丹參總酚酸聯(lián)合anti-PD-L1調(diào)控髓源性巨噬細胞浸潤抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展

宋夢瑤,錢 程,陸 茵,2

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室,2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023)

作為威脅全球女性生命健康的頭號殺手,乳腺癌的治療一直成為臨床長久未解決的問題。免疫療法的出現(xiàn)為癌癥治療帶來了新的曙光,然而多年臨床治療結(jié)果顯示,腫瘤在發(fā)展過程中會出現(xiàn)多種免疫逃避機制,某些癌癥類型天生就比其他類型的癌癥更善于“隱藏”。隨著對腫瘤免疫監(jiān)視的深入了解,部分類型癌癥,如黑色素瘤、膀胱癌和腎細胞癌,已被證明對免疫治療干預(yù)有持久的反應(yīng),然而,乳腺癌并未顯示出相同的治療效果。乳腺癌被認(rèn)為是一種免疫沉默的腫瘤,原因來自于較弱的免疫識別能力和強烈的免疫抑制機制[1-2]。

免疫細胞具有重要的輔助功能,并影響乳腺癌患者的術(shù)后康復(fù),高免疫浸潤對乳腺癌的治療與恢復(fù)表現(xiàn)出強烈的相關(guān)性,免疫細胞浸潤程度可有效評估乳腺癌的預(yù)后與化療效果[3]。乳腺癌自身低免疫原性、T細胞浸潤低以及腫瘤微環(huán)境中免疫檢查點的表達已被確定為乳腺癌逃避免疫治療的潛在機制與挑戰(zhàn)[4]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophages,TAMs)和腫瘤浸潤樹突狀細胞(tumor infiltrating dendritic cells,TIDCs)可以促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[5],而高CD8+T細胞浸潤在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)患者中展現(xiàn)出更高的存活率[6]。因此,免疫療法仍然是一種很有前途的乳腺癌治療策略。

大量臨床及臨床前證據(jù)表明,乳腺癌處于免疫監(jiān)視之下,免疫系統(tǒng)和乳腺癌之間復(fù)雜的相互作用研究仍處于起步階段?；诿庖攮h(huán)境的復(fù)雜性,單一療法可能并不能提供最有效的治療方式,目前面臨的挑戰(zhàn)是不斷尋找針對乳腺癌產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)的策略和方法。早期臨床使用抗血管生成藥、化療等方式與免疫抑制劑聯(lián)合治療,近幾年針對改變免疫微環(huán)境,如減少巨噬細胞瘤內(nèi)趨化與恢復(fù)其殺傷、吞噬功能的治療方式陸續(xù)出現(xiàn),并進入臨床[1]。因此,從改變巨噬細胞數(shù)量及功能入手,中醫(yī)藥中活血化瘀法也存在相似的功效。中藥丹參及其各活性成分治療乳腺癌的研究層出不窮,現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)丹參對乳腺癌有治療作用[7]。丹參總酚酸(total salvianolic acid,TSA)如丹酚酸B、迷迭香酸、丹酚酸A等可有效抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移[8-10],然而其對免疫微環(huán)境的研究仍較為匱乏,本文通過構(gòu)建惡性程度較高、免疫反應(yīng)較低的E0771乳腺癌小鼠模型,考察TSA增強anti-PD-L1的作用方式,為臨床合理使用TSA治療癌癥提供參考價值。

1 材料

1.1 細胞株鼠源乳腺癌細胞株E0771細胞由江蘇省藥效與安全評價重點實驗室提供,并傳代培養(yǎng)。

1.2 動物6周齡SPF級雌性C57BL/6 J小鼠25只,體質(zhì)量(20±2) g,購買自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,實驗動物生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2017-0005,實驗過程中所有操作均符合實驗動物倫理委員會規(guī)定,動物倫理號:202109A016。常規(guī)飼養(yǎng):自由飲食飲水,溫度(23±2) ℃,相對濕度53%±2%,12 h黑暗光照周期,適用性飼養(yǎng)1周。

1.3藥物 丹參飲片購自江蘇省中醫(yī)院。

1.4 試劑DMEM培養(yǎng)基(Gibco,31800-022),FBS(Cellmax,SA301.02),一次性無菌注射器(上海米沙瓦醫(yī)科,20180202),異氟烷(瑞沃德,R510-22-10),anti-PD-L1單抗(BioXCell,BE0101),IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(Biolegend,431304),MCP-1酶聯(lián)免疫試劑盒(Biolegend,432704),CD45-PerCP/Cyanine5.5(Biolegend,103132),CD11b-APC(Biolegend,101211),F4/80-PE/Cyanine7(Biolegend,123113),CD8-PE(Biolegend,100708),CD4-APC(Biolegend,100412),F4/80(proteintech,KHC0208),鼠兔通用二步免疫組化檢測試劑盒(中杉金橋,PV-9000),DAB顯色試劑盒(中杉金橋,ZLI-9018),Hiscript RT Super Mix for qPCR(Vazyme,R323-01),ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,Q331-02)。

