參芪扶正注射劑預(yù)防由抗PD-1抗體致免疫性心肌炎損傷的保護(hù)作用

劉 倩,楊嘉明,高文聰,黃海彬,馬 昕,胡振湘,鄭昌博

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500;2.麗珠單抗生物技術(shù)有限公司,廣東 珠海 519000)

目前,腫瘤是全球僅次于心血管疾病的第二大致死疾病。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitor,ICI)是治療腫瘤的一線藥物并受到研究領(lǐng)域的關(guān)注。ICI治療腫瘤藥物中程序性細(xì)胞死亡蛋白-1(programmed cell death protein 1,PD-1)和程序性細(xì)胞死亡蛋白配體-1(programmed death ligand-1,PD-L1)阻斷劑的研究最受矚目。通過(guò)PD-1/PD-L1免疫療法,阻斷PD-1和其配體PD-L1之間的相互作用,從而阻斷腫瘤免疫逃逸通路(PD-1/PD-L1通路),最大限度的提高免疫應(yīng)答,維持T細(xì)胞的腫瘤殺傷活性,延長(zhǎng)患者生存期[1]。然而,在PD-1免疫療法發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)也可能引起自身免疫疾病以及炎癥效應(yīng)。臨床研究發(fā)現(xiàn),PD-1免疫療法引起的免疫性不良反應(yīng)中最致命的毒性是免疫性心肌炎[2],雖然發(fā)生率較低,然而一旦發(fā)生就會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重后果,引起突發(fā)心源性休克,甚至造成死亡。根據(jù)資料顯示,經(jīng)ICI治療的腫瘤患者中,心肌炎發(fā)病率為0.09%[3],而在PD-1/PD-L1單抗聯(lián)合用藥中的心肌炎發(fā)病率卻明顯高至0.27%,并且還出現(xiàn)了兩例致命性心肌炎[4]。其中1例關(guān)于抗PD-1單抗治療腫瘤,誘發(fā)免疫性心肌炎導(dǎo)致患者死亡的病例,其主要原因是心臟出現(xiàn)III級(jí)房室傳導(dǎo)阻滯,隨后出現(xiàn)心動(dòng)過(guò)緩現(xiàn)象,最后導(dǎo)致患者心力衰竭[5]。尸檢解剖病理學(xué)分析顯示心臟組織中淋巴細(xì)胞彌漫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及肌纖維損壞。目前關(guān)于抗PD-1單抗引發(fā)免疫性心肌炎的治療,還僅局限于糖皮質(zhì)激素,而且還容易引發(fā)其他的副作用[6]。因此,研究抗PD-1抗體治療腫瘤的同時(shí),還需關(guān)注其帶來(lái)的免疫性心臟毒性,為腫瘤患者的治療和預(yù)后提供保障。

現(xiàn)已研究證明,多種中藥復(fù)方制劑具有抗病毒、提高機(jī)體免疫、及改善心臟功能。參芪扶正注射劑是以黨參、黃芪為原料提取制成的注射液,具有活血化瘀、益氣扶正的功效。黨參內(nèi)有豐富的氨基酸和多糖物質(zhì),可以增強(qiáng)機(jī)體的抵抗能力,加強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能,并減輕治療中出現(xiàn)的毒副作用;黃芪可以誘導(dǎo)干擾素的生成,增強(qiáng)自然殺傷( natural killer,NK)細(xì)胞的活性參與免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗病毒感染等過(guò)程[7]。參芪扶正注射劑被廣泛應(yīng)用于改善心血管疾病中,如心絞痛、心肌炎、冠心病、心力衰竭等,此外還用于輔助腫瘤治療[7]。然而關(guān)于參芪扶正注射劑是否可以預(yù)防由抗PD-1單抗誘發(fā)的免疫性心肌炎,目前還未有明確實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此,本研究旨在探討心肌炎患者治療腫瘤時(shí)使用抗PD-1抗體是否會(huì)加重心肌炎,以及檢測(cè)參芪扶正注射劑能否預(yù)防抗PD-1抗體造成的心肌炎損傷,為今后參芪扶正注射液臨床輔助治療由PD-1阻斷藥物誘導(dǎo)的心肌炎提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4-5周齡,健康SPF級(jí),C57BL/6的雄性PD-1人源化小鼠,體質(zhì)量(18～22) g,購(gòu)于北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2019-0002。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號(hào)kmmu20221590)。實(shí)驗(yàn)小鼠普通飼料喂養(yǎng),自由飲水,飼養(yǎng)于室溫(20～22) ℃,1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物參芪扶正注射劑,規(guī)格250 mL/瓶(麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司,批號(hào)201214);注射用重組人源化抗PD-1單克隆抗體(珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司,批號(hào)202104034,規(guī)格50 mg/瓶),使用生理鹽水配制終濃度為4 mg·L-1的溶液,給藥劑量為0.04 mg·kg-1;心肌肌球蛋白重鏈肽段——MyHc.0t614629[Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH](上海吉爾生化有限公司,純度>90%,批號(hào)P21115-SJ074923);完全弗氏佐劑(sigma公司,批號(hào)SLCF1289);2%戊巴比妥鈉(昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)。

