加味小青龍湯合達(dá)原飲治療新型冠狀病毒感染的療效總結(jié)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

盧洪梅，李耿，葉欣桐，羅藝佳，魏澤蔚，鐘月圓，羅怡鈺，賴艷妮，阮永隊(duì) （. 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院，廣東 東莞 5700；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 50006；. 廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 5808）

2022年2 月至4月，東莞市第九人民醫(yī)院收治了大量新型冠狀病毒感染（COVID-19）患者，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、咳嗽，伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌肉酸痛、納差、惡心、腹瀉、腹脹等癥狀，舌象以舌質(zhì)淡較多，厚膩苔，甚至腐苔，苔色黃或白，舌體偏胖大，有齒痕。其臨床表現(xiàn)符合中醫(yī)寒濕疫的辨證特點(diǎn)，病機(jī)可概括為寒濕疫毒內(nèi)盛，肺脾陽氣虛弱，寒飲阻肺，寒濕困脾。寒濕疫毒乘肺脾陽氣之虛，從口、鼻、眼結(jié)膜而入，傷及肺衛(wèi)或直中太陰。寒濕疫毒與衛(wèi)氣相搏，表現(xiàn)出發(fā)熱；寒濕直中太陰，出現(xiàn)腹瀉等癥；寒濕困脾，出現(xiàn)不欲飲食、乏力、腹脹、惡心；寒毒損傷肺衛(wèi)，肺中津液受寒，化為水飲，瘀阻肺絡(luò)，出現(xiàn)咳嗽。廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院中醫(yī)研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合前期臨床成果[1-2]，基于該病發(fā)病的病因病機(jī)，擬定加味小青龍湯合達(dá)原飲用于治療COVID-19。加味小青龍湯合達(dá)原飲由熟附子、干姜、麻黃、苦杏仁、姜半夏、黃芩、厚樸等組成，功效溫陽扶正、散寒化飲、祛痰解毒。臨床觀察到該方對(duì)于控制COVID-19癥狀具有明顯的臨床療效，且優(yōu)于常規(guī)綜合治療。故對(duì)其治療COVID-19 的臨床療效進(jìn)行回顧性總結(jié)，并用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床總結(jié)

1.1.1 一般資料 病例來源于東莞市第九人民醫(yī)院（為東莞市衛(wèi)生健康局指派廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院中醫(yī)醫(yī)療組駐點(diǎn)支援單位）2022 年2 月至4 月間確診為COVID-19患者，回顧性收集病例的臨床資料、治療方案及臨床療效。將患者按照治療方案分為加味小青龍湯合達(dá)原飲組（治療組）和常規(guī)治療組（對(duì)照組）。治療組121 例，女性71 例，男性50 例，平均年齡（46±14）歲；對(duì)照組115例，女性63例，男性52例，平均年齡（45±13）歲。兩組病例性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡18周歲以上；符合新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版修訂版）的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，臨床分型為輕型和普通型，中醫(yī)辨證為寒濕阻肺證型。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)重肝腎功能不全的患者、懷孕或者哺乳期婦女、精神病患者、同一指標(biāo)治療前后數(shù)據(jù)不全的患者；體溫≥38.5 ℃；對(duì)藥物成分過敏者；依從性較差者。

1.1.4 干預(yù)措施 對(duì)照組患者給予物理降溫，解熱、祛痰止咳、抗感染藥物等常規(guī)綜合治療。治療組患者在常規(guī)綜合治療的基礎(chǔ)上，給予加味小青龍湯合達(dá)原飲（熟附子10 g，干姜5 g，炙甘草15 g，麻黃5 g，苦杏仁5 g，桂枝10 g，白芍10 g，細(xì)辛5 g，五味子5 g，姜半夏10 g，檳榔10 g，草果10 g，黃芩5 g，厚樸10 g 組成），每日一劑，水煎至300 mL，分3次溫服，兩組療程均為7 d。

1.1.5 臨床療效評(píng)價(jià) 治療1 周后，以病毒檢測(cè)轉(zhuǎn)陰率[3]為臨床療效評(píng)價(jià)指標(biāo)，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)N基因和ORF 基因循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct 值）均≥35判定為陰性（熒光定量PCR方法）。

