黑老虎種子質(zhì)量檢驗方法研究

曾偉光，劉情，劉舒璇，蔡桂澤，王杰鴻，覃仁安，陳明權(quán)，詹若挺，何瑞（. 廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，廣東 廣州 50006；. 廣州白云山陳李濟藥廠有限公司，廣東 廣州 5088）

廣東地區(qū)常用中藥黑老虎具有行氣止痛，通絡(luò)散瘀等功效，來源于木蘭科南五味子屬植物黑老虎Kadsuracoccinea（Lem.）A. C. Smith 的根或藤[1]。黑老虎根、果實、種子富含木脂素類和三萜類化合物等成分[2-5]，同時其果實色艷、花多，枝葉常年綠色，適用于綠化園藝[6]。由于市場對藥材的需求增加，野生黑老虎資源急劇減少[7-8]，近年來黑老虎成為南方規(guī)?；N植的熱門品種。然而黑老虎繁殖效率低，藥材產(chǎn)量低且差異顯著[3]。性狀穩(wěn)定、質(zhì)量優(yōu)良的種子是規(guī)范化繁殖和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)黑老虎的物質(zhì)基礎(chǔ)[9-10]。因此迫切需要參考《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》[11]，研究建立黑老虎種子檢驗方法和質(zhì)量分級標準。

1 材料與方法

1.1 材料實驗用黑老虎種子均由廣州白云山陳李濟藥廠有限公司提供，批號分別為：202011-A、202011-B、202111-A和202111-B，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學詹若挺研究員鑒定為木蘭科南五味子屬植物黑老虎Kadsuracoccinea（Lem.）A. C. Smith 種子。其中種子發(fā)芽條件優(yōu)化所用種子（202011-A和202011-B）于2021 年1 月采購，其他試驗所用種子（202111-A 和202111-B）于2021 年11 月采集。赤霉素（Gibberellic acid 3， GA3）、 紅四氮唑（2，3，5- triphenyl tetrazolium chloride，TTC），上海麥克林生化科技股份有限公司；氯化鈣（CaCl2），上海畢臣生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種子扦樣和凈度分析 參照GB/T 3543.1-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》[11]執(zhí)行。

1.2.2 種子播前處理方法考察及發(fā)芽試驗 參照GB/T 3543.1-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》[11]和黑老虎發(fā)芽相關(guān)文獻，設(shè)計種子播前處理方法：a. 1% CaCl2+100 mg·L-1GA3溶液浸種12 h[13]；b. 30 mg·L-1GA3溶液浸種48 h[14]；c. 40 ℃純水浸種2 h，室溫純水浸種10 h[15]。各處理方法均同時分別處理202011-A 和202011-B 兩批種子100 顆。由于黑老虎種子營養(yǎng)極豐富[5]，種皮、種仁間常有空隙，難以徹底消毒。預實驗發(fā)現(xiàn)，采用濾紙、濕砂等常用介質(zhì)進行發(fā)芽，均出現(xiàn)種子嚴重霉變和腐敗，無法完成發(fā)芽過程的情況，故選有機園藝土為發(fā)芽基質(zhì)。播種后放置于常溫（10 ～26 ℃）植物培養(yǎng)實驗室中培養(yǎng)，發(fā)芽實驗周期為兩個月（2021 年2 月1 月至2021 年4 月1 日），定期觀察，及時清除霉爛、壞死種子。發(fā)芽判定標準為2片子葉完全伸展及1片真葉芽。試驗期間每隔5 ～7 d觀察并記錄1次發(fā)芽情況，試驗結(jié)束后統(tǒng)計發(fā)芽率。

1.2.3 生活力測定方法 參照GB/T3543.1～3543.7-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》實施指南[12]及種子生活力測定方法[15-17]，選用四唑染色法（Tetrazolium Test，TTC 法）對采收后冰箱冷藏6 周左右的202111-A 和202111-B 兩批黑老虎種子進行生活力測定。稱取適量TTC 溶于pH6.5～7.5 的磷酸緩沖液中配制成0.3%，0.6%和1.0% 的TTC 溶液[18]。以前期預實驗確定的種子預措（去皮后穿刺）及預濕（室溫純水浸泡6 h）方法處理的種子為材料，設(shè)計L9（33）正交表（見表1），對染色溫度、時間和TTC濃度進行考察。每實驗4 個重復，每重復20 粒種子；熱水煮沸一組10 粒種子作為對照。染色結(jié)束后，倒去TTC 溶液，純水沖洗后觀察。判斷標準：結(jié)合對照組染色情況和正常處理后的種子胚染色程度來判斷種子生活力，種子的胚及胚乳染成紅色為有活力，胚及胚乳均不著色，或其中一部分不著色均為無生活力。計算染色率。