1.3 試劑與儀器酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTekInstruments公司,型號(hào)ELx800);熒光定量PCR儀(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司,型號(hào)Accurate96);HRP-標(biāo)記羊抗兔二抗(Invitrogen公司,批號(hào)WK337326A);SuperKineTM超敏型ECL發(fā)光液(亞科因生物技術(shù)有限公司,批號(hào)ATVF20051);RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào)082820210119);兔抗GAPDH(Cell Signaling Technology公司,5174S-8)、IL-1β(Proteintech公司,00106096)、TNF-α(Abcam公司,GR3359225-6)、BAX(Abcam公司,ab53154)、BCL-2(Abcam公司,ab32124)、Caspase-3(Abcam公司,ab32351)、Cleaved-Caspase-3(Abcam公司,ab2301);小鼠肌酸激酶同工酶ELISA試劑盒、小鼠肌鈣蛋白ELISA試劑盒(購(gòu)于北京華博德億生物技術(shù)有限公司,批號(hào)分別為1147495、1147496);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司,批號(hào)AJ40606A);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)?real-timePCR)試劑盒(TaKaRa公司,批號(hào)AK81977A)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎模型(experimental autoimmune myocarditis,EAM)的建立根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8],將小鼠來(lái)源的心肌肌球蛋白重鏈α溶于配制好的PBS液中(1 g·L-1),然后將其與相同體積的完全弗氏佐劑乳化充分后,使得終濃度為0.5 g·L-1,構(gòu)建EAM的小鼠分別在試驗(yàn)第1天和第7天腹腔注射0.2 mL上述含有短肽的乳化劑,共腹腔注射2次,其余正常小鼠以生理鹽水進(jìn)行腹腔注射。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)將PD-1人源化小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組處理,共分為4個(gè)小組:①對(duì)照組(Sham組,n=8);②心肌肌球蛋白重鏈肽誘導(dǎo)的心肌炎模型組(EAM組,n=8);③抗PD-1處理的心肌炎組(EAM+anti-PD1組,n=8);④參芪治療組(EAM+anti-PD1+shenqi組,n=8)。分別在第1天和第7天時(shí),sham組腹腔注射0.2 mL生理鹽水,EAM組、EAM+anti-PD1組、EAM+anti-PD1+shenqi組腹腔注射0.2 mL含有短肽的乳化劑構(gòu)建心肌炎模型;第8～22天,Sham組、EAM組、EAM+anti-PD1組小鼠每天以0.8 mL生理鹽水進(jìn)行灌胃處理,EAM+anti-PD1+shenqi組小鼠每天以0.8 mL參芪扶正注射劑進(jìn)行灌胃,總共灌胃15次,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)參考確定參芪扶正注射劑使用體積[9];在第16、18、20、22天,Sham組、EAM組腹腔注射0.2 mL生理鹽水,EAM+anti-PD1組、EAM+anti-PD1+shenqi組腹腔注射0.2 mL抗PD-1單克隆抗體,以間隔1 d的形式每組分別注射4次。在第23天時(shí),小鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(20 mg·kg-1)麻醉,眼眶取血后,處死全部小鼠,收集心臟,進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。動(dòng)物藥物干預(yù)方法基于一定的考量因素(實(shí)驗(yàn)先給予參芪扶正注射劑治療的原因是:參芪扶正注射劑的藥物治療周期需要15 d[9],而抗PD-1單克隆抗體的給藥次數(shù)是根據(jù)文獻(xiàn)參考設(shè)定為4次[10],為了驗(yàn)證心肌炎患者再使用抗PD-1單克隆抗體治療腫瘤是否會(huì)加重心肌損傷,因此先建立EAM模型,以參芪扶正注射劑預(yù)防抗PD-1單克隆抗體所致的心肌損傷)。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)小鼠心臟組織中IL-1β、TNF-α、Bax/BCL-2、Cleaved caspase-3/caspase-3蛋白表達(dá)取下心臟組織后用預(yù)冷PBS沖洗3次,去除PBS沖洗液,加入含有蛋白酶抑制劑的預(yù)冷RIPA裂解緩沖液裂,使用高通量組織破碎儀(60 Hz,30 s/次)將心臟組織研磨裂解。研磨結(jié)束后離心取上清(即總蛋白),用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后,加入蛋白上樣緩沖液在95 ℃條件下進(jìn)行蛋白變性5 min。蛋白變性后通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,在冰浴條件下,采用濕轉(zhuǎn)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。取出PVDF膜放入2%BSA封閉液中,室溫封閉1 h后,將目的條帶放至相對(duì)應(yīng)的一抗中,包括GAPDH(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶1 000)、TNF-α(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、BCL-2(1 ∶1 000)、Cleaved caspase-3(1 ∶1 000)、及caspase-3(1 ∶1 000),4 ℃搖床上孵育過(guò)夜。次日取出條帶,用TBST洗3次,每次10 min,再加入羊抗兔二抗,室溫孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后,使用TBST洗3次,每次20 min。根據(jù)SuperKineTM超敏型ECL發(fā)光液說(shuō)明書配制顯影液,取出洗好的目的條帶,將條帶平放于成像儀里,均勻滴上顯影液后,使用Tanon顯影儀及GelCap ECL軟件采集圖像。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)IL-1β、TNF-α、Bax/BCL-2 mRNA表達(dá)采用TRIzol法提取心臟總RNA,按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用TB Green染料法定量試劑盒以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,檢測(cè)mRNA表達(dá),所獲數(shù)據(jù)通過(guò)2-ΔΔCt法進(jìn)行處理與分析。實(shí)驗(yàn)所用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成,引物序列見Tab 1。

