安胃湯含藥血清對胃黏膜腸上皮化生細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬通路的影響

吳德坤，唐友明，鄭景輝，覃樹輝，莫少丹，黃敏燕，呂明艷，吳鴻運(yùn)，梁柳觀，胡鑫（. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 5300；. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 53000）

慢性萎縮性胃炎（Chronic atrophic gastritis，CAG）常伴有胃黏膜腸上皮化生（gastric intestinal metaplasia，GIM），屬于胃癌前病變[1]，GIM是胃黏膜從良性向胃癌轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2-3]。研究[4-5]表明，GIM 患者發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的10 倍，作為與腸型胃癌密切相關(guān)的癌前病變，干預(yù)GIM 是阻斷胃癌發(fā)展的重要路徑，是防治胃癌發(fā)生的關(guān)鍵。

安胃湯來源于名老中醫(yī)林沛湘教授臨床治療慢性胃病的經(jīng)驗(yàn)方劑[6]，具有消痞健胃、行氣化濕、祛瘀止痛的功效。安胃湯臨床治療慢性胃炎、功能性消化不良、胃潰瘍等消化系統(tǒng)疾病療效顯著[7-10]，能有效改善患者的中醫(yī)證候及胃黏膜紅斑、萎縮、腸化生等病變[11-13]。研究表明，安胃湯可逆轉(zhuǎn)胃黏膜腺體萎縮、腸上皮化生以及異型增生[14]，下調(diào)胃黏膜TFF1、TFF2、TFF3 及NF-κB 蛋白表達(dá)[15-17]，上調(diào)胃黏膜GATA-4、GATA-5、GATA-6 mRNA 表達(dá)，發(fā)揮防治CAG 的作用[18]。研究[19-20]顯示，在CAG、GIM以及幽門螺旋桿菌感染中均存在自噬機(jī)制且關(guān)系密切。研究[21]還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）是幽門螺旋桿菌誘導(dǎo)自噬的重要途徑。因此，本研究擬觀察安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞的影響，并基于ERS-自噬通路探討其作用機(jī)制，以期為安胃湯防治GIM的作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司，貨號：CC4026，置于液氮罐保存。

1.2 動物健康SD 大鼠20 只，雌雄各半，SPF 級，體質(zhì)量（200±20）g，購自湖南天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0013，動物質(zhì)量合格證號：430726220100091524，動物使用許可證號SYXK（桂）2019-0001。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物福利倫理委員會審批，批文號：DW20210411-079。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后制備含藥血清。

1.3 藥物及試劑安胃湯處方：黃連3 g、制半夏9 g、干姜3 g、白芍10 g、百合10 g、烏藥6 g、丹參10 g、薏苡仁15 g、甘草5 g、木香5 g，中藥飲片均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室滕建北教授鑒定為正品。取安胃湯處方劑量中藥飲片，加入1 000 mL 蒸餾水，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮30 min，紗布過濾藥液；同法再次煎煮，合并2次濾液，濃縮至含生藥量為2 g·mL-1的安胃湯藥液，備用。

鵝去氧膽酸（CDCA），上海麥克林生化科技有限公司，批號：C 804610；0.25% 胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司，貨號：T1300；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司，貨號：11011-8611；RPMI 1640 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司，貨號：C811875500BT； ATF6 兔多克隆抗體（貨號：A00655）、VILLIN 兔多克隆抗體（貨號：PB9457）、MUC2 兔多克隆抗體（貨號：BM5029）、CDX2 兔多克隆抗體（貨號：MA00877），均購自武漢博士德生物工程有限公司；GRP78 兔多克隆抗體（批號：ab103742）、LC3 兔多克隆抗體（批號：ab32516）、Beclin1 兔多克隆抗體（批號：ab101314），均購自英國Abcam 公司；Annexin V-PE 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，美國BD 公司，批號： 559763；細(xì)胞周期檢測試劑盒，江蘇隆基生物公司，貨號：KGA512；BeyoRTTMⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒（RNase H-），上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：D7168M。

