球毛殼菌促生防病機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展

馮超紅，李麗娟，張姣姣，王俊美，宋玉立，李好海，徐 飛*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2.河南省植物保護(hù)檢疫站，鄭州 450002）

由植物病原菌引起的病害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失的重要原因之一?；瘜W(xué)農(nóng)藥或肥料在植物病蟲害防治和安全高效生產(chǎn)方面起到了至關(guān)重要的作用，但長(zhǎng)期和大量使用化學(xué)農(nóng)藥或肥料對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了威脅。生物農(nóng)藥和生物肥料的產(chǎn)品研發(fā)為植物高效、安全和綠色生產(chǎn)提供了保障，已經(jīng)得到人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?。毛殼菌屬Chaetomium真菌是重要的植物病原菌生物防治菌之一，是腐生子囊菌中數(shù)量最大的類群之一，可以有效降解纖維素和有機(jī)物，對(duì)土壤中的其他微生物有拮抗作用[1]。該屬中研究較多的為球毛殼菌C.globosum、角毛殼菌C.cupreum和螺卷毛殼菌C.cochliodes。其中，球毛殼菌對(duì)多種植物病害具有生物防治效果，能夠分解利用植物纖維素，且產(chǎn)生很多具有生物活性的次生代謝物，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛能。以下將主要討論球毛殼菌對(duì)植物病害的生防作用研究及應(yīng)用概況。

1 球毛殼菌的形態(tài)學(xué)特征及分離來源

球毛殼菌屬于子囊菌門Ascomycota、糞殼菌綱Sordariomycetes、糞殼菌目Sordariales、毛殼菌科Chaetomiaceae、毛殼菌屬[2]。子囊殼為球形、卵形或倒卵形，頂端有孔口；具有交錯(cuò)絲組織的子囊殼壁；子囊殼上剛毛，沒有分支，呈不規(guī)則的、松散卷曲狀；子囊易消散，棍棒狀或略梭狀；子囊殼中含有子囊，每個(gè)子囊中含有8 個(gè)子囊孢子；子囊孢子呈褐色、檸檬狀，長(zhǎng)9～12 μm，寬8～10 μm，厚度為6～8 μm[3,4]。

球毛殼菌是常見的植物內(nèi)生真菌，也廣泛分布于空氣、土壤等多種自然環(huán)境中。自Martin 和Moore[5]在1954 年報(bào)道燕麥上分離到的球毛殼菌和螺卷毛殼菌對(duì)鐮孢菌屬Fusarium和小麥根腐病菌（麥根腐平臍蠕孢Bipolarissorokiniana）有很好的拮抗作用以來，國(guó)內(nèi)外研究者先后從毛白楊、白茅、美登木、油菜、魚腥草、銀杏、人參、側(cè)柏和棉花等多種植物中分離得到了球毛殼菌，并對(duì)多種病原菌有拮抗作用[6-14]。如從銀杏組織器官中分離篩選出16 株活性較強(qiáng)的內(nèi)生真菌，其中球毛殼菌No.05 對(duì)玉米大斑病菌Setosphaeriaturcica的抑制作用最強(qiáng)[11]；從健康毛白楊的內(nèi)生真菌中分離出球毛殼ND35 菌株，對(duì)多種病原菌表現(xiàn)拮抗作用，如污黑腐皮殼菌即楊樹腐爛病菌Valsasordida、蘋果樹腐爛病菌V.mali和立枯絲核菌Rhizoctoniasolani等[6]；從油菜幼苗中分離篩選出具有抑菌活性的球毛殼菌YY-11，在室內(nèi)平板上對(duì)油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum、立枯絲核菌R.solani、油菜灰霉病菌Botrytiscinerea和小麥赤霉病菌（禾谷鐮孢F.graminearum）等有不同程度的抑制作用[9]；從棉花、魚腥草和林下參中分離的球毛殼菌CEF-082、28 號(hào)和FS-01 等對(duì)棉花黃萎病菌Verticilliumdahliae、馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani、辣椒疫霉病菌Phytophthoracapsici、西瓜枯萎病菌F.oxysporum和人參黑斑病菌A.panax等有很好的抑制作用[10,14,15]。除了抗菌活性，球毛殼菌還具有抗線蟲、抗癌和抗氧化作用，例如從黃瓜幼苗中分離到球毛殼菌Ch1001，對(duì)根結(jié)線蟲入侵具有抗性[16]；從絞股藍(lán)的根部分離到了球毛殼菌CGMCC 6882，其產(chǎn)生的多糖具有抗癌活性[17]；從銀杏、八角、杜仲和青檀中分離出的球毛殼菌均有較強(qiáng)的抗氧化活性[18-21]。