表1 TTC 染色法正交試驗因素與水平表[L9（33）]Table 1 Factors and levels for orthogonal test of TTC staining[L9（33）]

1.2.4 貯藏條件和時間對黑老虎種子發(fā)芽率的影響將202111-A和202111-B兩批次種子凈選后各自分成兩份，其中一份作為對照組，裝入拉封袋敞開放置于無蟲鼠害的干燥房間室溫（10～26 ℃）保存；另一份于拉封袋中密封，存放于家用冰箱冷藏（6～8 ℃）。自存放起的2、4、6、8、13 周，取出種子，按“1.2.2”項下c 法處理種子，進行出苗實驗，統(tǒng)計發(fā)芽率。

1.2.5 質(zhì)量測定 根據(jù)GB/T3543.1～3543.7-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》實施指南[12]，采用百粒法測定202111-A和202111-B兩批黑老虎種子質(zhì)量。同批次所有種子經(jīng)過凈度分析后，將全部凈種子均勻混合后取其中一部分，從中隨機人工數(shù)取8 個重復試樣，每個重復100粒，分別稱質(zhì)量，換算成規(guī)定水分下的種子千粒重。

1.2.6 水分測定 根據(jù)GB/T3543.1～3543.7-1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》實施指南[12]，以及黑老虎種子揮發(fā)性物質(zhì)含量較高的特性[5]，將種子粉碎至多于50%的粉碎物可通過4 mm 篩孔，采用低恒溫烘干法測量水分。實驗設(shè)置3 個重復組，每組取4.500～5.000 g，于（103±2）℃烘箱烘烤9 h[19]。烘干3 h 后每間隔1 h進行稱質(zhì)量，直至達到恒質(zhì)量，達到恒質(zhì)量前后的種子質(zhì)量變化為種子失去的水分質(zhì)量，即為種子含水量。

1.3 數(shù)據(jù)處理應用Microsoft Excel 軟件和SPSS 26軟件進行數(shù)據(jù)處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。主要計算公式如下：染色率（%）＝（染色數(shù)/種子總數(shù)）×100%；發(fā)芽率（%）＝（出苗數(shù)/種子總數(shù)）×100%；種子水分（%）=[試樣烘前質(zhì)量（g）-試樣烘后質(zhì)量（g）]/種子烘干前質(zhì)量（g）×100%；千粒重（規(guī)定水分12%，g）=實測千粒重（g）×{[1-實測水分（%）]/[1-規(guī)定水分（%）]}。

2 結(jié)果

2.1 種子播前處理方法的篩選2021 年2 月，采用3 種播前處理方法對202011-A 和202011-B 兩批次種子進行處理后播種，從播種當日起計，分別于第36 天、第42天、第49天以及第60天時共統(tǒng)計4次發(fā)芽情況。兩批次黑老虎種子經(jīng)3種方法前處理后的發(fā)芽率情況如圖1所示，其中c方法（40 ℃純水浸種2 h，室溫純水浸種10 h）為本試驗中提高黑老虎種子發(fā)芽率的最優(yōu)方法，且202011-B 批次在3 種前處理條件下種子的發(fā)芽率均高于202011-A 批次種子的發(fā)芽率，可見202011-B批次的種子活力要優(yōu)于202010-A批次種子；同時可以確定黑老虎種子的出苗高峰期出現(xiàn)在播種后第42天以前。

圖1 播種前處理對黑老虎種子萌發(fā)的影響Figure 1 Effects of pre-treatment on germination of K. coccinea seeds

2.2 種子生活力條件的優(yōu)化在穿刺、預濕6 h 的條件下，采用L9（33）正交表，對溫度、時間和濃度進行考察，以202111-A和202111-B兩個批次黑老虎種子的染色率為指標判斷種子生活力差異。結(jié)果表明，最佳的實驗條件為種子去皮后穿刺、室溫純水浸泡6 h 后，采用濃度0.3%的TTC 溶液在40 ℃避光染色24 h；該條件下202111-B 批黑老虎種子染色率為85%，略高于202111-A批的80%。根據(jù)極差（R）的大小對各因素的影響作用進行判斷（見表2），染色溫度的R值最大（44.17），染色時間R值（37.50）次之，最低為TTC 濃度的R值（9.17），因此各因素對黑老虎種子生活力影響的大小排序為：染色溫度＞染色時間＞TTC濃度。