1.4 主要儀器A2-6A1 型生物安全柜、CLM-170B-8-NF 型二氧化碳培養(yǎng)箱，新加坡ESCO 公司；TD5A-WS 型醫(yī)用離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Countess II FL 型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；DMi8 型熒光倒置顯微鏡，德國Leica 公司；ChemiScope6200 Touc 全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器公司；FV3000 型激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus 公司；CFX Connect型定時定量熒光PCR 儀，上海柏辰生物科技公司；HALO MPR96 型酶標(biāo)儀，英國Dynamica 公司；Cytoflex 流式細(xì)胞儀，美國貝爾曼庫特爾公司；PowerPac Universal通用電泳儀，美國伯樂公司。

1.5 安胃湯含藥血清制備取健康SD 大鼠20 只，隨機(jī)分為空白組及安胃湯低、中、高劑量組（5.4、10.7、21.4 g·kg-1·d-1），每組5 只。大鼠給藥劑量參照人與大鼠體表面積比值計(jì)算。各組大鼠灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)7 d，空白組大鼠灌胃等容積生理鹽水。大鼠末次給藥前禁食不禁水12 h，給藥2 h后用異氟烷麻醉，無菌條件下腹主動脈采血；靜置2 h后，以3 040×g離心5 min，0.22 μm 濾膜過濾后分裝至1.5 mL凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 GIM 細(xì)胞模型復(fù)制[22-23]常規(guī)方法培養(yǎng)GES-1細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞調(diào)整濃度為3×105個·mL-1；接種于6 孔板，每孔接種體積為2 mL；培養(yǎng)24 h后，更換為無胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%。將CDCA溶解至不含胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，加入GES-1 細(xì)胞培養(yǎng)孔，終濃度為150 μmol·L-1（經(jīng)“1.7”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)鑒定為最佳造模濃度），作為造模組；另設(shè)正常對照組，添加不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h；造模成功后更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 GIM 細(xì)胞模型鑒定[24]采用Western Blot 法檢測腸上皮細(xì)胞的特異因子MUC2、VILLIN、CDX2 蛋白表達(dá)情況，以鑒定GIM 細(xì)胞模型。GES-1 細(xì)胞培養(yǎng)及接種同“1.6”項(xiàng)，設(shè)置5個實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)4個平行孔；CDCA 干預(yù)濃度分別為0、50、100、150、200 μmol·L-1；藥物干預(yù)24 h后，收集各組細(xì)胞，加入RIPA 充分裂解，以4 ℃、2 810×g離心5 min，收集上清液；采用BCA法測定總蛋白濃度。取40 μg蛋白加入緩沖液變性后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜；用5%脫脂奶粉封閉后，分別加入1∶1 000 比例稀釋后的相應(yīng)一抗，4 ℃下孵育過夜；TBST 洗滌后，加入二抗，室溫下孵育2 h；采用ECL 發(fā)光試劑在凝膠成像分析系統(tǒng)顯影，掃描；采用ImageJ 軟件對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH 為內(nèi)參，對目的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。

