對GB/T 8313—2018標(biāo)準(zhǔn)中茶多酚重復(fù)性規(guī)定的探討

王小樂

漢中市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000

茶多酚是茶葉在生長過程中自然形成的天然物質(zhì)，是決定茶葉滋味品質(zhì)的關(guān)鍵成分。同時茶多酚具有抗氧化、抗輻射等保健功效，近年來倍受商家及消費者關(guān)注。我國頒布實施的茶葉及茶制品國家標(biāo)準(zhǔn)均對產(chǎn)品中茶多酚含量及檢測方法有明確規(guī)定。我國推薦的現(xiàn)行有效測定茶多酚含量的方法是《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018，以下簡稱“方法”）中的第二法。該方法為茶葉及其制品在產(chǎn)品開發(fā)、生產(chǎn)加工及市場銷售階段提供茶多酚含量測定的技術(shù)支持。該方法中檢測茶多酚含量的重復(fù)性規(guī)定為“同一樣品茶多酚含量的兩次測定值（化學(xué)分析中稱作“平行樣”）相對誤差應(yīng)≤5%”[1]。截至目前，未有相關(guān)文獻(xiàn)對檢測茶多酚含量的重復(fù)性規(guī)定值進(jìn)行分析研究。本文從重復(fù)性定義和數(shù)學(xué)模型入手，找出影響茶多酚測定結(jié)果的因素來源，并通過不確定度量化評定，對其重復(fù)性規(guī)定的合理性進(jìn)行驗證。

1 重復(fù)性的測量條件

在化學(xué)分析試驗中，重復(fù)性體現(xiàn)測試結(jié)果的一致程度。測量重復(fù)性，指在一組相同測量程序、相同操作者、相同測量系統(tǒng)、相同操作條件和相同地點，并在短時間內(nèi)對同一或相類似被測對象重復(fù)測量的測量精密度[2]。如果重復(fù)性不能滿足要求，說明測得結(jié)果不滿足一致程度。

1.1 相同測量程序

方法中對原理、儀器、試劑、操作方法、測定及結(jié)果計算作出明確規(guī)定。平行樣操作的所有程序應(yīng)是不變的，可視為相同。

1.2 相同操作者

平行樣由一人獨立操作完成，整個測試及結(jié)果計算過程，可視為相同。

1.3 相同測量系統(tǒng)

檢測中所用儀器包括天平、水浴鍋、離心機、分光光度計，在試驗過程中均由同一設(shè)備完成。但由于平行樣稱量、提取、稀釋、測定等操作是獨立進(jìn)行的，儀器的示值誤差和重復(fù)性誤差會帶來測定結(jié)果的不一致。過程中還需要使用玻璃量器，如：移液管、容量瓶。這些器具引入的體積、溫度和讀數(shù)誤差也應(yīng)一并考慮，所以測量系統(tǒng)不能視為完全相同。

1.4 相同操作條件

方法中規(guī)定了水浴溫度和時間、離心機轉(zhuǎn)數(shù)和時間、加入福林酚試劑的反應(yīng)時間以及測定前靜置時間。從理論上講，整個試驗過程是在相同操作條件下進(jìn)行的，但實際操作過程中由于該試驗操作步驟繁瑣，人工操作很難保證每個步驟所用時間完全相同，平行樣在操作過程中或多或少會引入時間和溫度上的波動，所以操作條件不能視為完全相同。

1.5 相同地點

在相同的實驗室內(nèi)進(jìn)行測試，可視為相同。

1.6 在短時間內(nèi)重復(fù)測量

方法中多處對時間有嚴(yán)格要求，整個過程滿足在短時間內(nèi)重復(fù)測試，可視為相同。

通過對重復(fù)性測量條件的分析，可以看出測量系統(tǒng)和操作條件是引入誤差的主要來源。

2 評估模型及建模分析

2.1 評估數(shù)學(xué)模型

式中：x1、x2為單次測定茶多酚含量（%）；x為茶多酚含量的平均值；c1為測試液中茶多酚的質(zhì)量濃度（μg/mL）；v為提取液定容體積（mL）；m1為茶樣質(zhì)量（g）；m0為茶樣干物質(zhì)百分含量（%）；d為稀釋因子。

