鐵皮石斛梢枯病病原菌分離鑒定及淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌代謝產(chǎn)物對(duì)其防治效果

雷承澤，張 諾，宋 陽(yáng)，俞曉平，申屠旭萍

（中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018）

鐵皮石斛Dendrobiumofficinale隸屬于蘭科Orchidaceae 石斛屬Dendrobium，是一種多年生附生草本植物，有著“九大仙草之首”的美譽(yù)[1]。鐵皮石斛是遠(yuǎn)近馳名的中國(guó)傳統(tǒng)名貴中草藥材，主要藥用部位是新鮮或干燥的莖，兼具保健功能和治療效果。鐵皮石斛的藥用歷史悠久，藥用價(jià)值高，當(dāng)屬“藥中黃金”，有助于生津養(yǎng)胃；清熱滋陰；益腎潤(rùn)肺；強(qiáng)腰明目[2]。鐵皮石斛喜好溫濕氣候和半陰環(huán)境中生長(zhǎng)，在我國(guó)主要分布于浙江、云南省海拔超過(guò)1.6 km 的地區(qū)[3]。

浙江省金華市武義縣是浙江省鐵皮石斛主要產(chǎn)地，其本地品牌壽仙谷牌“鐵皮石斛”在2011 年已被列入國(guó)家地理標(biāo)志登記保護(hù)名單，該地鐵皮石斛種植總面積達(dá)105 hm2，貢獻(xiàn)率占全省的10%以上[4]。為了滿足人民大眾對(duì)鐵皮石斛的需求，人工栽培技術(shù)廣泛應(yīng)用于鐵皮石斛的產(chǎn)業(yè)化種植。然而鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)也面臨著諸多難題，如種植過(guò)程中溫濕氣候與半陰的環(huán)境往往容易滋生病害病原菌，加之鐵皮石斛枝葉繁茂、莖葉幼嫩，更易招惹病蟲(chóng)侵襲，病蟲(chóng)害在空氣流通性差、濕度高的種植基地中逐年加重，積重難返[5]。目前鐵皮石斛病害防治方面仍存在較多不足，如缺乏病原菌系統(tǒng)鑒定、防治手段效果差、病害發(fā)生規(guī)律知之甚少等。鐵皮石斛常見(jiàn)的病害主要有枯梢病、炭疽病、黑斑病、白絹病、根腐病、灰霉病等共計(jì)12 種類型[6,7]。目前已有根腐病、黑斑病、白絹病等病原菌鑒定和防治的有關(guān)報(bào)道，但涉及鐵皮石斛梢枯病病原菌的鑒定方面相關(guān)報(bào)道極少，防治手段也尚未形成完整的科學(xué)研究體系[8]。

枯梢病在鐵皮石斛整個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)，均有不同程度的發(fā)生，在春季尤為常見(jiàn)，其田間病株表現(xiàn)為頂部嫩梢枯萎。染病初期頂部嫩葉生長(zhǎng)速率變慢，逐漸褪去原本的綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榭蔹S色，枯黃部分在不斷向下蔓延伸展，致使頂梢彎曲，最終形成枯梢狀態(tài)。在病害嚴(yán)重時(shí)，鐵皮石斛將停止生長(zhǎng)[9]?？梢哉f(shuō)梢枯病對(duì)鐵皮石斛的危害大大降低了鐵皮石斛的產(chǎn)量，對(duì)鐵皮石斛的品質(zhì)也造成了惡劣影響。因此，明確浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌，建立行之有效的防治方法，對(duì)于鐵皮石斛的增產(chǎn)提質(zhì)有著重大意義。本研究鐵皮石斛病株采集自武義縣壽仙谷鐵皮石斛種植基地，將病原菌分離純化后用柯赫氏法則驗(yàn)證致病性，進(jìn)一步結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定梢枯病病原菌的分類地位。運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物，探究其對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病的室內(nèi)及田間的防治效果，旨在明確浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌并為鐵皮石斛梢枯病的生物防治提供理論依據(jù)和實(shí)際指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌：從2019 年5—7 月自浙江省武義縣壽仙谷鐵皮石斛種植基地采集的具有典型梢枯病病癥的病株上分離純化獲得；盆栽健康鐵皮石斛：由浙江省武義縣壽仙谷鐵皮石斛種植基地提供；淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌Streptomycesdiastatochromogenes1628 代謝產(chǎn)物、臍孢木霉菌Trichodermabrevicompactum0248 代謝產(chǎn)物由浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保藏菌株發(fā)酵產(chǎn)生。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：蒸餾水1 L、馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，pH 調(diào)至7.0；淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆粉4.3%、可溶性淀粉2%、CaCO30.5%、NH4Cl 0.3%、KH2PO40.3%、FeCl20.1%；臍孢木霉菌0248 發(fā)酵培養(yǎng)基：1 L 蒸餾水，20 g 葡萄糖，5 g 蛋白胨，1 g 牛肉浸膏，0.01 g NH4Cl，0.001 g ZnSO4·7H2O，pH 調(diào)至7.0。