2 球毛殼菌的生防作用機(jī)制

植物內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化，與寄主形成了協(xié)同的生態(tài)關(guān)系，通過分泌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、與植物病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)或空間以及重寄生等方面對(duì)植物病原菌產(chǎn)生抑制作用[22-25]。

2.1 產(chǎn)生抗菌等活性物質(zhì)

產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)是球毛殼菌拮抗植物病原菌重要機(jī)制之一。Heye 等[26]、Cullen 和Andrews[27]發(fā)現(xiàn)球毛殼菌孢子懸浮液及其培養(yǎng)提取物能夠顯著降低蘋果黑星病的嚴(yán)重程度，減少蘋果黑星菌Venturia inaequlis的侵染，并表明抗生作用在球毛殼菌對(duì)蘋果黑星菌的拮抗中發(fā)揮重要作用。研究表明球毛殼菌的抗生作用主要體現(xiàn)在其代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用。球毛殼菌CH08、CH23 和ND35等發(fā)酵液對(duì)芒果炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides、蘋果炭疽菌C.gloeosporioides、小麥根腐菌、玉米小斑病菌B.maydis、黃瓜灰霉病菌B.cinerea、辣椒疫霉病菌和玉米彎孢葉斑病菌Curvularialunata等的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用[28-30]。球毛殼菌CEF-082 的非揮發(fā)性代謝物對(duì)棉花黃萎病菌的菌絲生長(zhǎng)和分生孢子產(chǎn)量有較好的抑制效果[14]。Aggarwal 等[31]得到的球毛殼菌Cg2、Cg3、Cg4 和Cg5 分離物通過抗生作用抑制禾旋孢腔菌Cochliobolussativus菌絲的生長(zhǎng)，特別是Cg2 分離物具有較高的代謝物產(chǎn)量，抑菌作用最強(qiáng)。球毛殼菌株61239 發(fā)酵濾液對(duì)蘋果腐爛病菌Valsamali分生孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)有顯著的抑制作用[2]。

目前從毛殼菌屬中分離得到了大量的天然產(chǎn)物，如細(xì)胞松弛素類、Azaphilone 類、吡喃酮類、醌類、二酮哌嗪類、苔色酸類和甾體類等，大多具有細(xì)胞毒、抗炎和抗病原微生物等活性[32]。在球毛殼菌中也分離出多種活性物質(zhì)，最典型的就是球毛殼菌素類（chaetoglobosin）物質(zhì)。球毛殼菌素是屬于細(xì)胞松弛素的一類大環(huán)聚生物堿類[33,34]，而chaetoglobosin A 在球毛殼菌素家族中研究的最多，對(duì)多種植物病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，如對(duì)米赫毛霉Mucormiehei、玉米大斑病菌、枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis、蠟狀芽胞桿菌B.cereus、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、大腸埃希氏菌Escherichiacoli、結(jié)核分支桿菌Mycobacterium tuberculosis、番茄灰霉病菌B.cinerea、油菜菌核病菌和橙色青霉Peniciliumavellaneum等均有較好的抑制作用[11,13,35,36]，對(duì)根結(jié)線蟲也有較強(qiáng)的抑制活性[37]。分離到的其他球毛殼菌素類物質(zhì)，如chaetoglobosins B、C-Z 等，也均有不同程度的抑菌活性[35,38]。