2.2 數(shù)學(xué)模型分析

從式（1）中可知，有x1、x2、這3 個變量，x1和x2為平行測定的兩份樣品，分別由試驗測定并通過式（2）計算得出，由（x1+x2）/2 計算得出。理想情況下x1=x2=，但試驗中不可避免隨機誤差和系統(tǒng)誤差的存在。

假設(shè)對同一茶樣同時測定n 份，（x1，xn）為茶多酚含量測定結(jié)果區(qū)間，為中位值，這樣就形成了一個正態(tài)分布，（x1，xn）為的分散程度。要滿足相對誤差≤5%，（x1，xn）的分散程度越小越好。

由（x1+…+xn）/n 計算得到，其值大小主要由茶葉特質(zhì)決定。因原料鮮葉和生產(chǎn)工藝的不同，茶葉中茶多酚含量差異從3%到34%不等[3]。

從式（2）中可以看出，茶多酚的含量與c1、m1、m0、v、d這5 個參數(shù)相關(guān)，v和d是固定值，分別代表提取定容體積、稀釋倍數(shù)，但在實際操作中體積和溫度會引入隨機誤差，所以式（2）中5個參數(shù)都會對測試結(jié)果茶多酚含量產(chǎn)生影響，這也是造成x1≠x2、x1≠xn的原因所在。

通過圖1清晰地反映出各參數(shù)中影響茶多酚測定結(jié)果的來源，通常量化采用不確定度進(jìn)行評定[4-7]。

圖1 測定過程中各參數(shù)對測定結(jié)果影響的魚骨圖

3 試驗方法

3.1 原理

以甲醇水溶液作為提取液，對磨碎茶葉樣品進(jìn)行浸提，待測液在堿性條件下，茶多酚中-OH基團被福林酚氧化顯藍(lán)色，在765 nm 波長下，以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定茶多酚含量。

3.2 操作方法

3.2.1 樣品母液制備

精確稱取0.2 g 茶樣于離心管中，加入70%甲醇水溶液5 mL 后，水浴加熱（70 ℃）10 min，邊加熱邊攪拌。待冷卻后以3 500 r/min 離心10 min，移出上清液。殘渣按上述操作再重復(fù)提取1次，合并上清液定容至10 mL。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制

精確稱取0.110 g 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，加70%甲醇水溶液溶解，定容于100 mL容量瓶。

3.2.3 沒食子酸工作液配制

分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加水定容于100 mL容量瓶。

3.2.4 樣品測試液配制

移取1.0 mL母液加水定容于100 mL容量瓶。

3.2.5 測定

移取沒食子酸工作液、水及樣品測試液各1.0 mL，分別加入5.0 mL 福林酚試劑，搖勻放置5 min，加入4.0 mL7.5%碳酸鈉溶液搖勻，放置1 h，用1 cm比色皿測定吸光度。

4 不確定度來源及評定

4.1 不確定度來源

通過對數(shù)學(xué)模型的分析，梳理出測定茶多酚含量的不確定度分量、不確定度具體來源及影響因素（表1）。

用戶如果忘記密碼，可以使用注冊的手機號找回密碼。具體實現(xiàn)方式是通過給注冊手機號發(fā)送驗證碼，輸入驗證碼，再輸入新密碼的方式來找回密碼。

表1 不確定度來源分析

4.2 不確定度分量評定

4.2.1 樣品稱量引入的不確定度ur（m樣）

稱取0.2 g 茶樣，應(yīng)選I級天平稱量，0～50 g稱量范圍允許誤差為±0.000 5 g[8]，按照均勻分布，樣品稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