Tab 1 Information for primer sequences

2.6 心臟病理特征檢測(cè)將小鼠處死后取心臟用于蘇木素-伊紅(HE)染色,10%中性甲醛固定心臟,再進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,切片厚度為1 cm,進(jìn)行HE染色,梯度酒精脫水,中性樹膠封固,鏡下檢測(cè)心臟組織心肌纖維變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生等病理改變。

2.7 血清生物標(biāo)志物檢測(cè)小鼠眼眶取500～1 000 μL血液,放至37 ℃ 1 h后,3 000 r·min-1離心5 min,取上清(即為血清),ELISA法檢測(cè)小鼠血清中肌酸激酶同工酶(creatine kinase muscle brain,CK-MB)、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,cTNT)水平,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 PD-1人源化小鼠的心臟指標(biāo)(心肌肥厚指標(biāo))的變化情況小鼠取樣時(shí),對(duì)體質(zhì)量(body weight,BW)、心臟質(zhì)量(heart weight,HW)、脛骨長(zhǎng)度(tibial length,TL)進(jìn)行稱量及測(cè)量統(tǒng)計(jì),以心臟質(zhì)量/體質(zhì)量(HW/BW)、心臟重量/脛骨長(zhǎng)度(HW/TL)作為初步判斷心肌肥厚指標(biāo)。結(jié)果顯示,與sham組相比,EAM組、EAM+anti-PD1組及EAM+anti-PD1+shenqi組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示心肌炎模型的建立以及抗PD-1單克隆抗體的給予不會(huì)對(duì)小鼠造成心肌肥厚的影響,見Fig 1。

3.2 心臟病理特征分析通過(guò)HE染色對(duì)小鼠心臟組織進(jìn)行病理學(xué)分析,與對(duì)照組相比,EAM組局部心肌纖維變性,見心肌纖維內(nèi)含大小不等的透亮空泡,胞核多偏于一側(cè);EAM+anti-PD1組心肌纖維變性壞死嚴(yán)重,壞死區(qū)域有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),伴有少量纖維組織增生;參芪治療組未見明顯病變,見Fig 2。