除了球毛殼菌素，在球毛殼菌的代謝產(chǎn)物中也分離到了其他種類的活性成分。研究較多的有嗜氮酮類（azaphilones），如chaetoviridins A、B、C、D、J 和K[39,40]及chaetomugilin A-S[41]，其中chaetoviridins A對(duì)病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)水稻稻瘟病菌Magnaporthegrisea和小麥葉銹病菌Pucciniarecondita的防效達(dá)80%以上，對(duì)番茄晚疫病菌P.infestans的控制效果達(dá)50%[42]；Zhang 等[43]研究了球毛殼菌CEF-082代謝物chaetoviridin A 對(duì)棉花黃萎病的生防機(jī)理，其能夠引起棉花黃萎病菌的細(xì)胞壞死和菌絲變形，抑制黃萎病菌小菌核的萌發(fā)，并增強(qiáng)棉花防御反應(yīng)。從球毛殼菌發(fā)酵液中分離鑒定得到的抗生素fuscoatroside、鞘氨醇和多糖等，均具有抗菌活性[44,45]，如鞘氨醇可抑制蕓薹根腫菌Plasmodiophorabrassicae休眠孢子的萌發(fā)，對(duì)油菜根腫病有很好的生防作用[25]，多糖通過破壞細(xì)胞內(nèi)膜并增加細(xì)胞滲透性，從而對(duì)大腸桿菌E.coli和金黃色釀膿葡萄球菌S.aureus產(chǎn)生拮抗作用[46]；球毛殼菌的發(fā)酵液中檢測(cè)到含有吲哚乙酸（IAA）、麥角甾醇（Ergosterol）、赤霉素（GA）、玉米素（Zeatin）和brefeldin A （Ⅰ）等物質(zhì)，對(duì)植物生長(zhǎng)有較好的促進(jìn)作用[47-49]。球毛殼菌ND35 粗酶液中的內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶等細(xì)胞壁降解酶對(duì)蘋果炭疽病菌、楊樹腐爛病菌、蘋果樹腐爛病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有明顯的抑制作用[50,51]。另外，從球毛殼菌中還分離到了其他如吡喃酮類、醌類、二酮哌嗪類和甾體類等化合物，均有不同程度的抗菌和細(xì)胞毒活性[32]。

2.2 促進(jìn)植物生長(zhǎng)

內(nèi)生真菌通過影響植物體內(nèi)的物質(zhì)代謝從而提高資源利用效率，如對(duì)植株中的氮代謝和積累有顯著影響，從而提高植物對(duì)土壤氮的利用效率；通過改變植物體內(nèi)碳水化合物的源庫(kù)關(guān)系，進(jìn)而促進(jìn)光合作用；并通過調(diào)節(jié)植物激素的合成和代謝，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[23]。球毛殼菌對(duì)大田小麥、辣椒、黃瓜、核桃、楊樹、甘薯、擬南芥和板栗等作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量均有不同程度的促進(jìn)作用，例如對(duì)黃瓜的根長(zhǎng)、株高、根鮮重和地上鮮重有促進(jìn)作用，促進(jìn)開花結(jié)果；對(duì)甘薯的單株產(chǎn)量提高4 倍；促進(jìn)板栗側(cè)根和毛細(xì)根的生長(zhǎng)及開花；對(duì)楊樹苗的根系活力、葉綠素含量、根系長(zhǎng)度及株高等產(chǎn)生顯著影響[24,47,49,52,53]。研究表明，球毛殼菌主要通過改善土壤肥力和微生物環(huán)境及產(chǎn)生生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)從而發(fā)揮促生作用。球毛殼菌12XP1-2-3 拌種處理下苗期小麥根際土壤中芽孢桿菌和根瘤菌等有益菌的相對(duì)豐度增加，促進(jìn)了根際微生物網(wǎng)絡(luò)的健康程度，對(duì)小麥有很好的促生、防病和增產(chǎn)作用[54]。施用球毛殼菌ND35 菌劑能夠改善根際土壤的化學(xué)性質(zhì)及生物性質(zhì)，從而促進(jìn)楸樹和平邑甜茶幼苗的生長(zhǎng)[55,56]。同時(shí)球毛殼菌發(fā)酵液中存在能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)植物有明顯的促生作用[49]。