1.1.6 中醫(yī)證候療效評(píng)價(jià) 中醫(yī)證候包括發(fā)熱、惡寒、乏力、咳嗽、咳痰、鼻塞、流涕、咽痛、肌肉酸痛、納差、惡心、腹瀉、腹脹，厚膩苔。每個(gè)癥狀按無、輕、中、重分別評(píng)0～3分，分值越高，癥狀越嚴(yán)重。顯效：患者臨床癥狀明顯緩解，療效指數(shù)≥70%。有效：臨床癥狀有所緩解，30%≤療效指數(shù)＜70%。無效：臨床癥狀改善未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)者?？傆行?（顯效例數(shù)＋有效例數(shù)）/總病例數(shù)×100%。

1.1.7 觀察指標(biāo) ①炎癥指標(biāo)：C 反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）等。②退熱指標(biāo)：體溫（腋溫），治療后每30 min 測(cè)量1 次并記錄，體溫降至正常后每2 h 測(cè)量1 次并記錄。退熱時(shí)間：從治療開始至體溫降至正常（≤37.2 ℃），不再反彈超過24 h。

1.1.8 不良反應(yīng)觀察 記錄治療期間不良事件和血常規(guī)、凝血功能、心肌酶、肝腎功能。

1.1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，治療前后比較用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.2.1 加味小青龍湯合達(dá)原飲活性成分及其靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中檢索加味小青龍湯合達(dá)原飲組方中藥熟附子、干姜、炙甘草、麻黃、苦杏仁、桂枝、白芍、細(xì)辛、五味子、姜半夏、檳榔、草果、黃芩、厚樸的化學(xué)成分。同時(shí)以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，篩選其活性成分。通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取各活性成分的SMILES號(hào)，利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測(cè)活性成分的潛在靶點(diǎn)，以Probability≥0.20 為篩選條件，獲得活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）規(guī)范所得靶點(diǎn)的基因名稱并去重。

1.2.2 COVID-19 疾病靶點(diǎn)的獲取 以COVID-19 和SARS-CoV-2 為關(guān)鍵詞，分別在PubChem 數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、 DisGeNEt 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org/）等6 個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲取COVID-19 的相關(guān)疾病靶點(diǎn)。其中，GeneCards 數(shù)據(jù)庫以score≥2為篩選條件，DisGeNEt數(shù)據(jù)庫以N.PMIDs＞1為篩選條件，其余4 個(gè)數(shù)據(jù)庫所得疾病靶點(diǎn)直接采用，最后利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫規(guī)范疾病靶點(diǎn)的基因名稱并去重。通過Immport 數(shù)據(jù)庫（https://www.immport.org/shared/home）獲得免疫相關(guān)基因集，即免疫相關(guān)靶點(diǎn)。將活性成分靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)、免疫相關(guān)靶點(diǎn)取交集，繪制藥物-疾病-免疫相關(guān)交集靶點(diǎn)韋恩（Venn）圖。

1.2.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選 將交集靶點(diǎn)上傳至String 11.5 數(shù)據(jù)庫（https://string- db.org）， 將物種選擇為“Homo sapiens”“Highest confiden＞0.4”，其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。獲得靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系并導(dǎo)出TSV 文件，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 軟件中進(jìn)行可視化，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖；并使用其插件Network Analyze 分析PPI 拓?fù)鋮?shù)，以度值（Degree）排前10位的靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。

1.2.4 GO功能與KEGG通路富集分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org），對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能及KEGG 通路富集分析，選定物種為“Homo sapiens”。GO 功能分析包括生物過程（Biological Process， BP）、 細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。選取GO功能及KEGG通路富集分析結(jié)果中l(wèi)og10（P值）排前10 位的條目，通過R 4.1.1 分別繪制柱狀圖。

1.2.5 構(gòu)建“活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建加味小青龍湯合達(dá)原飲“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape軟件中的CytoNCA插件，分析其網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)，包括度值（Degree）、介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）、接近中心性（Closeness Centrality）、聚類系數(shù)（Clustering Coefficient）、平均最短路徑長(zhǎng)度（Average Shortest Path Length）等，并選取Degree 值排前5 位的活性成分作為主要活性成分。