表2 TTC 染色中正交試驗因素與水平對黑老虎種子染色率的影響（ ±s）Table 2 Effects of orthogonal test factors and levels in TTC staining on the staining rate of K. coccinea seeds（ ±s）

表2 TTC 染色中正交試驗因素與水平對黑老虎種子染色率的影響（ ±s）Table 2 Effects of orthogonal test factors and levels in TTC staining on the staining rate of K. coccinea seeds（ ±s）

實驗組別實驗1實驗2實驗3實驗4實驗5實驗6實驗7實驗8實驗9均值1均值2均值3極差（R）染色溫度/℃30 35 40 30 35 40 30 35 40 27.50 55.00 71.67 44.17 TTC濃度/%0.3 0.6染色時間/h 1 1 6 6 6 0.3 0.6 0.6 1 0.3 50.00 56.67 47.50 9.17 12 12 12 24 24 24 30.83 55.00 68.33 37.50種子染色率/%202111-A批5.0 ± 4.1 60.0 ± 0.0 90.0 ± 4.1 30.0 ± 7.1 65.0 ± 0.0 70.0 ± 4.1 50.0 ± 7.1 70.0 ± 9.1 80.0 ± 4.1 202111-B批5.0 ± 0.0 10.0 ± 4.1 15.0 ± 0.0 15.0 ± 4.1 60.0 ± 4.1 90.0 ± 0.0 60.0 ± 16.3 65.0 ± 0.0 85.0 ± 9.1

2.3 貯藏條件和時間對黑老虎種子發(fā)芽率的影響將室溫和冷藏的兩批次黑老虎種子于不同時間取出，按前述c 法處理后進行出苗試驗。隨著儲藏時間增加，室溫儲藏的兩批次種子發(fā)芽率高低沒有明顯的規(guī)律，而冷藏的種子有先升高后降低的過程，冷藏6 周的兩批種子發(fā)芽率均為最高。室溫儲藏8 周、13 周的種子沒有萌發(fā)，而冷藏的種子仍有一定的發(fā)芽率，但都低于冷藏6周的種子，見圖2。202111-A和202111-B 兩個批次的黑老虎種子最高發(fā)芽率分別為57.7%、69.1%，202111-B 批次種子的發(fā)芽率較高，但二者的差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 貯藏條件和時間對黑老虎種子發(fā)芽率的影響Figure 2Effects of storage conditions and duration on germination percentage of K. coccinea seeds

2.4 黑老虎種子含水量的測定結(jié)果從圖3 可知，202111-A和202111-B兩批黑老虎種子在105 ℃溫度烘干過程中，前3 h 內(nèi)水分含量下降很快，且202111-B 種子失水量顯著高于202111-A 批次種子（P＜0.01）；3 h 后兩批種子的失水曲線較平穩(wěn)，在8～9 h 之間達到恒質(zhì)量，這和《國際種子檢驗規(guī)程》中水分測定程序中規(guī)定的低溫烘干的方法基本一致。故黑老虎種子的水分測定宜采用在（103 ±2）℃下烘烤9 h 的方法。實驗測得202111-B 種子的含水量顯著高于202111-A 種子含水量（P＜0.01），見表3。

圖3 低恒溫烘干法中兩批黑老虎種子失水量變化趨勢（n=3）Figure 3 Change trend of water loss using constant- lowtemperature oven method in two batches of the K. coccinea seed samples（n=3）

表3 兩批次黑老虎種子含水量比較（n=3）Table 3 Moisture contents of two batches of K. coccinea seeds（n=3）

2.5 黑老虎種子千粒重的測定結(jié)果采用百粒法測定202111-A和202111-B兩批黑老虎種子質(zhì)量，計算均值，換算成含規(guī)定水分（12%）的平均千粒重。結(jié)果如表4 所示。兩批種子千粒重（規(guī)定水分）分別為（208.21±0.73）、（201.72±0.57）g，變異系數(shù)分別為3.452、2.590，202111-A 和202111-B 兩批種子千粒重之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表4 兩批次黑老虎種子的千粒重比較（ ±s，g）Table 4 The thousand-kernel-weights of two batches of seed samples（ ±s，g）

表4 兩批次黑老虎種子的千粒重比較（ ±s，g）Table 4 The thousand-kernel-weights of two batches of seed samples（ ±s，g）

