響應(yīng)面法優(yōu)化貝萊斯芽胞桿菌YC11的液體發(fā)酵培養(yǎng)基

劉 芳，黎妍妍，陳 偉，曹春霞，溫少華，饒 犇*，黃大野*

（1.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

煙草黑脛病又稱煙草疫病，又稱為黑根、黑稈瘋、烏頭病[1]。是由煙草疫霉Phytophthoraparasiticavar.nicotianae引起的一種廣泛分布、毀滅性危害煙草的土傳性真菌病害[2]。在中國已報(bào)道的煙草60 余種侵染性病害中，煙草黑脛病是中國煙草生產(chǎn)中危害嚴(yán)重的病害之一，每年因煙草黑脛病造成的產(chǎn)值損失多達(dá)1.23 億元，僅次于煙草病毒病[3]。目前該病害的防治主要依靠化學(xué)殺菌劑，防治黑脛病當(dāng)前使用較多的內(nèi)吸性藥劑主要有甲霜靈、烯酰嗎啉、惡唑菌酮、惡霜靈等[4]。化學(xué)農(nóng)藥大量使用造成環(huán)境污染、生態(tài)平衡破壞以及病原菌對化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗藥性[5-7]。生物防治具有相對安全、長效且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，因此，開發(fā)環(huán)境友好型高效生防菌劑對煙草重要土傳性病害進(jìn)行生物防治，促進(jìn)煙葉綠色生產(chǎn)具有重大意義[8]。

不同微生物有不同營養(yǎng)需求，進(jìn)行微生物工業(yè)化大生產(chǎn)之前，需對其發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行小試優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法，包括單因素試驗(yàn)[9,10]、正交設(shè)計(jì)[11-16]、均勻設(shè)計(jì)[17]、Plackett-Burman 設(shè)計(jì)[16-21]、Box-Behnken 設(shè)計(jì)[19,21]及中心組合設(shè)計(jì)[16,18,20,22]等，都可用在不同微生物發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化中，而利用Plackett-Burman 設(shè)計(jì)、Box-Behnken 設(shè)計(jì)或中心組合設(shè)計(jì)，再結(jié)合響應(yīng)面分析能夠快速有效地確定其最佳培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件。

本實(shí)驗(yàn)室從煙草根際土壤中分離到1 株貝萊斯芽胞桿菌BacillusvelezensisYC11，該菌株室內(nèi)生測結(jié)果表明對煙草黑脛病具有良好防效，具有一定的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品開發(fā)價(jià)值。本文以貝萊斯芽胞桿菌YC11為研究對象，對其產(chǎn)胞發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶配方進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)，篩選出顯著影響因子，然后結(jié)合最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken（BB）響應(yīng)面法擬合顯著因子與芽胞產(chǎn)量的非線性方程求解，優(yōu)化得到菌株最佳發(fā)酵產(chǎn)胞培養(yǎng)基搖瓶配方，并在500 L 罐中進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，為該菌株的擴(kuò)大生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)化提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

貝萊斯芽胞桿菌YC11 由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心自主分離獲得，并保存于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M20211651。

1.2 供試培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基配方如下：（1）LB 瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，氯化鈉 5 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，pH 值7.0；（2）種子液培養(yǎng)基：不加瓊脂的LB 液體培養(yǎng)基；（3）初始發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉15 g，豆粕20 g，硫酸鎂0.3 g，磷酸二氫鉀0.1 g，超純水1 L，pH 值7.5，500 mL 三角瓶裝液量為50 mL[18]；（4）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：按下文中PB、最陡爬坡、BB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求配制，pH 值7.5，500 mL三角瓶裝液量為50 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 搖瓶培養(yǎng) 斜面菌種YC11 30 ℃活化后，接種一環(huán)入裝有100 mL LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶（500 mL）中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)16 h，作為搖瓶發(fā)酵的種子液。種子液按1%（v/v）接種量接至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)至芽胞脫落20%時(shí)即發(fā)酵結(jié)束[18]。

1.3.2 發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量的測定 發(fā)酵稀釋液于80 ℃水浴20 min 殺死其中的營養(yǎng)體，再利用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法測定[18]。