1.5 儀器CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific,Forma 3111),流式細胞儀(美國BD,FACSCalibur),酶標(biāo)儀(美國Bio-tek,Synergy2),游標(biāo)卡尺(斑馬器材,Hc0494),分析天平(Sartorius,BSA224S-CW)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)E0771細胞使用10 % FBS+DMEM培養(yǎng)基,置于含5 % CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng),平均1～2 d傳代1次。

2.2 TSA的制備丹參采用唇形科鼠尾草屬植物丹參SalviamiltiorrhizaBudge.的干燥根及根莖飲片。TSA制備過程如下:使用天平稱取丹參飲片500 g置于圓底燒瓶內(nèi),加入1.5 L雙蒸水,80 ℃加熱提取2次,每次提取2 h。合并提取液紗布過濾,濃縮至清膏,放冷,加入乙醇至含醇量為70%,靜置12 h,取上清,減壓回收乙醇并濃縮至稠膏,冷凍干燥,稱質(zhì)量共得132.017 0 g凍干粉,計算得率為26.034%。

2.3 E0771腫瘤模型的建立取對數(shù)生長期E0771細胞制備成單細胞懸液密度為5×106個/mL。對20只小鼠異氟烷麻醉后,每只左側(cè)腋下淋巴結(jié)附近注射0.1 mL細胞懸液。

2.4 分組與給藥5 d后造模小鼠均長出手指可觸的皮下腫瘤。將25只小鼠隨機分為空白組、模型組、TSA組、anti-PD-L1組、TSA+anti-PD-L1組,每組5只?？瞻捉M、模型組小鼠每日給予雙蒸水灌胃;TSA組小鼠每日灌胃給藥10 g·kg-1TSA;anti-PD-L1組小鼠每3天腹腔注射給藥10 mg·kg-1anti-PD-L1;TSA+anti-PD-L1聯(lián)合組每日灌胃給藥10 g·kg-1TSA,且每3天腹腔注射10 mg·kg-1anti-PD-L1,連續(xù)給藥14 d。

2.5 腫瘤重量及體積測量小鼠最后一次給藥結(jié)束后,分析天平稱量并記錄腫瘤質(zhì)量。每4天使用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤大小并記錄。腫瘤體積計算公式:腫瘤體積=a×b2/2,“a”為最大寬度,“b”為最小寬度。

2.6 臟器指數(shù)計算分析天平稱取記錄小鼠脾臟、肝臟重量,根據(jù)公式對每只小鼠臟器指數(shù)進行計算。臟器指數(shù)=臟器(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。

2.7 ELISA檢測血漿IL-6、MCP-1含量按照ELISA檢測試劑盒說明進行操作如下:黏附96孔板每孔中加入100 μL稀釋后的捕獲抗體,4 ℃孵育過夜。8 h后棄掉板內(nèi)溶液,每孔加入300 μL 洗滌液拍洗4遍,每孔加入200 μL檢測稀釋液,500 r·min-1室溫振搖1 h。棄板內(nèi)溶液,洗板×4。按照預(yù)先布板分別加入100 μL梯度稀釋后的標(biāo)品和血漿樣品,振搖2 h。棄板內(nèi)溶液,洗板×4,每孔加入100 μL檢測抗體,500 r·min-1室溫振搖1 h。棄板內(nèi)溶液,洗板×4,每孔加入100 μL標(biāo)記親和素(horseradish peroxidase,HRP),室溫振搖30 min。棄板內(nèi)溶液,洗板×5,室溫避光孵育15 min,每孔加入100 μL終止液,450 nm處檢測吸光度。

2.8 流式細胞術(shù)取小鼠脾臟組織、腫瘤接種側(cè)腋下淋巴(引流淋巴結(jié))及腫瘤組織進行檢測。脾臟、淋巴:使用1×PBS研磨過70目篩網(wǎng),收集上述細胞懸液,4 ℃,1 500 r·min-1離心10 min,棄上清。每管加入2 mL紅細胞裂解液,避光室溫裂解5 min后離心,1×PBS洗滌,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入8 mL 1×PBS重懸,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入對應(yīng)抗體,4 ℃避光孵育40 min,1 000 r·min-1離心5 min,100 μL 1×PBS重懸,上機檢測。