1.2.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)與主要活性成分的分子對(duì)接分析 應(yīng)用PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）檢索并下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)PDB 格式文件，并使用全自動(dòng)蛋白質(zhì)結(jié)果同源建模服務(wù)器（Swiss-model）進(jìn)行同源建模以補(bǔ)全丟失的環(huán)區(qū)（Loop）。同時(shí)，從PubChem 數(shù)據(jù)庫中檢索并下載“活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中Degree值前10 位的活性成分的3D 結(jié)構(gòu)PDB 文件。使用Autodock Tools 1.5.6 和Autodock Vina 1.1.2 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接盒子中心坐標(biāo)為受體中原配體的中心坐標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效比較治療1周后，對(duì)照組患者病毒檢測(cè)轉(zhuǎn)陰29 例，轉(zhuǎn)陰率為25.2%，治療組患者病毒檢測(cè)轉(zhuǎn)陰38 例，轉(zhuǎn)陰率為31.4%，兩組患者轉(zhuǎn)陰率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組新型冠狀病毒感染患者治療1 周后轉(zhuǎn)陰率比較Table 1 Comparison of negative conversion rates between two groups of patients infected with COVID-19 after one week of treatment

2.2 兩組中醫(yī)證候療效比較治療組患者中醫(yī)證候療效顯效率為24.0%（29/121），總有效率為87.6%（106/121），均顯著高于對(duì)照組的12.2%（14/115）和66.1%（76/115）（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組新型冠狀病毒感染患者中醫(yī)證候療效比較[例（%）]Table 2 Comparison on curative effect of traditional Chinese medicine syndrome between two groups of patients infected with COVID-19[case（%）]

2.3 兩組炎癥指標(biāo)比較治療前組患者外周白細(xì)胞數(shù)及CRP 和IL-6水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與治療前比較，兩組患者治療后外周血白細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組患者CRP 和IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），且治療組患者CRP和IL-6水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組新型冠狀病毒感染患者炎癥指標(biāo)結(jié)果比較（ ±s）Table 3 Comparison of inflammatory indexes between two groups of patients infected with COVID-19（ ±s）

表3 兩組新型冠狀病毒感染患者炎癥指標(biāo)結(jié)果比較（ ±s）Table 3 Comparison of inflammatory indexes between two groups of patients infected with COVID-19（ ±s）

注：與治療前比較，△P＜0.05；與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組治療組例數(shù)/例115 121 WBC/（×109·L-1）治療前6.55±1.68 6.28±1.46治療后17.72±1.62△12.16±2.27*△治療后6.38±1.64 6.21±1.42 IL-6/（pg·mL-1）治療前9.01±1.42 9.02±1.28治療后5.97±0.71△4.64±1.00*△CRP/（mg·L-1）治療前34.35±4.67 33.72±5.09

2.4 退熱時(shí)間比較治療后，治療組體溫降至正常患者的百分率為87.6%（106/121），明顯高于對(duì)照組的66.1%（76/115）（P＜0.05）。治療組患者完全退熱時(shí)間明顯短于對(duì)照組（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組新型冠狀病毒感染患者完全退熱時(shí)間比較（ ±s）Table 4 Comparison of the time to complete relief of fever between two groups of patients infected with COVID-19（ ±s）

表4 兩組新型冠狀病毒感染患者完全退熱時(shí)間比較（ ±s）Table 4 Comparison of the time to complete relief of fever between two groups of patients infected with COVID-19（ ±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

退熱時(shí)間/h 57.13±9.42 33.99±8.87*組別對(duì)照組治療組例數(shù)/例115 121體溫/[例（%）]≤37.2 ℃76（66.1）106（87.6）*＞37.2 ℃39（33.9）15（12.4）*

2.5 兩組不良反應(yīng)比較治療期間，對(duì)照組出現(xiàn)惡心4 例，輕度腹瀉2 例，納差2 例，不良事件發(fā)生率為6.96%；治療組出現(xiàn)頭暈1 例，惡心3 例，輕度腹瀉3 例，納差2 例，不良事件總發(fā)生率為5.79%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者未經(jīng)特殊治療，不適癥狀均自行緩解。兩組治療前后血常規(guī)、凝血功能、心肌酶、肝腎功能均無異常變化，提示加味小青龍湯合達(dá)原飲治療COVID-19的安全性較好。