2.3 誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性

植物對(duì)病原物的抗性有兩種不同的機(jī)制，即系統(tǒng)獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）和誘導(dǎo)型系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance，ISR）。誘導(dǎo)寄主抗性是研究生防制劑抑菌機(jī)理的一個(gè)重要且備受關(guān)注的領(lǐng)域。球毛殼菌具有誘發(fā)植物抗病性的功能，使植物對(duì)多種生物和非生物脅迫產(chǎn)生抗性。印容[25]證實(shí)球毛殼菌防治油菜根腫病的機(jī)制之一為可以誘導(dǎo)油菜的防御酶（PAL、POD 和PPO）活性升高，從而誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性。球毛殼菌CEF-082 通過促進(jìn)棉花抗性相關(guān)基因（β-1,3-glucanase、POD、PPO 和PAL）的上調(diào)表達(dá)，從而誘導(dǎo)棉花對(duì)黃萎病的抗性[14]。球毛殼菌NC-1 能夠抑制小麥褐斑病菌Pyrenophora tritici-repentis在小麥葉片上的擴(kuò)展，這種抑制作用可能是由于球毛殼菌誘導(dǎo)了細(xì)胞外蛋白質(zhì)在寄主中的積累，從而促進(jìn)寄主產(chǎn)生抗性[57]。Singh 等[58]通過時(shí)間轉(zhuǎn)錄組表明ISR 和SAR 信號(hào)途徑均參與了球毛殼菌誘導(dǎo)的番茄系統(tǒng)抗性。球毛殼菌TAMU 520 能增強(qiáng)棉花對(duì)地下根結(jié)線蟲和地上害蟲的系統(tǒng)抗性[59]。此外，球毛殼菌ND35 能夠促進(jìn)小麥干旱誘導(dǎo)相關(guān)基因wzy2 的表達(dá)量，提高冬小麥耐脫水性和對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性[60]；且該菌株顯著提高楸樹和黃瓜等的抗旱性[49,55]。在鹽脅迫下，球毛殼菌D5 能夠促進(jìn)芍藥的生長(zhǎng)和光合作用，減輕鹽脅迫引起的傷害，從而提高芍藥的耐鹽性[61]。

2.4 生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)作用

植物內(nèi)生真菌進(jìn)入寄主植物的方式與病原菌相似，可以優(yōu)先占據(jù)病原菌的入侵位點(diǎn)，從而對(duì)病原菌產(chǎn)生生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)，抑制病原菌在植物體內(nèi)的擴(kuò)展，從而減輕病害的發(fā)生[23,24]。在離體條件下通常采用拮抗試驗(yàn)研究植物內(nèi)生真菌與病原菌的生態(tài)位和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)作用。岳會(huì)敏等[62]通過平板對(duì)峙試驗(yàn)表明球毛殼菌對(duì)立枯絲核菌R.solani、茄腐鐮孢菌F.solani、大豆疫霉病菌P.sojae、核盤菌S.sclerotiorum和尖孢鐮孢菌F.oxysporum的菌絲生長(zhǎng)抑制作用主要是通過競(jìng)爭(zhēng)作用和重寄生作用實(shí)現(xiàn)的。。

2.5 重寄生作用

真菌病原物能被其他真菌侵染或寄生，二者需要在空間上彼此鄰近才能相互作用。葉麗丹等[63]通過構(gòu)建和轉(zhuǎn)化EGFP（Enhanced GFP）表達(dá)載體對(duì)球毛殼菌進(jìn)行標(biāo)記，用平板共培養(yǎng)、載玻片培養(yǎng)等方法發(fā)現(xiàn)，球毛殼菌對(duì)立枯絲核菌的拮抗機(jī)理主要是重寄生作用。Aggarwal 等[31]通過球毛殼菌6 個(gè)分離物與禾旋孢腔菌共培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，球毛殼菌Cg1 和Cg6 重寄生到禾旋孢腔菌菌絲中，因此沒有產(chǎn)生抑菌帶。劉曉光等[6]研究發(fā)現(xiàn)球毛殼菌ND35 可通過寄生作用寄生在齊整小核菌Sclerotiumrolfsii和立枯絲核菌內(nèi)，寄生菌絲被纏繞、穿透和斷裂。Gao 等[51]研究表明球毛殼菌寄生到立枯絲核菌內(nèi)部后，使病原菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，細(xì)胞壁降解，且在重寄生互作過程中產(chǎn)生了幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶。

3 球毛殼菌在植物上的侵染定殖

球毛殼菌能否成功在植物中定殖及存活是其發(fā)揮生防作用的重要因素。研究表明球毛殼菌在楊樹、黃瓜、辣椒、煙草和油菜等植物上均能良好定殖[23,25,47,64]。球毛殼菌在楊樹和黃瓜上的侵染定殖研究表明[23,24,47]，子囊孢子萌發(fā)形成的菌絲從根、莖部表皮細(xì)胞的間隙侵入，或形成附著胞或菌絲足，進(jìn)而形成侵染釘直接從表皮細(xì)胞侵入；在葉部主要從氣孔侵入葉片內(nèi)部。侵入根部的菌絲主要定殖于表皮細(xì)胞、外皮層細(xì)胞或細(xì)胞間隙，未發(fā)現(xiàn)進(jìn)入內(nèi)皮層和維管束組織。

