及分組給藥 從28只C57BL/6小鼠中隨機(jī)抽取7只作為對(duì)照組,其余21只通過STZ誘導(dǎo)建立DN小鼠模型。采取連續(xù)5 d腹腔注射2%的STZ (50 mg·kg-1、0.1 mol·L-1、pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液),其中首次注射前禁食24 h,d 2~5注射前禁食6 h,對(duì)照組給予等體積溶媒。末次注射72 h后尾靜脈取血檢測(cè)血糖,以血糖≥16.7 mmol·L-1,尿蛋白定量超過正常對(duì)照組,且大于原24 h尿蛋白量150%(連續(xù)出現(xiàn)2次以上)[11]為DN模型制備成功。隨機(jī)分為模型組、YSHS組和VP組,每組7只,第8周結(jié)束后開始干預(yù)。其中YSHS組給予YSHS每日一次性灌胃5 g·kg-1,VP組為隔日腹腔一次性注射25 mg·kg-1,對(duì)照組與模型組給予等體積生理鹽水一次性灌胃。

    1.2.2尿蛋白、血肌酐及尿素測(cè)定 留取給藥前后小鼠尿液標(biāo)本雙縮脲法測(cè)定Upro。干預(yù)結(jié)束后處死小鼠,腹主動(dòng)脈取血,3 000 r·min-1離心15 min取上層血清,分別用肌氨酸氧化酶及脲酶法檢測(cè)Scr及Bun水平。

    1.2.3HE染色觀察 取小鼠腎皮質(zhì)組織,10%中性甲醛溶液內(nèi)固定24 h后,常規(guī)脫水、二甲苯透明及石蠟包埋,制成4 μm切片。行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,二甲苯透明,烤干后中性樹膠封片,光鏡觀察腎小球系膜區(qū)改變情況。根據(jù)腎小球系膜區(qū)增寬程度分為輕度(系膜區(qū)寬度<毛細(xì)血管襻直徑)、中度(系膜區(qū)寬度>毛細(xì)血管襻直徑) 及重度(系膜基質(zhì)擠壓襻呈結(jié)節(jié)、團(tuán)塊或分葉狀)進(jìn)行評(píng)估。

    1.2.4Western blot檢測(cè) 采用Western blot法對(duì)YAP、p-YAP S127及CTGF的蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。取部分腎皮質(zhì)組織提取總蛋白。100 ℃ 10 min蛋白變性后加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)入PVDF膜。用5%脫脂奶粉TBST浸泡PVDF膜,室溫?fù)u床封閉1 h后,加入一抗兔抗YAP抗體(1 ∶1 000),抗p-YAP S127抗體(1 ∶1 000),抗CTGF抗體(1 ∶1 000),并以GAPDH(1 ∶1 000)為內(nèi)參在4 ℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜3次,每次5 min,加入羊抗兔IgG-HRP(1 ∶5 000),37 ℃孵育1 h,再次洗滌3次。顯影曝光后ImageJ軟件分析結(jié)果。

    1.2.5RT-PCR檢測(cè) 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成(Tab 1)。采用TRIzol Reagent一步法提取總RNA后,稀釋并逆轉(zhuǎn)錄,將制備好的cDNA用于PCR擴(kuò)增,各指標(biāo)均擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),以β-actin為內(nèi)參,YAP、CTGF、nephrin、WT1和podocalyxin的mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。引物序列,見Tab 1。

    Tab 1 Primer sequence for real-time PCR

    Tab 2 Comparison of kidney function and urine protein level in different groups of

    Fig 1 Effect of Yishen huashi Granule on pathological changes in glomerulus of mice(HE ×400)

    2 結(jié)果

    2.1 YSHS對(duì)DN小鼠腎功能、尿蛋白的影響如Tab 2所示,與對(duì)照組相比,第12周時(shí),模型組小鼠Scr及Bun水平均明顯升高(P<0.01)。YSHS組、VP組相較于模型組,Scr、Bun水平均有較明顯改善(P<0.01,P<0.05)。與同期對(duì)照組相比,DN小鼠在第8周和第12周時(shí)的Upro均明顯升高(P<0.01),經(jīng)YSHS、VP治療4周后,兩組各自的Upro較同期模型組均明顯下降(P<0.01)。