1.3.3 Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì) 以玉米粉為碳源，以魚粉、酵母粉和玉米漿為氮源，硫酸鎂及磷酸二氫鉀為無機(jī)鹽，共6 種營養(yǎng)因素（A：玉米粉，B：魚粉，C：酵母粉，D：玉米漿，E：硫酸鎂，F(xiàn)：磷酸二氫鉀）進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，6 因子2 水平的PB 試驗(yàn)因素水平表以及試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 和表3所示，篩選影響菌株發(fā)酵芽胞產(chǎn)量的顯著影響因子。

表1 PB 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and Levels of Plackett-Burman experiment

1.3.4 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB 試驗(yàn)所擬合方程的計(jì)算結(jié)果，以各顯著因子為中心起點(diǎn)，確定最陡爬坡試驗(yàn)的方向與步長，通過爬坡試驗(yàn)來快速逼近中心點(diǎn)[23]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表5。

1.3.5 Box-Behnken（BB）設(shè)計(jì) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)3 因素3 水平的BB 實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)置低、中、高3 水平，分別以“-1”、“0”、“+1”代表[23]，以菌株發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量為響應(yīng)值Y，應(yīng)用Minitab19軟件擬合二次函數(shù)方程，根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型以及方差分析的結(jié)果，分析單獨(dú)因子及因子之間交互作用對響應(yīng)值Y 的影響，繪制響應(yīng)面分析曲面圖和等值線圖直觀地描繪其結(jié)果，同時(shí)利用擬合二次函數(shù)方程解析出最優(yōu)結(jié)果，因素水平及試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2 和表6。

We got home at midnight.By that time everyone else was in bed.

表2 BB 試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and level design of Box-Behnken experiment

1.3.6 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn) 優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方按比例配制培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，設(shè)3 個(gè)平行重復(fù)，溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至芽胞脫落20%。發(fā)酵結(jié)束后按1.3.2 方法，測定發(fā)酵液的芽胞產(chǎn)量。

1.3.7 500 L 發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證 斜面菌種30 ℃活化后，分別接種一環(huán)入30 瓶LB 液體培養(yǎng)基中，溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 條件下培養(yǎng)16 h 后合瓶，作為發(fā)酵罐的種子備用。按優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方稱取培養(yǎng)基，60%投料體積計(jì)料，消泡劑300 mL，121 ℃～123 ℃，1×105Pa 條件下保溫保壓滅菌30min。待罐溫降至32 ℃時(shí)壓差法接入1%（v/v）的種子液，通氣比1：0.5～1.2，罐壓0.5×105Pa，培養(yǎng)溫度30 ℃～32 ℃，攪拌常開，發(fā)酵24 h 后每隔2 h 取樣鏡檢，以芽胞脫落分離20%時(shí)為發(fā)酵終點(diǎn)，停止發(fā)酵，測定發(fā)酵液的芽胞產(chǎn)量。

1.3.8 貝萊斯芽胞桿菌YC11 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)物對煙草黑脛病的防控效果 將煙草種子（云煙87）播種于裝有基質(zhì)（草炭:蛭石3:1）育苗缽中，待生長至5～6 葉期備用。取上述優(yōu)化后的發(fā)酵液，使用原液和稀釋5 倍發(fā)酵液進(jìn)行灌根，對照藥劑為50%烯酰嗎啉可濕性粉劑（巴斯夫歐洲公司），稀釋500 倍。灌根量均為20mL/株，對照灌清水。每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 株。24 h 后灌煙草疫霉孢子懸浮液（1×106孢子/mL），按照張潛等[24]方法制備孢子懸浮液。待對照充分發(fā)病統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，并計(jì)算防效。

煙草根莖病害分級標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥田間藥效實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則（二）GB/T 23222-2008》進(jìn)行。煙草黑脛病分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級，全株無?。? 級，莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3 以下葉片凋萎；3級，莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2，或1/3～/2 葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；5 級，莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2～2/3 葉片凋萎；7 級，莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3 以上葉片凋萎；9 級：病株基本枯死[25]。病情指數(shù)=∑（各級植株數(shù)×級別）/（調(diào)查總株數(shù)×最高代表級別）×100。防治效果（%）=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