4 球毛殼菌在植物上的應(yīng)用潛能

4.1 球毛殼菌在防病促生方面的應(yīng)用

基于球毛殼菌對(duì)多種植物病害有很好的防治效果，且能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，因此在植物防病促生方面有很大的應(yīng)用潛能。泰國(guó)的Soytong 等[65]利用球毛殼菌和角毛殼菌的22 個(gè)株系配制成生物顆粒劑和生物粉劑，通過專利授權(quán)將產(chǎn)品注冊(cè)并命名為“Ketomium?”。該產(chǎn)品已經(jīng)成功應(yīng)用于榴蓮和黑胡椒疫霉菌P.palmivora、柑桔寄生疫霉P.parasitica、草莓惡疫霉P.cactorum和番茄萎焉病菌尖孢鐮孢菌等的生物防治中起到較好的防控作用和治療效果，同時(shí)能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。

4.2 球毛殼菌對(duì)土壤改良作用

利用球毛殼菌制成菌肥，將在緩解連作障礙、改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和抑制病原菌種群數(shù)量方面有較好的應(yīng)用潛能。土壤酶活性及微生物的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)，是衡量土壤質(zhì)量的指標(biāo)之一。研究表明，施用球毛殼菌ND35 菌劑能夠明顯提高土壤中有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量及脲酶、蔗糖酶和堿性磷酸酶等土壤酶活性，提高土壤微生物多樣性及豐度，從而促進(jìn)楸樹和平邑甜茶幼苗的生長(zhǎng)[55,56]。米士偉[24]將培養(yǎng)后的球毛殼菌ND35 晾干后，用多功能粉碎機(jī)粉碎，制成微生物肥料，并且可以用蛭石作為菌肥填料。郭君興[52]將球毛殼ND35 的固體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物通過初步加工和添加劑的加入，開發(fā)研制出幾種微生物肥料劑型。利用這些不同劑型的球毛殼ND35 生物肥料可以改善土壤環(huán)境及肥力，促進(jìn)植物的生理活性，研究表明其對(duì)辣椒、黃瓜、小麥、核桃、楊樹葉和甘薯等作物都有較好的肥效，且對(duì)干旱、鹽分和高溫脅迫都有較強(qiáng)的耐受能力[52,66]。

4.3 球毛殼菌降解秸稈的能力

微生物對(duì)纖維素的降解利用是自然界中碳素循環(huán)的主要環(huán)節(jié)，對(duì)解決世界能源危機(jī)和環(huán)境污染等方面具有重要的意義。球毛殼菌既能夠分解利用纖維素，也能夠分解木質(zhì)素；能夠產(chǎn)生活性較強(qiáng)的纖維素水解酶，以分解利用秸稈、咖啡豆和油棕櫚樹葉[67-70]。胡陽[3]分離到一株高效降解纖維素球毛殼菌NK102，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)探索了球毛殼菌培養(yǎng)過程中纖維素酶表達(dá)的規(guī)律，其中外切葡聚糖酶、纖維二糖脫氫酶和內(nèi)切葡聚糖酶基因(cbh1，cdh和egl1)的表達(dá)量最高，且這些酶基因的表達(dá)受到營(yíng)養(yǎng)、物理?xiàng)l件的影響，為揭示球毛殼菌降解纖維素分子機(jī)理提供了參考。由于秸稈上帶有病原菌，而球毛殼菌的施用即能夠降解秸稈，又能抑制植物病原微生物，因此球毛殼菌可能對(duì)秸稈還田造成的植物病害積累具有一定的控制作用，但相關(guān)報(bào)道較少，未來需在該方向進(jìn)一步深入研究。