    2.2 YSHS對(duì)DN小鼠腎小球病理形態(tài)學(xué)的影響如Fig 1所示,對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常。與對(duì)照組相比,模型組腎小球系膜區(qū)基質(zhì)明顯增多,系膜區(qū)寬度>毛細(xì)血管襻直徑(中度增寬);而經(jīng)YSHS與VP治療后,上述病理表現(xiàn)較模型組有所減輕。

    2.3 YSHS對(duì)DN小鼠腎皮質(zhì)YAP、p-YAP S127及CTGF蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠YAP、p-YAP S127及CTGF蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。經(jīng)VP治療后YAP、p-YAP S127和CTGF的蛋白表達(dá)較模型組明顯下降(P<0.01)。而經(jīng)YSHS治療后,三者的表達(dá)較模型組亦有明顯下降 (P<0.01),見Fig 2。

    2.4 YSHS對(duì)DN小鼠腎皮質(zhì)YAP與CTGF mRNA表達(dá)的影響如 Fig 3所示,與對(duì)照組比較,模型組YAP與CTGF的mRNA表達(dá)量均有所上升(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,YSHS組兩者的mRNA均有所下降(P<0.01),其中CTGF的mRNA表達(dá)量亦低于對(duì)照組水平(P<0.01)。與對(duì)照組、模型組比較,VP組兩者的mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.01),其中YAP的mRNA表達(dá)量亦明顯低于YSHS組(P<0.01)。

    Fig 2 The protein expression of YAP, p-YAP S127 and CTGFin renal cortex among each group n=7)

    2.5 YSHS對(duì)DN小鼠腎皮質(zhì)nephrin、WT1、podocalyxin mRNA表達(dá)的影響如Fig 4所示,與對(duì)照組比較,模型組nephrin、WT1和podocalyxin的mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.01)。與模型組比較,YSHS組三者的mRNA表達(dá)量均明顯上升(P<0.01),而VP組nephrin、podocalyxin的mRNA表達(dá)量有所上升(P<0.01,P<0.05),但WT1的mRNA表達(dá)量與模型組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    Fig 3 Relative mRNA expression of YAP and CTGF in renal cortexamong each group n=7)

    Fig 4 Relative mRNA expression of nephrin, WT1 and podocalyxin

    3 討論

    DN的主要臨床表現(xiàn)有蛋白尿、低蛋白血癥性水腫及腎功能不全,故中醫(yī)屬于“尿濁”、“水腫”、“虛勞”等范疇,病機(jī)上則多因脾失健運(yùn),并由脾及腎,導(dǎo)致脾腎兩虛而引發(fā)。益腎化濕顆粒秉承“升陽益胃湯”方義,是從脾論治的代表方劑。臨床研究表明,該藥與利格列汀聯(lián)用可有效降低DN患者腎功能相關(guān)指標(biāo)[7]。本研究中,經(jīng)YSHS治療后的DN小鼠,尿蛋白濃度、血肌酐及尿素水平上均有明顯下降,再次證實(shí)了該藥在減少蛋白尿及延緩腎功能進(jìn)展方面的作用。

    YAP是Hippo信號(hào)通路下游的核心元件之一,具有通過進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)轉(zhuǎn)錄增殖來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡的作用。該作用又與YAP的磷酸化密切相關(guān)。通常,YAP以磷酸化的形式滯留在胞漿中,只有去磷酸化的YAP才能入核發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。YAP可參與DN病程進(jìn)展過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)。在db/db小鼠中,YAP表達(dá)增多是導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞增生及系膜區(qū)基質(zhì)增多的重要原因[5]。腎近曲小管上皮細(xì)胞中YAP的活化可促進(jìn)DN腎間質(zhì)纖維化,而上述進(jìn)程可通過YAP抑制劑VP的干預(yù)得到改善[4]。此外,過表達(dá)的YAP還能誘使足細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期并發(fā)生去分化,造成足細(xì)胞表型的改變[12]。與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符,本研究中DN小鼠腎皮質(zhì)組織中的YAP在蛋白與mRNA表達(dá)水平上均明顯升高,經(jīng)YSHS治療后,上述指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度的下降且腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增多情況亦得到改善,說明該藥具有下調(diào)YAP表達(dá),以減輕腎小球系膜區(qū)病理損傷作用。我們還發(fā)現(xiàn),經(jīng)YSHS治療后p-YAPS127蛋白表達(dá)亦較模型組有明顯下降。這從一定程度上提示,YSHS對(duì)DN的治療作用并非通過將YAP滯留于胞漿以減少YAP入核的形式實(shí)現(xiàn),而主要是通過減少YAP的表達(dá)來完成。