1.1.3 試劑與儀器 CTAB 提取液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；DNA 提取試劑盒、EXTaq聚合酶、DNA marker 購(gòu)于上海生工生物工程（上海）股份有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；76%井岡霉素可濕性粉劑購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；96%寧南霉素原藥購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司；50%多菌靈可濕性粉劑購(gòu)自四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司。PCR 儀、Sub-Cell GT 核酸電泳儀、Nanodrop2000 蛋白核酸定量分析儀（美國(guó)Thermo 公司）；Gel Doc XR 凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；MP Fast-prep-24 均質(zhì)儀（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；YS100 顯微鏡（日本Nikon 公司）；GZX-9140-MBE烘干箱、恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SW-CJ-1F 單人雙面超凈工作臺(tái)（浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 參照徐亦文等[10]通過(guò)平板分離方法對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化。用75%酒精棉球?qū)φ惝a(chǎn)鐵皮石斛的帶病組織進(jìn)行擦拭，將患病組織梢枯的頂端葉片均勻切成1.0 cm×1.0 cm 的小塊，在75%的酒精溶液內(nèi)充分浸泡30 s，再用1% NaClO 表面消毒4 min，再用75 %的酒精漂洗30 s 以除去表面殘留的NaClO，經(jīng)無(wú)菌水漂洗3 次后，吸干組織水分放置于PDA 平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 直至平板上長(zhǎng)出單菌落，用接種環(huán)挑取單菌落接于滅菌過(guò)的新的PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化操作，28 ℃培養(yǎng)7～14 d 后, 觀察記錄菌落形態(tài)與色素的產(chǎn)生情況等，最后將純化菌的孢子用25%的甘油保存于-80 ℃冰箱留作備用[11]。

1.2.2 致病性測(cè)定 采用柯赫氏法則對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病株上分離到的病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定[8,12]。將完成分離純化的病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基平板中央，28 ℃培養(yǎng)5 d 后，用無(wú)菌水清洗菌落表面，經(jīng)稀釋得到濃度為1.0×106孢子/mL 的孢子懸浮液。采用頂端部病害回接法進(jìn)行接種試驗(yàn)，用滅菌針尖刺傷植株頂端葉片組織，于傷口處噴灑孢子懸浮液，并用塑料膜將其包裹罩住保濕48 h，無(wú)菌水處理為對(duì)照。該試驗(yàn)在（26±1）℃、光照周期16L: 8D、相對(duì)濕度70%～80%的人工氣候室中培養(yǎng)，每組設(shè)置3 組重復(fù)。14 d 后觀察植株染病情況，將病變組織進(jìn)行分離純化，分離步驟同1.2.1。對(duì)該組織進(jìn)行鑒定比對(duì)是否與原始病原菌相同。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定 將已純化的病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基平板中央，28 ℃培養(yǎng)7 d。觀察菌落的生長(zhǎng)速率、顏色及形態(tài)等特征。孢子形態(tài)觀察：用無(wú)菌水將孢子沖洗過(guò)濾后取20 μL 于玻片上在400 倍顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇30 個(gè)大、小孢型分生孢子在光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄孢子形態(tài)大小、有無(wú)橫隔縱膈等。產(chǎn)孢鏈觀察：將PDA 平板放置于200 倍顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢鏈[10,13-15]。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定 采用CATB 法進(jìn)行DNA 提取，使用的引物見(jiàn)表1，分別擴(kuò)增Alta1、EF-1α、RPB2、ATP與His3 基因序列片段[16,17]。PCR 反應(yīng)總體積為50 μL，ExTaq25 μL，ddH2O 21.5 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，DNA 模板0.5 μL。設(shè)定PCR 程序[10]：95 ℃（預(yù)變性）3 min；95 ℃（變性）30 s，51 ℃～62 ℃（退火）30 s，72 ℃（延伸）45 s，進(jìn)行34 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃（延伸）10 min。于1.0%瓊脂凝膠電泳儀檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，并將PCR 產(chǎn)物送至杭州有康生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序所得序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，以MEGA X 鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建發(fā)育樹(shù)[18,19]。