上述PB 試驗(yàn)、BB 試驗(yàn)及響應(yīng)面分析均利用Minitab19 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析及繪圖。試驗(yàn)結(jié)果利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著差異法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果與方差分析如表3 和表4 所示，應(yīng)用Minitab19 軟件分析可以得到各營養(yǎng)因子與響應(yīng)值Y（發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量）的一次回歸方程為：Y=62.65－16.08A-5.65B+9.22C－1.72D+14.18E+2.68F；培養(yǎng)基成份中的玉米粉（A）、酵母粉（C）和硫酸鎂（E）為顯著影響因子，玉米粉（A）系數(shù)為負(fù)數(shù)，說明其與響應(yīng)值Y（發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量）負(fù)相關(guān)，酵母粉（C）和硫酸鎂（E）系數(shù)為正數(shù)，說明它們與響應(yīng)值Y（發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量）正相關(guān)，決定系數(shù)R2=0.9151，表明模型線性方程能夠解釋91.51%的原因，僅8.49%的變異不能由此模型解釋，校正決定系數(shù)Adj R2=0.8133，表明模型可解釋81.33%的變異。

表3 六因素PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The design and result of Plackett-Burman experiment with 6 factors

表4 PB 試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance and results of Plackett-Burman experiment

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果與分析

對PB 試驗(yàn)結(jié)果分析得到的玉米粉（A）、酵母粉（C）、硫酸鎂（E）三個(gè)顯著因子進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，選擇PB 設(shè)計(jì)中三個(gè)因素的中間水平，即玉米粉25.00 g/L、酵母粉10.00 g/L、硫酸鎂0.38 g/L 為初始起點(diǎn)，最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果見表5。響應(yīng)值Y（發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量）最高值出現(xiàn)在處理3，選擇處理3 的條件作為下一步Box-Behnken（BB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平的中心點(diǎn)，即玉米粉15.00 g/L、酵母粉15.00 g/L 和硫酸鎂0.62 g/L。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 5 Design of steepest ascent experiment

2.3 Box-Behnken (BB)試驗(yàn)結(jié)果與分析

BB 試驗(yàn)結(jié)果與方差分析如表6 和表7 所示，回歸模型P=0.004（＜0.01）顯著性較高，模型多元相關(guān)性系數(shù)R2=0.9646，說明只有3.54%的變異不能由此模型解釋，失擬項(xiàng)P值為 0.236（＞0.05）影響不顯著，說明模型不存在失擬現(xiàn)象。并且模型線性P值=0.004（＜0.01）影響顯著、平方的影響P值=0.002（＜0.01）影響顯著，雙因子之間交互作用P值為0.595（＞0.05）影響不顯著。以YC11 搖瓶發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量（Y）為因變量，玉米粉（A）、酵母粉（C）和硫酸鎂（E）添加濃度為自變量，應(yīng)用Minitab19 軟件擬合得到非線性回歸方程：Y=113.33-5.625A+1.675C-1.300E-10.77A2-2.87C2-1.92 E2-0.10AC-1.65 AE+0.35CE。

表6 3 因素BB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 The design and results of Box-Behnken experiment

表7 BB 試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 7 Analysis of variance of the results of Box-Behnken experiment

利用Minitab 19 軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面分析曲面圖和等值線圖（圖1）。由圖及軟件可直觀分析出此模型具有最大值，運(yùn)用Minitab 19 軟件響應(yīng)優(yōu)化器計(jì)算得到，各顯著營養(yǎng)因子在發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳濃度為：玉米粉13.74 g/L、酵母粉15.73 g/L 和硫酸鎂0.59 g/L，在此條件下理論預(yù)測YC11菌株的芽胞產(chǎn)量可達(dá)114.4×108cfu/mL。

圖1 芽胞桿菌YC11 芽胞產(chǎn)量與不同營養(yǎng)成份的響應(yīng)面優(yōu)化Fig.1 Response surface optimization of the spore production by YC11 strain with different nutrients

2.4 最優(yōu)培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

YC11 菌株在上述優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行了3 次重復(fù)搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證。發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量平均值為（116.6±2.1）×108cfu/mL，與預(yù)測值（114.4×108cfu/mL）相當(dāng)，較優(yōu)化前芽胞產(chǎn)量（70.8±3.1×108cfu/mL）提高了64.7%。