腫瘤組織:取各組乳腺癌腫瘤組織1 cm3,剪碎后轉(zhuǎn)移至15 mL EP管,加入5 mL腫瘤組織消化液進行消化,37 ℃搖床振搖40 min,每間隔10 min吹打一次。隨后加入等體積預(yù)冷的完全培養(yǎng)基終止消化。過70目篩網(wǎng)后1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,10 mL FACS-EDTA洗滌,1 000 r·min-1離心5 min,FACS-EDTA重懸,離心,加入對應(yīng)抗體,4 ℃避光孵育40 min,離心5 min,100 μL 1×PBS重懸,上機檢測。

2.9 免疫組化切取4 μm厚石蠟切片,75 ℃烤片5 h。二甲苯-無水乙醇-95 %乙醇-80 %乙醇-75 %乙醇-30 %乙醇依次復(fù)水,1×PBS洗滌3 min×3,抗原修復(fù),洗滌,內(nèi)源性過氧化物酶清除10 min,洗滌,3% BSA封閉1 h,洗滌,一抗4 ℃孵育過夜,洗滌,按照試劑盒說明,分別滴加試劑2、試劑3,洗滌,滴加DAB顯色,流水沖洗5 min,蘇木精染色2 min,鹽酸分化20 s,流水沖洗5 min。30 %乙醇-50 %乙醇-75 %乙醇-80 %乙醇-95 %乙醇-無水乙醇-甲苯依次脫水,中性樹脂封片固定,顯微鏡下拍照。

2.10 qPCR稱取80 mg腫瘤組織加入研磨EP管,1 mL TRIzol裂解至組織消失。取勻漿每管加入200 μL氯仿,劇烈振搖15 s,室溫靜置3 min,12 000 r·min-1,4 ℃,離心15 min。吸取上層水相加入等量異丙醇,來回顛倒,室溫靜置3 min,12 000 r·min-1,4 ℃,離心15 min。棄上清,1 mL 75 %乙醇洗滌,7 500 r·min-1,4 ℃,離心10 min。棄上清,置于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥至透明。加入30 μL DEPC水溶解RNA,55 ℃孵育10 min。Nano DropTMOne /One C檢測RNA濃度及純度,將樣本稀釋為500 g·L-1。按試劑盒說明逆轉(zhuǎn)成cDNA,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見Tab 1,點板,上機。

Tab 1 Primer sequence

3 結(jié)果

3.1 TSA聯(lián)合anti-PD-L1顯著降低乳腺癌小鼠腫瘤重量與模型組相比,TSA組、anti-PD-L1組、TSA+anti-PD-L1組小鼠乳腺癌腫瘤重量均明顯下降(P<0.01)。與單獨使用anti-PD-L1組相比,TSA+ anti-PD-L1組效果更佳顯著(P<0.05),見Tab 2。

Tab 2 Effect of TSA+anti-PD-L1 on weight of E0771 subcutaneous tumor in each group (n=5)

3.2 TSA聯(lián)合anti-PD-L1減緩小鼠腫瘤體積增長如Fig 1所示,接種E0771乳腺癌細胞后,腫瘤體積增長數(shù)據(jù)顯示,與模型組相比,TSA組、anti-PD-L1組均可有效抑制腫瘤增長(P<0.01),而TSA+anti-PD-L1組抑制腫瘤生長進程更加顯著,與單獨使用anti-PD-L1相比,TSA+ anti-PD-L1組抑制腫瘤增長過程明顯(P<0.05)。

Fig 1 The tumor volume growth in each group(n=5)

3.3 TSA聯(lián)合anti-PD-L1對乳腺癌小鼠脾臟、肝臟臟器指數(shù)的影響與正常小鼠相比,模型組小鼠脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.01),病理表現(xiàn)為脾臟腫大。與模型組、anti-PD-L1組相比,TSA聯(lián)合anti-PD-L1能有效降低小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01),TSA組、anti-PD-L1組小鼠脾臟指數(shù)改變差異無顯著性。同時,無論是模型組還是TSA組、anti-PD-L1組,小鼠肝臟指數(shù)均未見影響,見Tab 3。

Tab 3 Spleen and liver organ index of mice in each group (n=5)