4.2.2 樣品干物質(zhì)引入的不確定度ur（m干）

干物質(zhì)含量測定采用恒重法，采用天平稱重[9]。稱取5.0 g 茶樣，參照4.2.1 中天平允差數(shù)據(jù)及分布，樣品干物質(zhì)的相對不確定度為。

4.2.3 標(biāo)品純度引入的不確定度ur（p）

沒食子酸標(biāo)品的純度為99.47%，擴展不確定度為0.30%，按照均勻分布，沒食子酸純度的相對不確定度為

4.2.4 標(biāo)品稱量引入的不確定度ur（m標(biāo)）

稱取0.110 g沒食子酸標(biāo)品，參照4.2.1中天平允差數(shù)據(jù)及分布，標(biāo)品稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

（1）本試驗全部選用A級玻璃量器，標(biāo)品定容于100 mL 容量瓶，體積允差為±0.10 mL[10]，按照三角分布，體積校準(zhǔn)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

（2）方法中未對標(biāo)品定容試劑做具體規(guī)定，考慮標(biāo)品制備和樣品制備保持一致原則，選擇用70%的甲醇水溶液定容。玻璃量器在20 ℃校準(zhǔn)，而實驗室溫度在（20±4）℃范圍波動。水的膨脹系數(shù)為2.08×10-4/℃，甲醇的膨脹系數(shù)為1.18×10-3/℃，70%甲醇水溶液的膨脹系數(shù)為0.7×1.18×10-3+0.3×2.08×10-4= 8.88×10-4/℃。依據(jù)膨脹效應(yīng)體積變化為±（100×4×8.88×10-4）mL=±0.355 2 mL，按照均勻分布，溶液溫度引入的體積變化相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

標(biāo)品定容的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（3）。

4.2.6 標(biāo)液配制引入的不確定度ur（v標(biāo)配）

（1）標(biāo)液配制使用5 mL刻度移液管和100 mL容量瓶，體積允差分別為±0.025 mL、±0.10 mL，參照4.2.5（1）中方法計算，移液管體積校準(zhǔn)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為2.04×10-3，容量瓶體積校準(zhǔn)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.08×10-4。

（2）移取液體會因溫度變化帶來溶劑體積變化，參照4.2.5（2）中70%甲醇水溶液的膨脹系數(shù)8.88×10-4/℃，移液管體積產(chǎn)生的變化為±（5×4×8.88×10-4）mL=±1.78×10-2mL，按照均勻分布，移取溶液時溫度引入的體積變化相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為2.06×10-3。定容所用試劑為純水，水的膨脹系數(shù)為2.08×10-4/℃，體積產(chǎn)生的變化為±（100×4×2.08×10-4）mL=±8.32×10-2mL，定容時溶液溫度引入的體積變化相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.8×10-4。

（3）配制標(biāo)準(zhǔn)系列時，移液管移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液會引入讀數(shù)誤差，一般估計為±0.01 mL，按照三角分布，讀數(shù)的相對不確定度為。

標(biāo)液配制的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（4）。

4.2.7 母液提取引入的不確定度ur（v提）

母液提取離心后，由人工手動轉(zhuǎn)移上清液，該步驟不能保證每次移取體積相同，根據(jù)經(jīng)驗引入的不確定度估計為0.05 mL，故a = 0.025 mL，按照三角分布，提取液移取的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

4.2.8 母液定容引入的不確定度ur（v提定）

（1）提取液定容于10 mL 容量瓶，體積允差為±0.020 mL，按照三角分布，體積校準(zhǔn)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為8.16×10-4。

（2）母液用70%甲醇水溶液定容，體積產(chǎn)生的變化為±0.035 5 mL，按照均勻分布，溶液溫度引入的體積變化相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為2.05×10-3。母液定容的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（5）。