    作為一種重要的纖維化誘導(dǎo)因子,CTGF能促進(jìn)DN中腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增多、腎小球硬化及間質(zhì)纖維化的發(fā)生。在DN大鼠腎組織及DN患者腎小球中,均可以發(fā)現(xiàn)CTGF在mRNA表達(dá)水平的升高[13-14]。足細(xì)胞損傷導(dǎo)致相關(guān)功能蛋白表達(dá)水平下降是DN的又一重要病理標(biāo)志[15],而該過程亦與CTGF密切相關(guān)[16]。通過特異性抗體清除CTGF,可有效提高DN中nephrin等足細(xì)胞蛋白的表達(dá)[10]。而相關(guān)研究已證實(shí),CTGF可直接受到Y(jié)AP的調(diào)控[4]。利用VP進(jìn)行干預(yù),可抑制DN小鼠腎組織中CTGF的表達(dá)[4]。因此,本研究中我們對(duì)腎皮質(zhì)組織中CTGF及分別位于足細(xì)胞裂孔膈膜、細(xì)胞核及頂端的功能蛋白nephrin、WT1、podocalyxin的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示,模型組小鼠CTGF的蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高,而YSHS和VP組CTGF的表達(dá)量均出現(xiàn)下降,該結(jié)果與DN大鼠的研究報(bào)道一致[13]。此外,YSHS組小鼠的nephrin、WT1及podocalyxin的mRNA表達(dá)量較模型組均有所上調(diào)。說明YSHS具有通過抑制YAP過表達(dá),下調(diào)CTGF表達(dá)水平上調(diào)nephrin、WT1及podocalyxin等足細(xì)胞功能蛋白mRNA的作用。值得注意的是,與模型組比較,VP組小鼠的nephrin和podocalyxin的mRNA表達(dá)水平亦有上升,但WT1的mRNA表達(dá)升高不明顯。造成該結(jié)果的原因可能與本研究中VP的給藥劑量(25 mg·kg-1,隔日一次)遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道中的劑量(100 mg·kg-1,隔日一次),從而減弱了該藥的療效有關(guān)。

    綜上所述,益腎化濕顆粒在DN治療過程中具有降低尿蛋白、保護(hù)腎功能的作用。該作用可能與其下調(diào)DN小鼠腎皮質(zhì)組織中YAP的表達(dá)水平,從而減少CTGF表達(dá),并上調(diào)足細(xì)胞nephrin、WT1及podocalyxin等功能蛋白的mRNA表達(dá)有關(guān)。