3.4 TSA聯(lián)合anti-PD-L1減少小鼠血清IL-6,MCP-1分泌與空白組相比,模型組小鼠血清內(nèi)IL-6,MCP-1分泌含量明顯增加(P<0.01)。與模型組相比,TSA組、anti-PD-L1組及TSA+anti-PD-L1組給藥后可明顯減少小鼠血清內(nèi)IL-6,MCP-1含量(P<0.01),且TSA+anti-PD-L1組較anti-PD-L1組效果顯著(P<0.05),見Tab 4。

Tab 4 Effect of TSA+anti-PD-L1 on IL-6, MCP-1 secretion in serum in each group (n=5)

3.5 TSA聯(lián)合anti-PD-L1減少小鼠腫瘤組織內(nèi)巨噬細胞相關(guān)趨化因子mRNA表達與模型組相比,TSA組、anti-PD-L1組及TSA+anti-PD-L1組均可降低小鼠腫瘤組織內(nèi)與巨噬細胞趨化相關(guān)因子cxcl1,cxcl2,cxcl3,ccl2,gm-csfmRNA的表達,且TSA與anti-PD-L1聯(lián)合給藥較anti-PD-L1單獨給藥相比cxcl2,cxcl3,ccl2表達水平下降顯著,見Fig 2。

3.6 TSA聯(lián)合anti-PD-L1對小鼠淋巴及脾臟內(nèi)CD4+,CD8+T細胞數(shù)量的影響通過流式檢測各組小鼠淋巴及脾臟內(nèi)CD4+T細胞、CD8+T細胞數(shù)量,如Fig 3所示,模型組小鼠淋巴內(nèi)CD4+T細胞、CD8+T細胞數(shù)量與空白對照組相比未見顯著差異,而TSA聯(lián)合anti-PD-L1可增加CD4+T(P<0.01)與CD8+T細胞(P<0.05)在淋巴內(nèi)的數(shù)量。TSA與anti-PD-L1聯(lián)合給藥較anti-PD-L1單獨給藥相比效果更佳明顯(P<0.05)。在脾臟流式檢測結(jié)果中,與空白組相比,模型組小鼠CD4+T細胞數(shù)量明顯降低(P<0.01),TSA+anti-PD-L1聯(lián)合使用有效恢復(fù)小鼠脾臟內(nèi)CD4+T細胞數(shù)量(P<0.05),同時使小鼠CD8+T細胞增加(P<0.05)。

Fig 2 Expression of cxcl1, cxcl2, cxcl3, ccl2, gm-csf in each group by qPCR (n=4)

3.7 TSA聯(lián)合anti-PD-L1抑制乳腺癌小鼠腫瘤、淋巴內(nèi)巨噬細胞浸潤如Fig 4所示,流式結(jié)果顯示TSA、anti-PD-L1、TSA+anti-PD-L1聯(lián)合給藥組均可一定程度上降低腫瘤組織內(nèi)髓源性巨噬細胞(CD11b+F4/80+)的浸潤,其中與模型組(P<0.01)、anti-PD-L1組(P<0.05)相比,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合給藥后抑制小鼠髓源性巨噬細胞浸潤效果顯著,免疫組化顯示相似的結(jié)果(Fig 5)。同時,對小鼠淋巴內(nèi)髓源性巨噬細胞浸潤情況進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示TSA可減少淋巴內(nèi)髓源性巨噬細胞數(shù)量(P<0.05),TSA+anti-PD-L1聯(lián)合組小鼠淋巴內(nèi)髓源性巨噬細胞數(shù)量顯著降低(P<0.01),見Fig 6。

4 討論

乳腺癌免疫療法面臨的最大障礙是如何將非免疫原性腫瘤轉(zhuǎn)化為高免疫原性腫瘤,進而產(chǎn)生臨床治療反應(yīng)[11]。腫瘤特異性T細胞上表達抑制性受體,例如PD-1和CTLA-4,會抑制其增殖及殺傷性細胞因子的分泌功能。使用靶向CTLA-4(ipilimumab)和PD-1/PD-L1(nivolumab/pembrolizumab)的單克隆抗體進行免疫檢查點阻斷已被證明可有效治療多種惡性腫瘤。其中,抗PD-1/PD-L1抗體在黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌和其他腫瘤的治療中顯示出巨大前景[12-13]。臨床單獨使用PD-1/PD-L1抗體在治療乳腺癌療效不顯著的情況下,單抗與各類治療方式如抗血管生成藥、化療聯(lián)合使用展現(xiàn)出一定的作用[12-13]。本研究通過構(gòu)建C57BL/6J小鼠E0771乳腺癌皮下瘤模型,發(fā)現(xiàn)TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用后腫瘤體積增長趨勢顯著減緩,同模型組相比,有效抑制E0771乳腺癌小鼠腫瘤發(fā)展進程,同時緩解了小鼠脾臟腫大現(xiàn)象。