1.8 細(xì)胞分組及干預(yù)按照“1.6”項(xiàng)進(jìn)行GIM 細(xì)胞模型復(fù)制，造模成功后繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%；將細(xì)胞分為正常對照組（未經(jīng)CDCA 干預(yù)的GES-1 細(xì)胞）、模型組及安胃湯低、中、高劑量組；正常對照組、模型組每孔加入2 mL 含10%空白血清的培養(yǎng)基，安胃湯低、中、高劑量組每孔加入2 mL含10%安胃湯低、中、高劑量含藥血清的培養(yǎng)基；各組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.9 MTT 法檢測細(xì)胞增殖活力實(shí)驗(yàn)分組同“1.8”項(xiàng)，將各組細(xì)胞接種到96孔板，細(xì)胞濃度為1×105個·mL-1，每孔接種體積200 μL；置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3 d；在細(xì)胞對數(shù)生長期，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相應(yīng)空白或含藥血清干預(yù)，每組設(shè)6個平行孔；藥物干預(yù)24 h 后，各孔加入濃度為5 mg·mL-1的MTT 溶液25 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，37 ℃下振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度值。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分組及干預(yù)同“1.8”項(xiàng)，每組設(shè)4個平行孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞；收集細(xì)胞于離心管中，用預(yù)冷的75%乙醇在4 ℃下固定2 h；離心吸棄乙醇，細(xì)胞沉淀用PBS重懸洗滌；離心后保留細(xì)胞沉淀，向離心管內(nèi)加入500 μL 提前配制的PI/RNase A 染色工作液，重懸細(xì)胞；室溫下避光孵育30～60 min，同時設(shè)置未加染料的陰性對照組；采用流式細(xì)胞儀檢測記錄488 nm 波長處的紅色熒光，利用Modfit LT 5.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡分組及干預(yù)同“1.8”項(xiàng)，每組設(shè)4個平行孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用不含EDTA的胰酶消化，收集細(xì)胞；室溫下以2 810×g離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS 漂洗2 次后，加入100 μL Binding buffer重懸細(xì)胞；轉(zhuǎn)移至5 mL流式管中，加入5 μL PE-Annexin V 和5 μL 7-AAD，室溫下避光孵育15 min；每個流式管中加入200 μL Binding buffer，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.12 免疫熒光法檢測細(xì)胞中ATF6 蛋白表達(dá)水平分組及干預(yù)同“1.8”項(xiàng)，每組設(shè)6 個平行孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，室溫下固定30 min；PBS 洗滌3 次，每次5 min，用200 μL 0.25% Triton X-100 在室溫下透化10 min；PBS 洗滌3 次后，用山羊血清封閉30 min；棄去封閉液（不洗），加入1∶200 比例稀釋的兔抗小鼠ATF6 一抗，4 ℃下孵育過夜；PBS 清洗3 遍后，加入Cy3 標(biāo)記的熒光二抗，避光室溫下孵育1 h；PBS 清洗3 遍后，滴加DAPI，室溫下孵育10 min；PBS清洗3遍后，以水溶性封片劑封片；用激光共聚焦顯微鏡觀察，陽性表達(dá)呈鮮紅色，采用ImageJ 軟件檢測熒光強(qiáng)度，對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.13 RT-qPCR 法檢測細(xì)胞中GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表達(dá)水平分組及干預(yù)同“1.8”項(xiàng)，每組設(shè)4個平行孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol 裂解液，提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA 濃度及純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟操作，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s；60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)水平。

表1 RT-PCR 引物序列表Table 1 Primers sequences for RT-PCR

1.14 Western Blot 法檢測細(xì)胞中GRP78、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及 Beclin1 蛋白表達(dá)水平分組及干預(yù)同“1.8”項(xiàng)，實(shí)驗(yàn)方法同“1.7”項(xiàng)。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Dunnett’s T3法比較；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDCA 對GES-1 細(xì)胞MUC2、VILLIN、CDX2蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖1。與正常對照組（0 μmol·L-1）比較，CDCA 50 、100、150、200 μmol·L-1濃度組GES-1 細(xì)胞的MUC2、VILLIN、CDX2 蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01），表明GES-1 細(xì)胞發(fā)生腸上皮化生。其中以150 μmol·L-1濃度組作用最佳，故采用150 μmol·L-1CDCA作為GIM細(xì)胞模型復(fù)制濃度。

2.2 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見圖2。與正常對照組比較，模型組細(xì)胞的增殖水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，安胃湯含藥血清低、中、高劑量組GIM 細(xì)胞的增殖水平均顯著降低（P＜0.01），且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，安胃湯含藥血清對CDCA 誘導(dǎo)的GIM 細(xì)胞具有增殖抑制作用。

圖2 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞增殖的影響（ ±s，n=6）Figure 2 Effect of Anwei Decoction-containing serum on the proliferation of GIM cells（ ±s，n=6）

2.3 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞周期的影響結(jié)果見圖3。與正常對照組比較，模型組細(xì)胞在G2/M 期的細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01），在G0/G1 期和S 期的細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，安胃湯含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞在G2/M期的細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.01），在G0/G1 期和S 期的細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果表明，安胃湯含藥血清可將GIM細(xì)胞周期阻滯在S期，影響細(xì)胞周期運(yùn)行，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

圖3 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞周期的影響（ ±s，n=4）Figure 3 Effect of Anwei Decoction-containing serum on GIM cell cycle（ ±s，n=4）