    猜你喜歡
    系膜區(qū)皮質(zhì)尿蛋白
    一種病房用24小時(shí)尿蛋白培養(yǎng)收集器的說明
    基于基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析構(gòu)建腎上腺皮質(zhì)癌預(yù)后模型
    皮質(zhì)褶皺
    迎秋
    睿士(2020年11期)2020-11-16 02:12:27
    遺傳性C3腎炎
    IgA腎病患者系膜區(qū)C3沉積強(qiáng)度與臨床病理特征的相關(guān)性分析
    尿蛋白(+),警惕妊娠期高血壓疾病
    媽媽寶寶(2017年4期)2017-02-25 07:01:26
    不同時(shí)段內(nèi)尿蛋白量的變化及其對(duì)子癇前期的診斷意義
    IgA腎病重復(fù)活檢出現(xiàn)新發(fā)膜性腎病
    探討變色酸2R-亮綠在腎活檢組織染色中的應(yīng)用
    国产精品99久久久久久久久| 久久亚洲真实| 两个人视频免费观看高清| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲天堂国产精品一区在线| av.在线天堂| 日本色播在线视频| 我要搜黄色片| 老司机午夜福利在线观看视频| a级一级毛片免费在线观看| 小说图片视频综合网站| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲欧美清纯卡通| 国产成人a区在线观看| 国产老妇女一区| 热99在线观看视频| 一区二区三区免费毛片| 国产精品伦人一区二区| 级片在线观看| 欧美区成人在线视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 美女免费视频网站| 69av精品久久久久久| 精品一区二区三区人妻视频| 国产成年人精品一区二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 啦啦啦啦在线视频资源| 91在线观看av| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲最大成人av| 乱系列少妇在线播放| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产视频一区二区在线看| 亚洲美女视频黄频| 午夜免费激情av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 色播亚洲综合网| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美高清成人免费视频www| 一进一出抽搐gif免费好疼| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲国产色片| netflix在线观看网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| 九色成人免费人妻av| 国内精品宾馆在线| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品人妻熟女av久视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 日韩精品青青久久久久久| 九九热线精品视视频播放| 久99久视频精品免费| 日韩一区二区视频免费看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久久久久久久久黄片| 午夜爱爱视频在线播放| av在线亚洲专区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 中文字幕高清在线视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品久久久久久久久免| 婷婷精品国产亚洲av| 日韩精品有码人妻一区| 91久久精品国产一区二区成人| 精品久久久久久成人av| 亚洲中文字幕日韩| 精品乱码久久久久久99久播| 日韩 亚洲 欧美在线| av专区在线播放| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品日韩av在线免费观看| 一进一出抽搐动态| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产高清视频在线观看网站| 美女 人体艺术 gogo| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久精品人妻少妇| 日本a在线网址| 成熟少妇高潮喷水视频| 不卡一级毛片| 俄罗斯特黄特色一大片| 别揉我奶头 嗯啊视频| 在线a可以看的网站| 久久久久久久久大av| 性色avwww在线观看| 国产高清三级在线| 国产极品精品免费视频能看的| 久久国产乱子免费精品| 97超视频在线观看视频| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲精华国产精华精| 高清日韩中文字幕在线| 极品教师在线免费播放| 国产亚洲av嫩草精品影院| 两人在一起打扑克的视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 99热6这里只有精品| 一本精品99久久精品77| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 在线a可以看的网站| 搡老岳熟女国产| 亚洲精品粉嫩美女一区| 99riav亚洲国产免费| 亚洲男人的天堂狠狠| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 久久久久久国产a免费观看| 久久精品国产亚洲网站| 少妇高潮的动态图| 香蕉av资源在线| 成年人黄色毛片网站| 窝窝影院91人妻| 波多野结衣高清无吗| 在线观看美女被高潮喷水网站| 特大巨黑吊av在线直播| 免费观看在线日韩| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 日本黄色视频三级网站网址| avwww免费| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 一级黄色大片毛片| 免费无遮挡裸体视频| 免费无遮挡裸体视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜福利18| 亚洲av成人av| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产探花在线观看一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 欧美日韩精品成人综合77777| 日韩强制内射视频| 欧美色视频一区免费| 黄色丝袜av网址大全| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产男人的电影天堂91| www.www免费av| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美潮喷喷水| 两个人的视频大全免费| 有码 亚洲区| 国产人妻一区二区三区在| 久久久久性生活片| 露出奶头的视频| 岛国在线免费视频观看| 精品日产1卡2卡| 黄色一级大片看看| 精品人妻1区二区| 亚洲自偷自拍三级| av在线天堂中文字幕| 性色avwww在线观看| 亚洲第一电影网av| 少妇高潮的动态图| 久久亚洲精品不卡| 久久久久久大精品| 夜夜爽天天搞| 成人鲁丝片一二三区免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲18禁久久av| 成人午夜高清在线视频| 成年免费大片在线观看| 国产综合懂色| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 九九爱精品视频在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产一区二区三区视频了| 久久久成人免费电影| videossex国产| 成人亚洲精品av一区二区| 在线观看舔阴道视频| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲内射少妇av| 真人一进一出gif抽搐免费| 99热这里只有是精品50| 九九在线视频观看精品| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产免费男女视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 