3.3 參芪扶正注射劑可以降低由抗PD-1抗體所致的免疫性心肌炎IL-1β、TNF-α的蛋白水平與對(duì)照組相比,EAM組IL-1β、TNF-α的蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05),表明心肌炎模型構(gòu)建成功;給予抗PD-1單克隆抗體處理后的EAM+anti-PD1組與EAM組相比,抗PD-1單抗會(huì)加重心肌炎誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)(P<0.05);參芪扶正注射劑治療組與EAM+anti-PD1組相比,參芪扶正注射劑降低了IL-1β、TNF-α的蛋白水平(P<0.05),提示參芪扶正注射劑可以預(yù)防由抗PD-1抗體加重的心肌損傷,見Fig 3。

為解決問(wèn)題，首先要將數(shù)據(jù)中心中的耗電負(fù)載進(jìn)行分類。根據(jù)PUE的定義，可分為IT負(fù)載、供配電設(shè)備、制冷設(shè)備、其他設(shè)施四大類，如表1所示：

Fig 1 Changes in cardiac indexes of PD-1 humanized mice treated with different

Fig 2 Cardiac histopathological changes in different groups of treated mice(HE staining)

Fig 3 Changes of protein levels of IL-1β and TNF-α in each group after Shenqi Fuzheng

3.4 參芪扶正注射劑可以降低由抗PD-1抗體所致的免疫性心肌炎Bax/BCL-2、Cleaved-caspase-3/caspase-3的蛋白水平與對(duì)照組相比,EAM組Bax/BCL-2、Cleaved-caspase-3/caspase-3的蛋白表達(dá)比值均明顯升高(P<0.05),表明心肌炎模型構(gòu)建成功;給予抗PD-1單克隆抗體處理后的EAM+anti-PD1組與EAM組相比,抗PD-1單抗會(huì)加重心肌炎誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.05);參芪扶正注射劑治療組與EAM+anti-PD1組相比,參芪扶正注射劑降低了Bax/BCL-2、Cleaved-caspase-3/caspase-3的蛋白水平(P<0.05),提示參芪扶正注射劑可以預(yù)防由抗PD-1抗體加重心肌損傷,見Fig 4。

3.5 參芪扶正注射劑降低由抗PD-1抗體所致的免疫性心肌炎IL-1β、TNF-α、Bax/BCL-2的mRNA水平與對(duì)照組相比,EAM組IL-1β、TNF-α、Bax/BCL-2的mRNA水平都明顯升高(P<0.05),進(jìn)一步驗(yàn)證心肌炎模型構(gòu)建成功;與EAM組相比,EAM+anti-PD1組三者的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05),提示心肌炎患者在使用抗PD-1單克隆抗體抗腫瘤時(shí),有增加心肌損傷的風(fēng)險(xiǎn);與EAM+anti-PD1組相比,參芪扶正注射劑治療后降低IL-1β、TNF-α、Bax/BCL-2的mRNA水平,提示參芪扶正注射劑可減輕心肌損傷,見Fig 5。

Fig 5 Changes of mRNA levels of IL-1β, TNF-α and Bax/BCL-2 in each group after Shenqi Fuzheng

3.6 血清中心肌損傷標(biāo)記物CK-MB、c-TNT水平心肌損傷標(biāo)志指標(biāo)包括CK-MB、cTNT等[11],與對(duì)照組小鼠相比,心肌炎模型組的CK-MB、cTNT水平上升(P<0.05),表明心肌炎建模成功;與肌炎模型組相比,EAM+anti-PD1組CK-MB、cTNT水平上升(P<0.05),暗示抗PD-1單抗會(huì)加重心肌炎損傷;再給予參芪扶正注射劑治療后,可以明顯降低CK-MB、cTNT水平,減輕由抗PD-1抗體加重的心肌損傷,見Fig 6。