Fig 3 Number of CD4+ T cells and CD8+ T cells in lymph and spleen in each group by flow cytometry (n=4)

Fig 4 Infiltration of myeloid macrophage in tumor of mice in each group by flow cytometry (n=4)

Fig 5 The positive expression of F4/80 in each group by IHC (×200) (n=5)

Fig 6 Infiltration of myeloid macrophage in lymph of mice in each group by flow cytometry (n=3)

進一步考察TSA聯(lián)合anti-PD-L1的具體作用方式,ELISA結(jié)果顯示TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用后,IL-6、MCP-1炎性細胞因子分泌減少,提示炎性環(huán)境的改變及其潛在機制有待探索。腫瘤微環(huán)境中細胞因子的改變與免疫細胞的極化狀態(tài)、瘤內(nèi)募集和免疫排斥反應(yīng)相關(guān)[14]。qPCR結(jié)果顯示,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用可顯著降低cxcl1,cxcl2,cxcl3,ccl2,gm-csfmRNA的表達,這些炎性因子與巨噬細胞趨化呈高度相關(guān)。腫瘤來源的IL-10和巨噬細胞集落刺激因子被證明通過抑制樹突狀細胞成熟而損害其抗原呈遞能力,導(dǎo)致其功能障礙[15]。骨髓亞群包括TAMs、單核細胞和粒細胞,構(gòu)成了免疫微環(huán)境的異質(zhì)成分,具有很強的免疫抑制潛力。研究表明,骨髓抑制細胞產(chǎn)生的瘤內(nèi)活性物質(zhì)能夠誘導(dǎo)CCL2趨化因子硝化并阻礙T細胞遷移和浸潤[16]。本文研究中,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用促使脾臟和淋巴內(nèi)CD4+T細胞、CD8+T細胞數(shù)量增多?；诖?TSA通過調(diào)控免疫微環(huán)境的改變發(fā)揮治療作用也是中醫(yī)藥治療疾病整體觀念的體現(xiàn)。同時,TSA降低腫瘤免疫微環(huán)境炎癥因子的釋放,減少髓源性巨噬細胞在乳腺癌中的數(shù)量,淋巴內(nèi)髓源性巨噬細胞數(shù)目同樣降低。研究表明,除腫瘤細胞外,在腫瘤微環(huán)境內(nèi)巨噬細胞和髓源性抑制細胞上PD-L1的表達,即宿主自身的免疫原性才是PD-1/PD-L1免疫治療發(fā)揮作用的關(guān)鍵[17]。因此,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用后,可有效抑制瘤內(nèi)髓源性巨噬細胞的數(shù)量和PD-L1介導(dǎo)的免疫逃逸作用。針對部分臨床患者對于anti-PD-L1反應(yīng)不敏感問題,除與傳統(tǒng)化療、抗血管療法聯(lián)合使用外,以TAMs趨化及功能恢復(fù)為目標(biāo)的治療方式逐漸成為聯(lián)合anti-PD-L1治療的新思路?；钛鏊幵谥嗅t(yī)藥治療癌癥時維持較高使用頻率,然而,研究發(fā)現(xiàn),活血化瘀療法對癌癥的治療并不在于其極高的殺傷活性,而是通過作用于腫瘤內(nèi)部環(huán)境,如促使血管正常化、抑制血栓形成、改變免疫細胞浸潤等方式。本研究通過實驗證明,TSA可通過改變腫瘤免疫微環(huán)境,聯(lián)合anti-PD-L1對E0771乳腺癌進行治療,為臨床應(yīng)用丹參治療癌癥提供部分科學(xué)依據(jù)。

綜上,本研究表明,TSA與anti-PD-L1聯(lián)合使用可有效減緩E0771乳腺癌小鼠的腫瘤生長進程,減少IL-6,MCP-1炎性因子的釋放,巨噬細胞趨化相關(guān)因子cxcl1,cxcl2,cxcl3,ccl2,gm-csf的表達,進而抑制髓源性巨噬細胞向腫瘤組織浸潤,通過增加脾臟、淋巴結(jié)內(nèi)CD4+T細胞,CD8+T細胞數(shù)量恢復(fù)小鼠免疫微環(huán)境。針對腫瘤免疫微環(huán)境的治療方式的提出,為中醫(yī)藥治療乳腺癌提供了潛在的可能性。