表1 本試驗(yàn)中所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.5 抑菌活性測(cè)定 參照張祥麗等[8]方法，即按1.1.4 中制備菌株1628 和菌株0248 發(fā)酵液母液，并將粉劑（96%寧南霉素原藥、76%井岡霉素可濕性粉劑）與無(wú)菌水按質(zhì)量比1:1 制成液體藥劑待用。配制PDA 培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃、15 min 高溫滅菌待降溫至50 ℃～60 ℃，將4 種供試殺菌劑與PDA 培養(yǎng)基按體積比1:9 分別制成含10% 1628 發(fā)酵液、10% 0248 發(fā)酵液、9.6%寧南霉素、7.6%井岡霉素、5%多菌靈的含藥平板，按體積比1:99 分別制成含1% 1628 發(fā)酵液、1% 0248 發(fā)酵液、0.96%寧南霉素、0.76%井岡霉素、0.5%多菌靈的含藥平板，接種鐵皮石斛梢枯病病原菌S8-1 菌餅（直徑為5 mm）于PDA 含藥平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每組3 個(gè)重復(fù)，取平均值計(jì)算抑制率，對(duì)照組為無(wú)菌水處理。抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.2.6 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病菌的室內(nèi)防效測(cè)定 將淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 接種于GYM 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)發(fā)酵7 d 后，在6000 r/min 離心10 min 取上清制備獲得淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物[20-22]。

菌絲生長(zhǎng)抑制率測(cè)定[10]：將淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物按體積比稀釋成10%、1%、0.33%三個(gè)濃度梯度，經(jīng)0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾后，吸取2 mL 加入至18 mL 的PDA 培養(yǎng)基中，二者混勻后倒平板。其他藥劑同樣稀釋成目標(biāo)濃度后，吸取2 mL 加入至18 mL 的PDA 培養(yǎng)基中，二者混勻后倒平板。將直徑為5 mm的梢枯病病原菌菌餅小心置于PDA 平板中央?yún)^(qū)域，28 ℃培養(yǎng)5 d，無(wú)菌水處理為陰性對(duì)照，每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。菌絲生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算：十字交叉法測(cè)定培養(yǎng)5 d 后PDA 平板上菌落直徑。抑制率（%）＝（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.2.7 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病田間防效測(cè)定 試驗(yàn)地點(diǎn)為浙江省杭州市中國(guó)計(jì)量大學(xué)溫網(wǎng)室內(nèi)的微型農(nóng)田，試驗(yàn)面積約為16 m2。在2019 年7 月，采集“仙斛1 號(hào)”（浙江省武義縣壽仙谷的鐵皮石斛種植基地的一年生健康鐵皮石斛植株），并于當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室隨即在試驗(yàn)用田進(jìn)行移栽。2020 年3 月份鐵皮石斛進(jìn)入發(fā)病期，及時(shí)對(duì)發(fā)病癥狀進(jìn)行觀察記錄，并將病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)匯總。依據(jù)發(fā)病癥狀的嚴(yán)重程度可將梢枯病病情分為4 個(gè)等級(jí)：0 級(jí)，健康苗；1 級(jí)，不足1/4 的葉片出現(xiàn)梢枯現(xiàn)象；2 級(jí)，1/4～1/2 的葉片出現(xiàn)梢枯現(xiàn)象；3 級(jí)，1/2～3/4 的葉片出現(xiàn)梢枯現(xiàn)象；4 級(jí)，超過(guò)3/4 的葉片出現(xiàn)梢枯現(xiàn)象。在發(fā)病前期，開(kāi)始田間防效試驗(yàn)，將體積比為100%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物處理1 區(qū)，體積比為50%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物處理2 區(qū)，采用100%和50%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物作為田間防效測(cè)定的供試藥劑在浙產(chǎn)鐵皮石斛高發(fā)期內(nèi)進(jìn)行田間防效測(cè)定，并用清水作為陰性對(duì)照，50%多菌靈作為陽(yáng)性對(duì)照，且每塊處理田之間都用陰性對(duì)照組作為間隔田，以免對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生不必要的影響。使用小型手動(dòng)氣壓式噴壺對(duì)供試鐵皮石斛整株進(jìn)行均勻噴灑，將每個(gè)分區(qū)樣本量設(shè)置為30 株，每組試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)[23]。施藥后第7、14 d 調(diào)查記錄樣本發(fā)病情況，另外由于施藥前的各個(gè)分區(qū)之間病情指數(shù)存在差異，故需統(tǒng)計(jì)每個(gè)分區(qū)施藥前的發(fā)病情況，以此為基礎(chǔ)對(duì)病情指數(shù)進(jìn)行校正防效的計(jì)算。病情指數(shù)和校正防效的計(jì)算[8]：病情指數(shù)＝∑（各級(jí)病株數(shù)×對(duì)應(yīng)各級(jí)代表級(jí)數(shù)值）/（試驗(yàn)總株數(shù)×發(fā)病最高級(jí)的代表級(jí)數(shù)值）×100；校正防效（%）=100×[1－（處理藥后病情指數(shù)×對(duì)照藥前病情指數(shù)）/（處理藥前病情指數(shù)×對(duì)照藥后病情指數(shù)）][24]。所得數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析，T-test 進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病害癥狀