2.6 加味小青龍湯合達(dá)原飲的活性成分及其靶點(diǎn)的獲取共獲得加味小青龍湯合達(dá)原飲組方中藥的活性成分101 個(gè)，其中炙甘草18 個(gè)、麻黃13 個(gè)、熟附子5 個(gè)、苦杏仁9 個(gè)、草果7 個(gè)、黃芩15 個(gè)、檳榔4 個(gè)、干姜2個(gè)、白芍5個(gè)、桂枝6個(gè)、細(xì)辛2個(gè)、姜半夏10個(gè)、五味子1個(gè)、厚樸4個(gè)；對(duì)應(yīng)的活性成分靶點(diǎn)共220 個(gè)。 從GeneCards、 TTD、 Disgenet、DrugBank、PharmGKB、PubChem 數(shù)據(jù)庫分別獲得疾病靶點(diǎn)1 346、65、765、21、4 和215 個(gè)。將所得靶點(diǎn)通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證，去重后得到COVID-19相關(guān)疾病靶點(diǎn)2 004個(gè)。通過Immport數(shù)據(jù)庫收集免疫相關(guān)基因靶點(diǎn)，去重后得到1 793個(gè)免疫相關(guān)靶點(diǎn)。將加味小青龍湯合達(dá)原飲的預(yù)測(cè)成分靶點(diǎn)、COVID-19 的疾病靶點(diǎn)和免疫相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得交集靶點(diǎn)34 個(gè)，作為加味小青龍湯合達(dá)原飲治療COVID-19的相關(guān)靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 加味小青龍湯合達(dá)原飲治療新型冠狀病毒感染的藥物成分-疾病-免疫相關(guān)靶點(diǎn)交集的韋恩（Venn）圖Figure 1 Venn diagram for intersection of related targets of drug components-diseases-immune

2.7 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的獲得將34 個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至String 11.5 數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.7.0優(yōu)化加味小青龍湯合達(dá)原飲治療COVID-19 靶蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)。以Degree值為指標(biāo)，繪制Degree值-節(jié)點(diǎn)相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)圖，即節(jié)點(diǎn)的大小由degree值決定。degree值越大說明該蛋白重要性越大。見圖2。將Degree值排前10 位的靶點(diǎn)作為網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)，包括AKT1、VEGFA、 EGFR、 MMP9、 PTGS2、 PPARG、 IL2、ICAM1、RELA、PIK3R1。見表5。

圖2 加味小青龍湯合達(dá)原飲治療新型冠狀病毒感染交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 PPI network of intersection targets of Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction in treating COVID-19

表5 加味小青龍湯合達(dá)原飲治療新型冠狀病毒感染核心靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)Table 5 Network topological parameters of the key targets of modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction in treating COVID-19

2.8 GO 功能和KEGG 通路富集分析將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析。分子功能（Molecular Function，MF）富集結(jié)果FDR 值前3 位包括核受體活性（nuclear receptor activity）、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性（ligand-activated transcription factor activity）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）。 生物過程（Biological Process，BP）富集結(jié)果FDR 值前3位包括正向調(diào)節(jié)蛋白磷酸化（positive regulation of protein phosphorylation）、激素反應(yīng)（response to hormone）、細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)（cellular response to hormone stimulus）。細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）富集結(jié)果FDR 值前3 個(gè)包括膜筏（membrane raft）、 膜微域（membrane microdomain）、 受體復(fù)合物（receptor complex）。KEGG 通路富集結(jié)果中FDR 值前5 位包括癌癥通路（Pathways in cancer）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、 Ras 信號(hào)通路（Ras signaling pathway）、前列腺癌（Prostate cancer）、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）。見圖3。結(jié)果提示加味小青龍湯合達(dá)原飲可通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮治療COVID-19 的作用。

圖3 加味小青龍湯合達(dá)原飲治療新型冠狀病毒感染的交集靶點(diǎn)的富集分析Figure 3 Enrichment analysis of intersection targets of Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction in treating COVID-19

2.9 構(gòu)建“中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)性質(zhì)能為藥物-靶點(diǎn)相互作用機(jī)制提供重要信息。將加味小青龍湯合達(dá)原飲的活性成分及其作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 軟件繪制和分析“中藥-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（見圖4），結(jié)果顯示該網(wǎng)絡(luò)中共有114個(gè)節(jié)點(diǎn)和223條相互關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)中某些節(jié)點(diǎn)比其他節(jié)點(diǎn)更為集中，即藥物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)偏向某些化合物和蛋白質(zhì)。從表6可知，參與高度連接的分子或靶點(diǎn)在加味小青龍湯合達(dá)原飲治療COVID-19的作用機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。