在线观看午夜福利视频| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美激情国产日韩精品一区| 嫩草影视91久久| 亚洲av免费在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 伦理电影大哥的女人| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩一区二区视频免费看| 成人av一区二区三区在线看| 波多野结衣高清作品| 国产精华一区二区三区| 国产大屁股一区二区在线视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久这里只有精品中国| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品永久免费网站| 网址你懂的国产日韩在线| 黄色女人牲交| 男人的好看免费观看在线视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国内精品美女久久久久久| 有码 亚洲区| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲av中文av极速乱 | 国产麻豆成人av免费视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产极品精品免费视频能看的| 日本精品一区二区三区蜜桃| 一本久久中文字幕| 国产 一区 欧美 日韩| 我的老师免费观看完整版| 91麻豆精品激情在线观看国产| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 精品久久久久久久久久久久久| 黄色日韩在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 夜夜爽天天搞| 国产精品永久免费网站| 欧美日韩综合久久久久久 | 在线免费十八禁| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品在线观看二区| 天美传媒精品一区二区| 国产精品电影一区二区三区| 在线免费观看的www视频| 成人二区视频| 午夜福利在线在线| 熟女人妻精品中文字幕| 中文亚洲av片在线观看爽| 日本免费a在线| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品一及| 国产久久久一区二区三区| 日日啪夜夜撸| 乱系列少妇在线播放| 欧美区成人在线视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 中文资源天堂在线| 亚洲无线在线观看| 天堂网av新在线| 成人国产麻豆网| 可以在线观看的亚洲视频| 精品不卡国产一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 成人永久免费在线观看视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产高清三级在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 中出人妻视频一区二区| 午夜免费成人在线视频| 三级毛片av免费| 亚洲第一区二区三区不卡| 99久久无色码亚洲精品果冻| 看免费成人av毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 中文字幕高清在线视频| 亚洲国产欧美人成| 成人欧美大片| 少妇的逼好多水| 高清在线国产一区| 精品国产三级普通话版| 99久国产av精品| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久久久国产a免费观看| 一本精品99久久精品77| 亚洲综合色惰| 久久精品国产亚洲av天美| 少妇人妻一区二区三区视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲av熟女| 久久久久免费精品人妻一区二区| 淫秽高清视频在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲精品色激情综合| 亚洲avbb在线观看| 亚洲自拍偷在线| 51国产日韩欧美| 动漫黄色视频在线观看| 天天躁日日操中文字幕| h日本视频在线播放| 精品免费久久久久久久清纯| 国产探花极品一区二区| 制服丝袜大香蕉在线| 免费一级毛片在线播放高清视频| 变态另类丝袜制服| 美女被艹到高潮喷水动态| 99热只有精品国产| 真实男女啪啪啪动态图| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲美女视频黄频| 国产精品久久电影中文字幕| 国产不卡一卡二| 国产单亲对白刺激| 美女免费视频网站| 色av中文字幕| 一a级毛片在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产真实伦视频高清在线观看 | 美女免费视频网站| 欧美成人免费av一区二区三区| 97碰自拍视频| 国内精品久久久久久久电影| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 1000部很黄的大片| 成人性生交大片免费视频hd| 大型黄色视频在线免费观看| 精品无人区乱码1区二区| ponron亚洲| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线a可以看的网站| 天天躁日日操中文字幕| 在线a可以看的网站| 国产精品久久久久久av不卡| 免费av不卡在线播放| av视频在线观看入口| 内射极品少妇av片p| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日韩国内少妇激情av| 亚洲性夜色夜夜综合| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 51国产日韩欧美| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产淫片久久久久久久久| 不卡一级毛片| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩精品青青久久久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久久九九精品二区国产| 久久久国产成人免费| 日本-黄色视频高清免费观看| www.www免费av| 国产老妇女一区| 成人无遮挡网站| 波野结衣二区三区在线| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日韩高清综合在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 男人和女人高潮做爰伦理| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲精华国产精华精| 波野结衣二区三区在线| 日本一二三区视频观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 午夜老司机福利剧场| 小说图片视频综合网站| 亚洲av免费高清在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 国内精品宾馆在线| 22中文网久久字幕| 99热6这里只有精品| 婷婷精品国产亚洲av在线| 好男人在线观看高清免费视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 波多野结衣高清作品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲av成人av| 内地一区二区视频在线| 两个人的视频大全免费| 两个人视频免费观看高清| 国产激情偷乱视频一区二区| 少妇丰满av| 99热6这里只有精品| 欧美区成人在线视频| 超碰av人人做人人爽久久| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲美女黄片视频| 久久九九热精品免费| 色综合色国产| 久久久久久大精品| 国产综合懂色| 欧美日韩精品成人综合77777| 人妻少妇偷人精品九色| 九九在线视频观看精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| av在线老鸭窝| 精品国产三级普通话版| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产精品无大码| 成年女人毛片免费观看观看9| 3wmmmm亚洲av在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 