該病原菌主要侵害部位為浙產(chǎn)鐵皮石斛頂端葉片，發(fā)病初期可以觀察到石斛頂梢部位生長(zhǎng)速率變緩，而后葉片逐漸變黃，發(fā)病中期葉片上枯黃區(qū)域不斷向下蔓延擴(kuò)大，發(fā)病后期頂端染病部位葉片完全枯死（圖1A），隨著病害癥狀的不斷發(fā)展，病斑上會(huì)產(chǎn)生黑色霉層，最終可導(dǎo)致頂端的3～6 片葉片死亡，進(jìn)而引起整株鐵皮石斛死亡。根據(jù)發(fā)病特征將其鑒定為梢枯病。

圖1 浙產(chǎn)鐵皮石斛的梢枯病病害特征及致病性測(cè)定Fig.1 The characteristics and the pathogenicity assay of die back in D.officinale

2.2 浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌的致病性測(cè)定

對(duì)分離自浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病株的病原真菌（編號(hào)為S8-1）進(jìn)行致病性測(cè)定。大約7 d 可以觀察到初始發(fā)病癥狀與田間病原菌感染植株病害特征一致，在鐵皮石斛頂端葉片開(kāi)始出現(xiàn)枯黃現(xiàn)象，一周之后枯黃區(qū)域不斷從頂端向下蔓延擴(kuò)大，顏色也逐漸由淺變深（圖1B）。從病株葉片感染處重新采集病原感染組織后通過(guò)再次分離純化，得到的菌株與原始病原菌S8-1 形態(tài)一致，由此可以說(shuō)明經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證S8-1為引起浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病的病原菌。