圖4 加味小青龍湯合達(dá)原飲中藥-活性成分-靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)Figute 4 Visual network of herbs in Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction-active ingredients-targets

表6 加味小青龍湯合達(dá)原飲主要活性成分基本信息Table 6 Basic information of main active ingredients in Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction

2.10 分子對(duì)接結(jié)果將獲得的10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)與“活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值前5 位的主要活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。最低結(jié)合效能小于-5 kcal·mol-1的共有40 對(duì)。見表7。結(jié)果顯示，其核心活性成分與AKT1、EGFR、 PPARG、PTGS2親和力均較好。

表7 加味小青龍湯合達(dá)原飲核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果Table 7 Molecular docking results of the core active ingredients and key targets of Modified Xiaoqinglong Decoction and Dayuan Decoction

3 討論

中醫(yī)藥在治療COVID-19的過程中發(fā)揮了重要的作用。2022 年2 月至4 月期間在東莞地區(qū)爆發(fā)的COVID-19 的疫情，符合中醫(yī)寒濕疫的臨床辨證特點(diǎn)。本研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合李可老中醫(yī)重用制附子等溫陽思路[4]，基于寒濕疫論治COVID-19 的機(jī)理，選用小青龍湯、四逆湯、達(dá)原飲加減，擬定加味小青龍湯合達(dá)原飲治療COVID-19。小青龍湯、四逆湯均源自東漢張仲景所撰《傷寒論》。小青龍湯具有解表散寒、溫肺化飲的功效，能顯著減少炎性細(xì)胞的數(shù)量、抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，通過抑制Th2細(xì)胞亞群而抑制炎癥反應(yīng)，具有良好的抗過敏、抗炎、止咳平喘的作用[5]。四逆湯具有回陽救逆、溫中祛寒之功，能有效改善患者陽虛體質(zhì)，以扶正抗邪。達(dá)原飲出自于明代疫病學(xué)家吳又可的《溫疫論》，為溫疫穢濁毒邪伏于膜原而設(shè)，具有抗病毒、解熱、抗炎作用，已應(yīng)用于COVID-19 濕邪郁肺證的治療[6]。三方合用形成的加味小青龍湯合達(dá)原飲，共奏溫陽扶正、散寒化飲、祛痰解毒之功，對(duì)COVID-19患者發(fā)熱、咳嗽有十分顯著的療效，能有效防止患者進(jìn)展為重癥肺炎[7-8]。

本研究納入236 例寒濕阻肺證型COVID-19 患者，治療組加用加味小青龍湯合達(dá)原飲后，完全退熱療效明顯優(yōu)于對(duì)照組，退熱更快，不易復(fù)升；治療組中醫(yī)證候顯效率和總有效率均優(yōu)于對(duì)照組，顯示該方可明顯改善COVID-19患者臨床癥狀，能促進(jìn)疾病恢復(fù)，且安全性較好。

CRP、IL-6是血清學(xué)炎癥指標(biāo)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時(shí)可迅速升高。CRP在感染后4～6 h迅速升高，40～50 h 到達(dá)峰值，最高可達(dá)正常生理狀態(tài)的1 000 倍。IL-6 為單核細(xì)胞活化后釋放，用于提示炎癥感染的輕重程度及預(yù)后。IL-6 比CRP 升高更早、下降更快、幅度更大，可以更加迅速地反映患者病情變化[9]。阮永隊(duì)等[10]以脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥模型觀察加味小青龍湯的抗炎作用，結(jié)果顯示其可顯著抑制IL-6 mRNA 表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后治療組CRP、IL-6 均明顯下降，且優(yōu)于對(duì)照組，說明加味小青龍湯合達(dá)原飲有抗炎或輔助抗炎的作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，加味小青龍湯合達(dá)原飲治療COVID-19 的主要活性成分為木犀草素、異鼠李素、山柰酚、檞皮素和草質(zhì)素，均為黃酮類成分。研究[11]證實(shí)，木犀草素可以特異性結(jié)合新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）表面刺突蛋白，抑制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并抑制SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的表達(dá)。異鼠李素可直接與SARS-CoV-2 的受體ACE2 結(jié)合，防止SARS-CoV-2 病毒進(jìn)入和感染，抑制表達(dá)ACE2 的細(xì)胞，起到直接的抗病毒作用[12]。木犀草素可抑制TNF-α 激活的內(nèi)皮細(xì)胞中IL-6的生成，有抗氧化的作用，調(diào)節(jié)病毒刺激的肥大細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和組胺引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴，還可抑制PI3K/Akt介導(dǎo)的NF-κB和MAPK 的信號(hào)通路，下調(diào)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和COX-2 的基因表達(dá)，來緩解炎癥反應(yīng)[13]。檞皮素和草質(zhì)素可以阻斷SARS-CoV-2 3CL 蛋白酶的水解活性，干擾病毒感染[14-15]。另外，檞皮素和異鼠李素也能抑制NF-κB 信號(hào)通路，有效降低炎癥因子水平[16-17]。因此黃酮類化合物可通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化來平衡機(jī)體的免疫系統(tǒng)和調(diào)節(jié)SARS-CoV-2感染期間的細(xì)胞因子風(fēng)暴來治療COVID-19，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方劑治療COVID-19有潛在作用。

PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲲@示，加味小青龍湯合達(dá)原飲能夠通過作用于EGFR、RELA、ICAM-1、MMP9 等核心靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用。SARS-CoV-2 感染可活化EGFR 介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞并抑制干擾素信號(hào)傳導(dǎo)，因此靶向抑制EGFR，可發(fā)揮其抗病毒作用[18]。RELA 是NF-κB/Ral 蛋白家族中的重要成員，而SARS-CoV-2 中的非結(jié)構(gòu)蛋白能夠激活NF-κB 信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)促發(fā)炎性因子風(fēng)暴，靶向RELA 阻斷炎性因子風(fēng)暴的產(chǎn)生是防治COVID-19 的有效途徑[19]。ICAM-1 是炎癥細(xì)胞聚集在炎癥部位最重要的黏附分子，可增加白細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，引起炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。肺組織間的炎癥細(xì)胞分泌大量的炎性介質(zhì)，誘導(dǎo)肺部炎癥致內(nèi)皮-上皮屏障的破壞，增加了肺泡毛細(xì)血管膜的通透性，肺部浸潤(rùn)和水腫[20]。同時(shí)，MMP9由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，其可促進(jìn)炎癥和肺泡毛細(xì)血管屏障的降解[21]。因此，降低ICAM-1 和MMP9 的表達(dá)和分泌，可有效保護(hù)肺泡上皮-內(nèi)皮屏障，緩解肺部炎癥。分子對(duì)接結(jié)果顯示，加味小青龍湯合達(dá)原飲活性成分與核心靶點(diǎn)間具有較好的結(jié)合活性，提示加味小青龍湯合達(dá)原飲可通過靶向這些核心靶點(diǎn)發(fā)揮抗病毒、抗炎和保護(hù)肺泡上皮-內(nèi)皮屏障的作用，從而達(dá)到防治COVID-19的目的。

KEGG信號(hào)通路富集分析顯示，加味小青龍湯合達(dá)原飲治療COVID-19 的主要作用與PI3K-Akt 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路等相關(guān)。PI3K-Akt 信號(hào)通路能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，在肺和氣道的慢性炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。同時(shí)，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）激活PI3K-Akt通路，觸發(fā)TGF-β1 活化和R-Smad 蛋白（Smad 2/3）磷酸化，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞過度增殖和分化[22-23]。ACE2表達(dá)下調(diào)，可拮抗RAS 系統(tǒng)的激活，降低危重癥COVID-19 患者的心血管死亡率[24]。MAPK 過度激活可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子L-1β、IL6、IL10、TNF-α、L4和INF-γ的大量生成，引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致肺泡組織受傷、肺通氣減少、急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征[25]。這些信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和炎癥因子的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)上述信號(hào)通路可減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，加味小青龍湯合達(dá)原飲治療COVID-19療效確切，能顯著改善患者炎性指標(biāo)，緩解患者癥狀。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究結(jié)果表明，加味小青龍湯合達(dá)原飲可通過多活性成分、多靶點(diǎn)、多通路抑制病毒感染，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗COVID-19的藥理作用。但本研究?jī)H從數(shù)據(jù)分析角度進(jìn)行預(yù)測(cè)，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。