2.5 500 L 發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證

貝萊斯芽胞桿菌YC11 菌株在500 L 罐發(fā)酵驗(yàn)證中，發(fā)酵28 h 取樣涂片鏡檢，芽胞形成率為98%，菌體大小整齊。發(fā)酵38 h 取樣涂片鏡檢，約20%芽胞脫落，且芽胞整齊，未發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)體。28 與38 h 鏡檢圖片見圖2 和圖3。停止發(fā)酵，測得發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量為（150.2±3.9）×108cfu/mL，較搖瓶發(fā)酵提升了25%以上。

圖2 500 L 發(fā)酵罐28 h 培養(yǎng)物鏡檢Fig.2 Microscopic examination of fermentation culture of YC11 in 500-L fermenter 28 h after inoculation

圖3 500 L 發(fā)酵罐38 h 培養(yǎng)物鏡檢Fig.3 Microscopic examination of fermentation culture of YC11 in 500-L fermenter 38 h after inoculation

2.6 YC11 發(fā)酵液對煙草黑脛病防效

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，YC11 發(fā)酵液對煙草黑脛病具有良好的防控效果，能有效降低病情指數(shù)。YC11發(fā)酵原液和5 倍發(fā)酵稀釋液對煙草黑脛病防效分別為100%和84.06%，其中原液防效顯著高于對照藥劑烯酰嗎啉（表8）。

3 討論

通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成提高微生物菌株的發(fā)酵水平，是芽胞桿菌生防菌劑產(chǎn)業(yè)化開發(fā)中的一項(xiàng)重要工作。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)是優(yōu)化培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件及發(fā)酵參數(shù)等普遍采用的方法[18,20,22,26]。一般培養(yǎng)基的優(yōu)化多基于芽胞或活菌的產(chǎn)量[15,18]、發(fā)酵液的抑菌活性[14,19,22,26]或目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[20]進(jìn)行優(yōu)化。由于目前基于芽胞桿菌的生物殺菌劑多以芽胞數(shù)作為質(zhì)量控制指標(biāo)，因此，在開展本研究時(shí)，以發(fā)酵液芽胞產(chǎn)量作為考核指標(biāo)對搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

前人有關(guān)貝萊斯芽胞桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化的研究多集中于采用可溶性培養(yǎng)基成分。一株抗金銀花白粉病菌貝萊斯芽孢桿菌HC-8 更喜好蛋白胨、麥芽糖及酵母膏[11]，而抗煙草花葉病毒的貝萊斯芽胞桿菌Z5 菌株的最適碳源和氮源分別為葡萄糖和酵母膏[27]。而對煙草黑脛病菌具有拮抗活性的貝萊斯芽胞桿菌MC2-1菌株的最適培養(yǎng)基成分為牛肉浸膏、酵母浸粉及麥芽糖[13]。采用農(nóng)副產(chǎn)品，成本較低，易于獲得，易于后續(xù)的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。本文對從茶園分離的貝萊斯芽胞桿菌CY30 的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的結(jié)果表明，甘薯粉及酵母膏對其芽胞的形成影響最大[18]。本研究中，對YC11 菌株芽胞產(chǎn)量影響最為顯著的營養(yǎng)成分為玉米粉、酵母粉和硫酸鎂，說明即使是同一種芽胞桿菌的不同分離株的營養(yǎng)需求也存在差異。

不同的貝萊斯芽胞桿菌菌株產(chǎn)胞水平存在較大的差異。在本研究中，僅對YC11 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，使該菌株的芽胞產(chǎn)量達(dá)到了116.6 億芽胞/mL，而進(jìn)一步在500 L 發(fā)酵罐中驗(yàn)證，發(fā)酵水平達(dá)到了150 億芽胞/mL 以上。李姝江等[26]通過優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，使ZJ20 菌株在可溶性培養(yǎng)基的產(chǎn)芽胞水平達(dá)到了76.9 億芽胞/mL。而貝萊斯芽胞桿菌CY30 菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基中的產(chǎn)芽胞水平為97.5 億芽胞/mL[18]。由于不同研究者所用的菌株的研發(fā)目的不同，而且所選擇的培養(yǎng)基的成分也不相同，很難比較不同菌株之間的發(fā)酵水平及活性差異。但在多項(xiàng)以可溶性營養(yǎng)成分進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化的研究中，不同貝萊斯芽胞桿菌菌株的產(chǎn)芽胞水平相對較低[15,21,26]，是否與可溶性營養(yǎng)成分含量較低有關(guān)還需深入研究。