一进一出好大好爽视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 精品久久久久久久久av| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品电影一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品99久久久久久久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 午夜精品在线福利| 男人舔奶头视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 男女那种视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 免费av观看视频| 一级毛片久久久久久久久女| 一个人看的www免费观看视频| 俺也久久电影网| 1000部很黄的大片| 国产亚洲欧美98| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 色5月婷婷丁香| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲国产精品合色在线| 久久久久九九精品影院| 国产精品综合久久久久久久免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜福利欧美成人| 99热这里只有是精品50| 舔av片在线| 色5月婷婷丁香| 丝袜美腿在线中文| 国产极品精品免费视频能看的| bbb黄色大片| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美成人免费av一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久久国产a免费观看| 国产探花在线观看一区二区| 我要看日韩黄色一级片| 网址你懂的国产日韩在线| 99久久精品国产国产毛片| 日韩一本色道免费dvd| 桃色一区二区三区在线观看| www日本黄色视频网| 午夜久久久久精精品| 婷婷六月久久综合丁香| 成人综合一区亚洲| 深爱激情五月婷婷| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 午夜福利视频1000在线观看| 男人舔奶头视频| 亚洲av不卡在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| av视频在线观看入口| 亚洲中文字幕日韩| 韩国av在线不卡| 午夜福利欧美成人| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩国内少妇激情av| 国产成人影院久久av| 中文字幕av成人在线电影| 一级av片app| 国产精品一及| 欧美高清成人免费视频www| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲,欧美,日韩| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩一本色道免费dvd| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 91狼人影院| 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩欧美 国产精品| 又爽又黄无遮挡网站| 久久久久久久久大av| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲av熟女| 999久久久精品免费观看国产| 免费在线观看成人毛片| 国产高清激情床上av| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲七黄色美女视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 综合色av麻豆| h日本视频在线播放| 国产人妻一区二区三区在| 一级a爱片免费观看的视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 婷婷精品国产亚洲av| 简卡轻食公司| 一a级毛片在线观看| 成人综合一区亚洲| 国产高清有码在线观看视频| 成年女人看的毛片在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 在线免费观看的www视频| 国产亚洲精品av在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 中文字幕av成人在线电影| 99热这里只有精品一区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一本一本综合久久| 精品人妻视频免费看| 一本精品99久久精品77| 极品教师在线免费播放| 在线天堂最新版资源| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费电影在线观看免费观看| 色5月婷婷丁香| 男插女下体视频免费在线播放| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产综合懂色| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产视频一区二区在线看| 精品无人区乱码1区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 日韩欧美在线乱码| 一区二区三区免费毛片| 亚洲真实伦在线观看| 在线播放国产精品三级| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美区成人在线视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 看十八女毛片水多多多| 国产成人av教育| 国产高清激情床上av| 看黄色毛片网站| 亚洲五月天丁香| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 级片在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产男人的电影天堂91| 黄色一级大片看看| 无人区码免费观看不卡| 免费av毛片视频| 国产精品人妻久久久久久| 俺也久久电影网| 国产真实伦视频高清在线观看 | 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲成人久久性| 亚洲avbb在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 免费看av在线观看网站| 久久人人爽人人爽人人片va| 成年版毛片免费区| aaaaa片日本免费| 久久中文看片网| 特级一级黄色大片| 成人av在线播放网站| 婷婷六月久久综合丁香| 18+在线观看网站| 国产成人影院久久av| 国产精品福利在线免费观看| av中文乱码字幕在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 在线观看舔阴道视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 少妇被粗大猛烈的视频| 午夜久久久久精精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产在线男女| 最近中文字幕高清免费大全6 | 亚洲av免费在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 深爱激情五月婷婷| 亚洲av二区三区四区| 日韩亚洲欧美综合| 欧美又色又爽又黄视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 欧美国产日韩亚洲一区| 十八禁网站免费在线| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 一本一本综合久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美精品国产亚洲| av在线亚洲专区| 69av精品久久久久久| 久久久午夜欧美精品| 久久久精品大字幕| 亚洲黑人精品在线| 免费看a级黄色片| 99热精品在线国产| 最后的刺客免费高清国语| 精华霜和精华液先用哪个| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 一区二区三区免费毛片| 美女大奶头视频| 中文字幕av在线有码专区| 午夜精品在线福利| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 熟妇人妻久久中文字幕3abv|