2.4 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見圖4。與正常對照組比較，模型組細(xì)胞的凋亡率顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，安胃湯含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01），且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，安胃湯含藥血清能夠誘導(dǎo)GIM細(xì)胞凋亡。

圖4 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞凋亡的影響（ ±s，n=4）Figure 4 Effect of Anwei Decoction-containing serum on GIM cells apoptosis（ ±s，n=4）

2.5 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞ATF6 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖5。與正常對照組比較，模型組細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的紅色熒光顯著減弱（P＜0.01）。與模型組比較，安胃湯含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的紅色熒光顯著增強(qiáng)（P＜0.01），且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，安胃湯含藥血清可上調(diào)GIM細(xì)胞中ATF6蛋白表達(dá)。

圖5 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞ATF6 蛋白表達(dá)的影響（免疫熒光染色，×400； ±s，n=6）Figure 5 Effects of Anwei Decoction-containing serum on protein expression of ATF6 in GIM cells（IF staining，×400； ±s，n=6）

2.6 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表達(dá)的影響結(jié)果見圖6。與正常對照組比較，模型組細(xì)胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，安胃湯含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，安胃湯含藥血清可上調(diào)GIM細(xì)胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA表達(dá)。

圖6 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞GRP78、LC3-Ⅱ、Beclin1 mRNA 表達(dá)的影響（ ±s，n=4）Figure 6 Effect of Anwei Decoction-containing serum on the mRNA expressions of GRP78，LC3-Ⅱand Beclin1 in GIM cells（ ±s，n=4）

2.7 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞GRP78、Beclin1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖7。與正常對照組比較，模型組細(xì)胞GRP78、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，安胃湯含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞GRP78、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），且呈劑量依賴性。結(jié)果表明，安胃湯含藥血清可能通過上調(diào)GIM 細(xì)胞GRP78、Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬與凋亡。

圖7 安胃湯含藥血清對GIM 細(xì)胞GRP78、Beclin1 及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)影響（ ±s，n=4）Figure 7 Effect of Anwei Decoction-containing serum on protein expressions of GRP 78，Beclin1 and LC3Ⅱ/Ⅰin GIM cells（ ±s，n=4）

3 討論

中醫(yī)將慢性萎縮性胃炎（CAG）歸屬于“胃脘痛”“痞滿”“反酸”“嘈雜”等范疇，主要病因?yàn)橥飧辛皻?、?nèi)傷飲食、情志郁結(jié)等導(dǎo)致脾胃升降失調(diào)、中焦氣機(jī)不利[25-26]。CAG易伴發(fā)胃黏膜腸上皮化生（GIM）及不典型增生病變[27]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，有36%的慢性淺表性胃炎（CSG）患者轉(zhuǎn)變?yōu)镚IM，1%轉(zhuǎn)變?yōu)槲赴?，CSG、CAG 和GIM 均是公認(rèn)的胃癌前病變，嚴(yán)重危害人類的健康[28]。幽門螺旋桿菌（Hp）感染、膽汁反流是GIM 重要的發(fā)病因素，并且在癌變發(fā)展過程中起重要作用[29]。自噬在Hp 感染中的作用復(fù)雜，能夠誘導(dǎo)自噬以促進(jìn)其復(fù)制[30]。自噬在感染應(yīng)答中具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞效應(yīng)物、細(xì)胞因子產(chǎn)生和控制炎癥的關(guān)鍵作用[31]。研究表明，Hp 感染時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）水平明顯降低，Hp 被根除后葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）上調(diào)，激發(fā)ERS[32]。安胃湯寒熱并用，辛開苦降，具有止痛祛瘀、行氣化濕、暢通氣機(jī)、消痞健胃、平調(diào)寒熱的功效，臨床觀察及實(shí)驗(yàn)研究[33-34]表明，安胃湯治療Hp 陽性的CAG 伴GIM 療效明顯。本研究結(jié)果表明，安胃湯含藥血清可上調(diào)CDCA誘導(dǎo)的GIM細(xì)胞GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)，激發(fā)ERS誘導(dǎo)自噬。