Fig 6 Changes of CK-MB and cTNT levels between groups

4 討論

PD-1是一種主要在T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等細(xì)胞表面抗體的開發(fā)與利用為治療腫瘤提供了更加深入的研究方向,幫助腫瘤患者獲得強(qiáng)有力的療效,目前廣泛用于臨床治療。然而,隨著抗PD-1抗體的廣泛應(yīng)用,越來(lái)越多的不良反應(yīng)被報(bào)道,其中最為嚴(yán)重的就是心臟毒性[2]。關(guān)于抗PD-1抗體誘發(fā)心臟毒性的具體作用機(jī)制還未被研究清楚,有研究報(bào)道,抗PD-1抗體可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受下調(diào),T細(xì)胞被過(guò)度激活,刺激各種細(xì)胞炎癥因子[12],同時(shí)還可能識(shí)別心臟和腫瘤組織中的共同抗原[13],從而造成了心肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌纖維化等心肌損傷。因此,本實(shí)驗(yàn)主要是為了研究抗PD-1抗體是否會(huì)在PD-1小鼠心肌炎的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加重心肌損傷,驗(yàn)證參芪扶正注射劑是否可以改善由抗PD-1抗體造成的PD-1小鼠的免疫性心肌炎。

免疫性心肌炎會(huì)產(chǎn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織細(xì)胞中釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),從而導(dǎo)致心臟毒性,造成不可逆的損傷[14]。有報(bào)道稱,約有94%～97%的心肌炎患者伴有如CK-MB、cTNT等心肌損傷標(biāo)志物表達(dá)升高,心肌標(biāo)志物水平的變化成為檢測(cè)心肌炎的主要手段之一,心肌標(biāo)志物表達(dá)的升高程度反映了心肌損害的程度。本研究中心肌炎小鼠血清中CK-MB、cTNT水平升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而模擬抗PD-1抗體處理的CK-MB、cTNT水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05),表明心肌受到損害。給予參芪扶正注射劑治療后,CK-MB、cTNT水平均顯著降低,驗(yàn)證了我們關(guān)于參芪扶正注射劑可以預(yù)防抗PD-1抗體加重心肌炎損傷的猜想。

心肌炎損傷通常伴隨著病理改變,其中在心肌纖維化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)中研究較多,是許多心血管疾病的病理標(biāo)志。心肌纖維化具體表現(xiàn)為纖維化組織的區(qū)域性或彌漫性積聚[15],淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)是慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)的主要檢測(cè)指標(biāo)。本研究中,所有心臟組織心外膜結(jié)構(gòu)完整,對(duì)照組未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生;心肌炎組局部心肌纖維變性,表明心肌發(fā)生病變;心肌炎基礎(chǔ)上抗PD-1抗體處理后,心肌膜心肌纖維呈螺旋狀排列,局部心肌纖維變性壞死,部分淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),亦見少量纖維組織增生,主要以纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為主,說(shuō)明抗PD-1抗體可能會(huì)加重心肌病變;而給予參芪扶正注射劑治療后,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌纖維化的情況明顯改善,進(jìn)一步驗(yàn)證了參芪扶正注射劑可以改善心肌損傷。

細(xì)胞炎癥伴隨著IL-1β、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá),免疫性心肌炎的發(fā)生會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量的TNF-α、IL-1β。本實(shí)驗(yàn)中,心肌炎小鼠中的IL-1β、TNF-α與對(duì)照組相比均顯著升高(P<0.05),說(shuō)明使用短肽的乳化劑成功構(gòu)建了PD-1小鼠心肌炎模型。在炎癥因子的蛋白以及mRNA表達(dá)水平上,抗PD-1抗體的使用會(huì)加重炎癥反應(yīng),說(shuō)明心肌炎患者使用抗PD-1抗體治療腫瘤時(shí)在一定程度上可能會(huì)加重心肌損傷。給予參芪扶正注射劑治療后,IL-1β、TNF-α蛋白以及mRNA水平均下降,進(jìn)一步說(shuō)明使用參芪扶正注射劑可以預(yù)防抗PD-1單抗加重的心肌炎癥反應(yīng)。

此外,在心肌炎過(guò)程中伴隨著一定的心肌細(xì)胞死亡,包含:細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞程序性壞死。其中以Bax/BCL-2比值以及Cleaved-caspase-3/caspase-3的比值作為兩大最常見的細(xì)胞凋亡指標(biāo)。Bax/BCL-2比值決定著細(xì)胞凋亡的走向,caspase-3是凋亡過(guò)程中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,Bax和BCL-2可作為caspase-3的上游調(diào)控靶點(diǎn),caspase-3經(jīng)剪切后形成活化的Cleaved-caspase-3,執(zhí)行自身免疫性心肌炎誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程。使用兩種比值,可以檢測(cè)出心肌炎以及抗PD-1抗體誘導(dǎo)的凋亡水平變化,明確參芪扶正注射劑預(yù)防炎癥因子產(chǎn)生的同時(shí)也能預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡。