5 球毛殼菌發(fā)酵工藝研究

生防菌規(guī)?；a(chǎn)的基礎(chǔ)是發(fā)酵工藝的優(yōu)化，而發(fā)酵工藝的基本目標(biāo)是降低成本，簡(jiǎn)化工藝流程，獲得最大產(chǎn)孢量或次生代謝物。目前較多研究通過正交試驗(yàn)，獲得了影響產(chǎn)孢和活性物質(zhì)生產(chǎn)的最佳組合。在產(chǎn)孢研究方面，郭君興[52]通過優(yōu)化培養(yǎng)方法和條件，篩選出一種性狀優(yōu)良、高產(chǎn)孢、適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的菌糠廢料。用培養(yǎng)金針菇的菌糠廢料培養(yǎng)球毛殼ND35，加水量為300 mL/kg 時(shí)獲得最大產(chǎn)孢量為3.39×109孢子/g。在產(chǎn)活性物質(zhì)研究方面，高建鋒等[71]通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以碳源、氮源、礦質(zhì)元素、生長(zhǎng)因子和pH 值為基本因子，獲得了影響抗生物質(zhì)產(chǎn)量的最佳組合，即1%葡萄糖，1%蔗糖，0.5%牛肉膏，0.02%硫酸亞鐵，0.01%維生素B1，pH 值為7。葛飛等[18]通過正交試驗(yàn)對(duì)球毛殼菌SG0016 菌株的液體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，以葡萄糖為碳源，酵母膏為氮源，接種量為10%，23 ℃溫度下培養(yǎng)7 d，使發(fā)酵液的DPPH 自由基的清除率達(dá)到96.17%，與優(yōu)化前相比提高了23.6%。阮璐璐等[72]對(duì)球毛殼菌素A 的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最佳配方為蔗糖17 g/L，淀粉6 g/L，蛋白胨0.5 g/L，發(fā)酵13 d，使球毛殼菌素A 的發(fā)酵量達(dá)到0.17 g/L。姜成[73]研究表明色氨酸、正丙醇和正丁醇能夠提高球毛殼菌素A 的生產(chǎn)效率及最終產(chǎn)量。為了降低發(fā)酵成本，建立并優(yōu)化了以玉米秸稈為主要底物的發(fā)酵-純化體系，最適條件為秸稈11.66 g，氯化銨0.67 g，培養(yǎng)溫度為25.5 ℃，使球毛殼菌素A 產(chǎn)量達(dá)到3.7647 mg。這些研究成果為球毛殼菌產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

6 球毛殼菌的基因工程研究

通過微生物分子生物學(xué)方面的研究，尋找對(duì)活性物質(zhì)的分泌有促進(jìn)作用的基因改造方式，最終可達(dá)到提高活性物質(zhì)生產(chǎn)效率的目的。劉志華[74]在球毛殼菌上克隆了重要生物防治相關(guān)基因內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因（chi46）和C4-甲基甾醇氧化酶（sterol），并克隆了與球毛殼菌脅迫應(yīng)答和生物降解相關(guān)的小熱激蛋白基因、過氧化物膜蛋白基因和二烯醇內(nèi)酯水解酶基因等，為揭示球毛殼菌生物防治分子機(jī)理和體內(nèi)高價(jià)值酶基因的發(fā)掘提供依據(jù)。并將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，獲得了能夠大量生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的基因工程菌。目前研究較多的是球毛殼菌素生物合成相關(guān)基因的挖掘。姜成[73]對(duì)聚酮合酶C 骨架延長(zhǎng)相關(guān)基因Cger進(jìn)行過表達(dá)，使球毛殼菌素A 生產(chǎn)速率顯著提高。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)CghdⅠ對(duì)球毛殼菌素A 的合成有抑制作用，通過插入性突變使其產(chǎn)量提高。Tao 等[75]通過對(duì)具有全局調(diào)控作用的laeA基因在球毛殼菌CBS148.51 中的過表達(dá)，促進(jìn)了球毛殼菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)量。近年來發(fā)現(xiàn)了一些新的可能參與球毛殼菌素A 合成或轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，如光響應(yīng)調(diào)控因子CgVeA、多效轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CgXpp1和外排基因CgMfs1等，將有利于促進(jìn)球毛殼菌素在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和商業(yè)化[76,77,78]。