2.3 浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌S8-1 在PDA 平板上菌絲呈放射狀生長(zhǎng)，菌落中心呈深灰色，周圍由淺灰至白色散開(kāi)，菌絲呈現(xiàn)棉絮狀覆蓋在表面，初期菌絲呈現(xiàn)淺灰色，而后菌落逐漸向四周擴(kuò)散，平板背面顏色呈現(xiàn)黑色，周圍一圈呈現(xiàn)灰白色，菌絲生長(zhǎng)速率為9.4 mm/d，在28 ℃下培養(yǎng)14 d 菌落直徑為7.5 cm（圖2A）。顯微鏡下單個(gè)孢子呈倒棒狀或梨形，具有3～8 個(gè)橫隔，1～4 個(gè)縱隔；小型分生孢子類似桿狀但頭部略膨大，大型分生孢子呈棒槌狀或燈泡狀大小，其孢子大小約為（20.1～78.2）μm×（11.0～35.5）μm，部分孢子頂部含有假喙，大小約為（0～33.5）μm×（2.5～9.0）μm（圖2B，C）。菌絲有隔、細(xì)長(zhǎng)型（圖2D，E），初步鑒定該病原菌為鏈格孢菌A.alternata[9-11]。

圖2 S8-1 菌落與孢子形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 The morphological characteristics of S8-1 colony and conidiospore

2.4 浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌分子生物學(xué)鑒定

采用特異性引物對(duì)病原菌S8-1 進(jìn)行分子鑒定，以病原菌S8-1 基因組DNA 為模板，對(duì)Alta1、TEF-1α、RPB2、ATP及His3 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得有效條帶分別為503、280、1128、1245、441 bp，得到 5個(gè)基因部分序列片段的電泳圖（圖3）。將測(cè)序所得序列上傳到Genebank，序列號(hào)分別為ALTa1（MW995953）、RPB2（MW995956）、TEF-1α（MW995955）、ATPase（MW995957）和His3（MW995954）。在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 分析比對(duì)，Alta1、TEF-1α、RPB2、ATP和His3 序列與Genbank 中的登錄號(hào)為MN894675.1、LC132709.1、MG873562.1、MW541760.1 和MN481961.1 的鏈格孢菌同源性分別為100%、100%、100%、100%和99.77%。綜合形態(tài)學(xué)分析和致病性測(cè)定結(jié)果，確定浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌為鏈格孢菌A.alternata（圖4）

圖3 Alta1、TEF-1α、RPB2、ATP 與His 3 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖Fig.3 Electrophoresis results of PCR amplification of Alta1, TEF-1α, RPB2, ATP and His 3

圖4 基于Alta1、RPB2、TEF-1α、ATP 和His 3 序列構(gòu)建S8-1 相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of S8-1 based on Alta1、RPB2、TEF-1α, ATP and His 3 sequences

2.5 鐵皮石斛梢枯病病原菌S8-1 對(duì)供試殺菌劑的敏感性

10%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)梢枯病菌株S8-1 的抑制作用最強(qiáng)，菌絲生長(zhǎng)抑制率為96.88%，而1%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物的抑制率也達(dá)到了63.93%。10%與1%的臍孢木霉菌0248 代謝產(chǎn)物對(duì)菌株S8-1 的菌絲抑制率分別為75.96%和34.15%，10%與1%的寧南霉素對(duì)菌株S8-1 菌絲抑制率分別為49.33%和13.73%，說(shuō)明臍孢木霉菌0248 代謝產(chǎn)物和寧南霉素對(duì)S8-1 的抑制效果均低于同濃度下的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物的抑制效果。5%和0.5%的多菌靈對(duì)菌株S8-1 的菌絲抑制率分別為3.94%和2.97%。而井岡霉素不論是高濃度還是低濃度處理對(duì)S8-1 均無(wú)明顯抑制作用（表2）。綜上，表明淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)梢枯病病原菌S8-1 具有較強(qiáng)抑制作用。

表2 供試殺菌劑對(duì)鐵皮石斛根腐病致病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of fungicides on mycelial growth of D.officinale die back pathogen

2.6 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌室內(nèi)防效

淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用。藥劑終濃度為10%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率很高，可達(dá)96.88%。藥劑終濃度為1%淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率也可達(dá)63.93%。藥劑終濃度為0.33%的菌絲抑制率為27.47%。并且不同濃度藥劑組的菌絲抑制率間存在顯著性差異，隨著藥劑濃度降低抑制效果減弱。由毒力回歸方程可得，其IC50為0.461%（表3）。

表3 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病菌絲生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of Streptomyces diastatochromogenes 1628 metabolites on mycelial growth of D.officinale die back pathogen