心肌炎的發(fā)生伴隨著炎癥反應(yīng)以及部分心肌細(xì)胞的凋亡,我們的研究證明了參芪扶正注射劑可以預(yù)防此類現(xiàn)象的發(fā)生,但關(guān)于參芪扶正注射劑如何減少炎癥和凋亡的具體機(jī)制還未得到明確。未來(lái)我們會(huì)繼續(xù)就參芪扶正注射劑改善心肌炎的具體作用機(jī)制展開研究,目前我們推斷參芪扶正注射劑改善炎癥損傷可能是通過(guò)巨噬細(xì)胞的調(diào)控。參芪扶正注射劑內(nèi)的主要材料為黨參和黃芪,黨參內(nèi)含生物堿、皂苷和多糖,可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化[16]。巨噬細(xì)胞是防御病原體入侵宿主以及抑制腫瘤生長(zhǎng)的重要免疫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞不僅可以對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行吞噬減少炎癥的發(fā)生,還可以在吞噬過(guò)程中和凋亡細(xì)胞/凋亡細(xì)胞代謝物直接作用從而獲取抗炎作用[17]。黃芪可以誘導(dǎo)干擾素的生成,有研究表明在免疫性疾病慢性肉芽腫性疾病(chronic granulomatous disease)中,巨噬細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的能力下降,而II型干擾素(IFN-γ)以NO依賴性的方式逆轉(zhuǎn)了這種現(xiàn)象的發(fā)生[18]。以上研究提示,參芪扶正注射劑改善心肌損傷可能是通過(guò)巨噬細(xì)胞來(lái)達(dá)到抗凋亡、抗炎癥作用,并還可能涉及IFN-γ改善巨噬細(xì)胞吞噬能力。但關(guān)于參芪扶正注射劑是誘導(dǎo)Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型干擾素參與調(diào)控過(guò)程,或是通過(guò)直接調(diào)控巨噬細(xì)胞參與調(diào)控還未可知,這也為我們未來(lái)的研究提供了一定的研究基礎(chǔ)。

目前,關(guān)于抗PD-1抗體引起的免疫不良反應(yīng),專家普遍建議為停用,以免造成更加嚴(yán)重的心臟毒性[6]。但在某種特定情況下必須使用時(shí),絕大多數(shù)抗PD-1抗體誘發(fā)的相關(guān)免疫性心肌炎一般都會(huì)加以糖皮質(zhì)激素治療心力衰竭、心肌重構(gòu)等心肌損傷,如口服強(qiáng)的松或靜脈使用甲基強(qiáng)的松龍[6]。然而,這種預(yù)后手段又會(huì)誘導(dǎo)一些其他的機(jī)體副作用,如高血壓、心肌肥厚等。因此,本研究中使用的參芪扶正注射劑,不僅可以降低了心肌損傷以及抗PD-1抗體造成的心臟毒性,而且根據(jù)我們對(duì)心肌肥厚初步指標(biāo)的結(jié)果分析,參芪扶正注射劑治療不會(huì)造成心肌肥厚。本研究為治療抗PD-1抗體造成的心臟毒性提供了一種新的治療方案,為治療ICI誘發(fā)心臟毒性提供了新的研究方向,對(duì)于其發(fā)病機(jī)制的研究、治療藥物的篩選以及參芪扶正注射劑治療免疫相關(guān)不良反應(yīng)提供初步的參考數(shù)據(jù)。

綜上所述,本研究探討了參芪扶正注射劑作為一種治療藥物改善了抗PD-1抗體誘發(fā)的心臟毒性。在心肌炎基礎(chǔ)上使用抗PD-1抗體會(huì)加重心肌損傷,而參芪扶正注射劑逆轉(zhuǎn)了這種心肌損傷,為防治抗PD-1抗體誘發(fā)心臟免疫性不良反應(yīng)提供新的治療策略。