批次202111-A 202111-B千粒重最大值221.14 228.64千粒重最小值203.41 212.23千粒重均值210.97 218.18千粒重（水分12%）208.21 ± 0.73 201.72 ± 0.57

2.6 送驗樣品量根據(jù)本實驗結(jié)果初步確定送驗樣品應含有不少于2 500粒種子，即按種子千粒重計算不得少于600 g。

3 討論

近年來，以黑老虎根莖入藥的中藥材市場和果實食用的水果市場需求量日益增大，造成野生黑老虎資源的破壞性開采和種質(zhì)資源流失[6-8]。又因其品種繁多，種子質(zhì)量參差不齊，開展黑老虎種子檢驗規(guī)程研究，對保護黑老虎資源，規(guī)范黑老虎藥材生產(chǎn)過程，從源頭上保證黑老虎藥材產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的意義。黑老虎種子的土培發(fā)芽率可直接反應田間出苗情況，對其進行播種前處理方法的優(yōu)化，能更好地提高其發(fā)芽率及生長量。根據(jù)相關(guān)研究[13-14]，低濃度GA3處理48 h后種子發(fā)芽率優(yōu)于高濃度GA3處理12 h，增加浸種時間在一定程度上可以提高黑老虎種子的發(fā)芽率。此外，本研究采用中溫水和冷水交替浸種的方法[15]，以40 ℃純水浸種2 h后，換到室溫下的純水浸種10 h（c法），結(jié)果顯示對兩批次黑老虎種子的發(fā)芽率提高最明顯，且在各個時間點下該方法處理后的發(fā)芽率均優(yōu)于其他兩種方法。

TTC 法是最常用、最方便的種子生活力測定方法，也是目前普遍使用的方法，適用于多種類型的種子測定[20-23]。本研究通過正交設(shè)計，優(yōu)化了TTC法測定黑老虎種子生活力的溫度、濃度、時間等實驗條件；其最優(yōu)條件為穿刺后預濕6 h，用0.3% TTC溶液于40 ℃避光染色24 h。在此條件下的測定結(jié)果顯示，202111-B 批次的種子生活力（85%）略優(yōu)于202111-A批次種子（80%），而202111-B種子的發(fā)芽率（69.09%）高于202111-A 種子（57.73%），可見TCC染色法測定的黑老虎種子生活力與其發(fā)芽率相關(guān)性較大。結(jié)合千粒重測定結(jié)果，從整體上反映出202111-B 批次種子的質(zhì)量優(yōu)于202111-A 批次種子。研究表明黑老虎種子具有物理和生理性休眠特性[23]，且各品種種子質(zhì)量不一，發(fā)芽率差異較大；因此，通過TTC 法對黑老虎種子進行生活力測定，可以預測黑老虎種子發(fā)芽率，并對種子質(zhì)量進行評價。

本研究結(jié)果表明，202111-B 種子發(fā)芽率明顯高于202111-A 種子，而其實際含水量（18.64%）亦顯著高于202111-A 種子（13.15%），提示對于黑老虎種子含水量較高有利于種子的發(fā)芽和出苗。同時，本實驗對其不同溫度及儲藏方式進行了考察，發(fā)現(xiàn)常溫存儲8 周后，黑老虎種子的發(fā)芽率為0，而密封冷藏保存的種子仍有一定的發(fā)芽率，可見低溫儲藏對于黑老虎種子的發(fā)芽具有一定的積極作用，這與何鐵定的研究結(jié)果相符[24]。其原因可能是黑老虎種子在收獲時其種胚尚未完成后熟，采收后經(jīng)過一段時間的低溫層積，通過種胚增大完成形態(tài)及生理后熟，提高了其萌發(fā)率。但隨著儲藏時間的延長，冷藏8周后黑老虎種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為隨著冷藏層積時間的延長，種子內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)被大量利用或被呼吸作用所消耗，使其發(fā)芽率降低。密封和冷藏同時滿足了保存水分以及促進種子后熟的要求，在一定時間范圍內(nèi)，有助于提高黑老虎種子發(fā)芽率、保持種子的活力。

本研究對黑老虎種子的檢驗規(guī)程進行了初步研究，根據(jù)其特性建議采用土播出苗代替發(fā)芽實驗，并通過對種子儲藏的溫度和時間對發(fā)芽率的考察，建議黑老虎種子的檢驗應在采收后的一定時間內(nèi)盡早完成，為黑老虎種子的質(zhì)量檢驗和儲存管理提供了具有實踐意義的參考。