細(xì)胞以分裂方式進(jìn)行增殖，通過細(xì)胞周期表現(xiàn)形式來實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞沿著G0/G1 期→S 期→G2/M 期→G0/G1 期的模式周期性運(yùn)轉(zhuǎn)，任何時期發(fā)生阻滯均可影響到整個細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[35]。本研究結(jié)果顯示，安胃湯含藥血清可將GIM細(xì)胞周期阻滯在S期，并抑制其增殖，誘導(dǎo)其凋亡，且呈劑量依賴性。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，具有最大的膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，主要參與蛋白質(zhì)的修飾、加工以及新生肽鏈的折疊、組裝和運(yùn)輸[36]。其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定對于維持細(xì)胞正常功能至關(guān)重要。GRP78 又稱為BIP 或HSP5，屬于熱休克家族蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白折疊反應(yīng)等過程，能促進(jìn)正常生長狀態(tài)下細(xì)胞蛋白質(zhì)成熟，是維持細(xì)胞機(jī)能和生命的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中重要的分子伴侶。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到應(yīng)激刺激時，會迅速激活GRP78 以結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量蓄積的未折疊或錯誤折疊蛋白，促進(jìn)蛋白折疊和組裝，降解錯誤蛋白，調(diào)節(jié)鈣平衡。GRP78 在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中，與激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）以及肌醇需要的核糖核酸內(nèi)切酶1α（IRE1α）3 個ERS 傳感器結(jié)合，控制ERS 傳感器的激活，因此高表達(dá)的GRP78 可作為ERS 的分子標(biāo)志[37-39]。ATF6 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的感受蛋白，屬于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在ERS 中扮演重要角色。在ERS 狀態(tài)下，GRP78 與蛋白結(jié)合的同時釋放ATF6，介導(dǎo)下游的凋亡途徑[40]，ATF6 通路與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[41]。本研究結(jié)果表明，安胃湯含藥血清可通過上調(diào)GIM 細(xì)胞GRP78、ATF6 蛋白表達(dá)，激發(fā)ERS。

細(xì)胞自噬有利于維持基因的穩(wěn)定性和損害DNA的修復(fù)[42]，是一個復(fù)雜的、多步驟的細(xì)胞自降解過程，在細(xì)胞物質(zhì)周轉(zhuǎn)過程中，既可降解受損細(xì)胞器和錯誤折疊蛋白，又參與細(xì)胞生理代謝，并在生長發(fā)育、饑餓適應(yīng)、宿主-病原體相互作用、細(xì)胞死亡以及腫瘤抑制等方面起重要作用[43]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）是一種成熟的自噬標(biāo)記[44]，主要表現(xiàn)為LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩個亞型。LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺綴合成為LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ與自噬小體的外膜及內(nèi)膜結(jié)合，從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生[45]。自噬效應(yīng)蛋白Beclin1是一種自噬調(diào)控因子，既可以調(diào)節(jié)自噬活性，也可以參與自噬體的形成[46-47]。Beclin1除了作為自噬的特異性基因，還是一種抑癌基因，對腫瘤有抑制作用。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且該作用具有兩面性，對于癌前病變的自噬作用是一種抑制腫瘤發(fā)生的因素，而腫瘤一旦形成后細(xì)胞自噬又轉(zhuǎn)化為促進(jìn)腫瘤生長的因素。Beclin1 作為一個可靠的胃癌預(yù)后指標(biāo)[48-49]，Beclin1高表達(dá)有助于胃癌患者的預(yù)后， Beclin1低表達(dá)與胃癌轉(zhuǎn)移及低分化關(guān)系密切，同時Beclin1 在癌前病變、胃癌中的蛋白表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果表明，CDCA 誘導(dǎo)的GIM 細(xì)胞中Beclin1 蛋白表達(dá)下調(diào)，LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比值降低，而給予安胃湯含藥血清干預(yù)后，可以明顯上調(diào)Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白及mRNA表達(dá)，升高LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比值。

綜上所述，安胃湯含藥血清可將CDCA 誘導(dǎo)的GIM細(xì)胞周期阻滯在S期，并抑制其增殖，誘導(dǎo)其凋亡，可能與其調(diào)控ERS途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬相關(guān)。