7 球毛殼菌的生防效果影響因素

與化學(xué)藥劑相比，生防菌制劑處理效果往往受環(huán)境因素的影響而呈現(xiàn)較大的變異性，很多生防菌在試驗(yàn)條件和田間自然條件下的生防效果有較大區(qū)別，在田間施用后由于定殖能力弱而降低防效[79-82]。球毛殼菌同樣受溫度、濕度、微生物、氧化作用和pH 等田間復(fù)雜環(huán)境的影響而呈現(xiàn)不穩(wěn)定的生防效果[83]。Boudreau等[83]研究表明用球毛殼菌子囊孢子處理蘋果葉片防治蘋果黑星病，發(fā)揮重要作用的可能并不是菌體或孢子本身，而是菌體產(chǎn)生的活性物質(zhì)，且處理后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于抗生物質(zhì)受外界環(huán)境影響降解導(dǎo)致其生防效果逐漸下降。除了受環(huán)境因素的影響，毛殼菌本身對(duì)苯并咪唑類殺菌劑異常敏感，致使它無法與這類殺菌劑綜合使用，對(duì)植物病害進(jìn)行有效控制[84]。在不同濃度下球毛殼菌的應(yīng)用效果不同，Xia 等[85]用7 個(gè)不同劑量（從0 到1.67 g/kg）的球毛殼菌ND35 菌肥處理連續(xù)輪作下的白楊，發(fā)現(xiàn)0.67 和1.00 g/kg的劑量下，植株高度最大，葉片、莖和根的生物量最大，能夠有效促進(jìn)白楊根系生理活性和光合利用率，但是濃度再升高反而效果下降。且球毛殼菌在植物體內(nèi)發(fā)揮作用持續(xù)的時(shí)間有一定限制，李金花[55]研究表明球毛殼菌ND35 主要在脅迫前期通過提高酶系統(tǒng)的防御來提高楸樹幼苗抗旱性，而在脅迫后期對(duì)酶系統(tǒng)的作用不再顯著。此外，球毛殼菌不同施用方法和不同等滲水劑型對(duì)植物的防病促生效果也會(huì)有較大的差異[86-88]。這些研究為球毛殼生防菌劑的高效利用提供了理論依據(jù)。

8 球毛殼菌生物安全性評(píng)價(jià)

高建鋒等[89]研究了球毛殼ND35 抗生物質(zhì)粗提物對(duì)黃瓜、菜豆和小麥種子是安全的，對(duì)小白鼠、大白兔等動(dòng)物來說屬低級(jí)毒；子囊孢子在水中能自行消解，在濃度低于105cfu/mL 時(shí)對(duì)泥鰍生長(zhǎng)無顯著性影響。由此推斷，球毛殼菌與其他微生物農(nóng)藥一樣無毒、無污染，用于土傳病害的生物防治無明顯性風(fēng)險(xiǎn)。泰國(guó)的球毛殼菌和角毛殼菌產(chǎn)品“Ketomium?”在低于2×109cfu/kg 的劑量下對(duì)老鼠同樣沒有明顯的毒性作用。關(guān)于球毛殼菌生物安全性和投放環(huán)境后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需進(jìn)一步的深入探討研究。

9 問題與展望

球毛殼菌具有很大的生防潛能，但其尚處于研究與開發(fā)的初始階段，針對(duì)其應(yīng)用受限因素，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)球毛殼菌對(duì)植物病原菌的生防機(jī)理研究，深入研究球毛殼菌與寄主植物、病原菌、其他微生物和環(huán)境之間的互作關(guān)系和變化規(guī)律，以便創(chuàng)造球毛殼菌的適宜生長(zhǎng)環(huán)境，更好的發(fā)揮球毛殼菌的生防功能。其次，球毛殼菌次生代謝物中的多種活性物質(zhì)，通過發(fā)酵、分離和提純，進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，有望成為新的、安全和高效的生物農(nóng)藥，但目前對(duì)球毛殼菌代謝產(chǎn)物的生物活性研究范圍較為局限，某些活性物質(zhì)的種類和性質(zhì)尚不明確，因此對(duì)其化學(xué)成分的認(rèn)識(shí)有待進(jìn)一步完善，同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)球毛殼菌分子生物學(xué)及其活性物質(zhì)合成調(diào)控等相關(guān)方面的深入探索和研究，為尋找促進(jìn)活性物質(zhì)生產(chǎn)的基因改造方式和基因工程的應(yīng)用提供理論依據(jù)。最后，在生產(chǎn)上需進(jìn)一步研究并解決球毛殼菌固態(tài)發(fā)酵工藝流程、后處理技術(shù)、產(chǎn)品劑型、加工技術(shù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的問題，為球毛殼菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用推廣奠定基礎(chǔ)。