4.2.9 稀釋倍數(shù)引入的不確定度ur（v?。?/p>

（1）配制樣品測試液使用1 mL移液管和100 mL容量瓶，體積允差分別為±0.008 mL、±0.10 mL，按照三角分布，移液管體積校準(zhǔn)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為3.27×10-3，容量瓶體積校準(zhǔn)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.08×10-4。

（2） 移液管因溫度變化產(chǎn)生的體積變化為±（1×4×2.08×10-4）mL=±8.32×10-4mL，按照均勻分布，移液管溫度變化的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.8×10-4，參照4.2.6（2）中容量瓶溫度引入的體積變化相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.8×10-4。

稀釋倍數(shù)的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見式（6）。

4.2.10 紫外分光光度計引入的不確定度ur（A）

該試驗采用島津UV-2600紫外分光光度計，等級為Ⅱ級，波長765 nm屬于B段，該段的透射比最大允許誤差±0.005[11]，按照均勻分布，紫外分光光度計的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。

4.3 合成不確定度及擴展不確定度

將4.2所有不確定度分量按質(zhì)量、體積、吸光度、標(biāo)品純度分別擬合，最終計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：其中。按95%置信概率，取包含因子k=2，擴展不確定度U=k×uc=0.015。各項不確定度的貢獻(xiàn)率見表2。

表2 茶多酚測定的相對不確定度分量

5 分析討論

從表2不確定度的貢獻(xiàn)率可以看出，體積引入的不確定度最大。這與試驗過程復(fù)雜，使用大量玻璃量器有直接關(guān)系。該試驗選用I級電子天平和Ⅱ級紫外分光光度計，儀器精度等級較高，但質(zhì)量和吸光度的不確定度貢獻(xiàn)率依然高達(dá)22.20%、21.45%。標(biāo)品純度引入的不確定度最小，按照小于最大分量三分之一可以不予考慮[12]。

uc值為測量茶多酚含量引入的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，具有分散性和非負(fù)數(shù)特征。假設(shè)被測量茶多酚含量的可能值在[y-uc，y+uc]區(qū)間內(nèi)，為使uc與y量綱相同，uc值乘以100%為0.74%。分別以y=20%，y=30%代入式（1）計算。

當(dāng)茶葉中茶多酚含量y=20%，

當(dāng)茶葉中茶多酚含量y=30%，

通過代入不同的茶多酚含量值計算平行樣相對誤差。茶多酚含量為20%的茶樣，相對誤差＞5%，不滿足重復(fù)性結(jié)果一致程度；茶多酚含量為30%的茶樣，相對誤差＜5%，滿足重復(fù)性結(jié)果一致程度。試驗證明，在平行樣分散度相同的情況下，茶多酚含量值越大，相對誤差越小。

6 結(jié)論

本文通過對《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018）中茶多酚含量測定的全面分析得出，測試結(jié)果的重復(fù)性與平行樣分散度、茶葉自身的茶多酚含量相關(guān)。要得到較小的分散度，盡可能選用玻璃量器A級中檢定或校準(zhǔn)容量偏差較小的產(chǎn)品。選用靈敏度較高的儀器，并定期做好電子天平和紫外分光光度計的檢定校準(zhǔn)及日常維護。操作人員應(yīng)熟悉操作方法，在試驗過程中保持操作順暢，同一過程盡可能所用時間相同。同時，能否獲得滿意的重復(fù)性結(jié)果與茶葉中茶多酚含量關(guān)系密切。由于茶樹品種和生長環(huán)境的不同，以及六大茶類不同的生產(chǎn)工藝，使得茶葉中茶多酚含量差異較大，必須綜合考慮茶葉自身的特點，針對不同茶多酚含量科學(xué)制定相對誤差值，才能對其測試結(jié)果一致性進(jìn)行有效判定。

2023年6月中國茶葉出口各國和地區(qū)銷量統(tǒng)計 t