2.7 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌田間防效

100%的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物在7 d 時(shí)對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病的校正防效可達(dá)68.35%，與50%濃度的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物相比，差異性不顯著，但100%、50%的1628 代謝產(chǎn)物均顯著性高于50%的多菌靈可濕性粉劑對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病的田間防效。試驗(yàn)結(jié)果顯示，防治時(shí)間在14 d 時(shí)，不同濃度的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物對(duì)梢枯病的防治效果均顯著高于50%多菌靈。由此表明，淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物能能有效防治鐵皮石斛梢枯?。ū?）。

表4 供試藥劑對(duì)浙產(chǎn)鐵皮石斛的田間防效Table 4 Control effects of fungicides on the D.officinale in the field experiment

3 討論

梢枯病是浙江省武義縣壽仙谷鐵皮石斛種植基地內(nèi)發(fā)生在鐵皮石斛上常見(jiàn)的病害，鐵皮石斛潮濕半陰的種植環(huán)境加重了梢枯病的為害程度。梢枯病病原菌主要為害鐵皮石斛的頂端葉片部分，致使嫩梢與葉片枯死，嚴(yán)重影響浙產(chǎn)鐵皮石斛的品質(zhì)與產(chǎn)量。本研究中通過(guò)病原菌分離和柯赫氏式法則驗(yàn)證明確了鐵皮石斛梢枯病病原菌為鏈格孢菌。鏈格孢菌是自然界常見(jiàn)的一類分生孢子真菌，其環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，具有典型形態(tài)特征，在形態(tài)學(xué)上易分類至屬，但菌落變異幅度大，僅靠形態(tài)學(xué)無(wú)法準(zhǔn)確鑒定到種[15]。為了更準(zhǔn)確地鑒定病原菌S8-1 的分類地位，本研究結(jié)合鏈格孢菌的孢子和菌絲形態(tài)，對(duì)Alta1、EF-1α、RPB2、ATP及His3 五個(gè)常見(jiàn)的鏈格孢菌序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增比對(duì)，結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)結(jié)果明確了浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病害的主要病原真菌為鏈格孢菌A.alternata，該研究為后續(xù)鏈格孢菌分類鑒定提供新的思路。

目前針對(duì)鐵皮石斛梢枯病的生物防治報(bào)道少之又少，化學(xué)防治作為主要的防治手段，濫用所帶來(lái)的農(nóng)殘高、污染大、環(huán)保性差等問(wèn)題嚴(yán)重影響中藥材質(zhì)量安全，危害人民健康。生物防治是利用微生物及其代謝產(chǎn)物對(duì)病蟲(chóng)害進(jìn)行防治的一種手段，相較于化學(xué)防治具有農(nóng)殘少、低毒性、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，在植物病害防治中應(yīng)用前景廣闊[25]。因此，本研究采用化學(xué)農(nóng)藥多菌靈和多種生物農(nóng)藥對(duì)鐵皮石斛梢枯病病原菌菌絲生長(zhǎng)速率進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌代謝產(chǎn)物對(duì)該梢枯病病原菌具有更好抑制作用。田間試驗(yàn)進(jìn)一步證明淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌是有效防治鐵皮石斛梢枯病的生防菌。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物主要由核苷類抗生素和多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素構(gòu)成[8,10]。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)10%淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物能夠?qū)﹁F皮石斛的根腐病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果達(dá)到98.22%、浙麥冬黑斑病病原菌抑菌效果達(dá)到98.00%，與本研究中的鐵皮石斛梢枯病病原菌抑菌效果96.88%相近，說(shuō)明10%淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628代謝產(chǎn)物對(duì)多種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)均具有良好的抑菌作用。本研究表明淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌1628 代謝產(chǎn)物可以用作浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病的生物防制劑，這為后續(xù)鐵皮石斛梢枯病的生防菌的探究打開(kāi)了新思路，提供了可靠的理論依據(jù)。

浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病的相關(guān)研究報(bào)道較少，本論文開(kāi)展了浙產(chǎn)鐵皮石斛梢枯病病原菌分離鑒定研究，并提出了梢枯病的生物防治辦法，為鐵皮石斛種植基地常發(fā)的梢枯病的高效防治提供了有力依據(jù)，能夠助力浙產(chǎn)鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。