麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織MEK/ERK 信號通路的影響

謝慧臣，冉云，張云，歐陽瑜，唐浪，吳廣陽（. 湖北民族大學(xué)，湖北 恩施 445000；. 恩施德元升中醫(yī)醫(yī)院，湖北 恩施 445000）

脾虛證是一組以消化系統(tǒng)功能障礙及不同程度的病理改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的全身性病理狀態(tài)，其發(fā)病與多種急慢性應(yīng)激密切相關(guān)。絲裂原活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（絲裂原活化蛋白激酶激酶，MEK）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號級聯(lián)通路在胃腸道疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可激活肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞收縮，增大細(xì)胞間隙，從而間接調(diào)控腸黏膜屏障，影響腸黏膜修復(fù)及腸道功能的恢復(fù)[1]。

中藥蒼術(shù)具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒的功效，常被用來治療胃腸疾病。研究[2]發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)炮制（麩炒）前后，其化學(xué)成分及藥理作用發(fā)生了明顯變化，炮制后健脾作用增強(qiáng)而燥性降低。本課題組前期研究[3]表明，相較于生品，麩炒蒼術(shù)可更好地改善脾虛模型大鼠的脾虛相關(guān)證候及小腸組織病理變化，其機(jī)制可能與蒼術(shù)麩炒后可更好地調(diào)節(jié)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白載體的表達(dá)及各種消化酶的分泌，從而恢復(fù)小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)。故本研究擬通過慢性束縛、苦寒破氣聯(lián)合饑飽失常法復(fù)制脾虛大鼠模型，進(jìn)一步觀察麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織MEK/ERK 信號通路的影響，以期從結(jié)腸黏膜屏障的損傷與修復(fù)角度進(jìn)一步闡明麩炒蒼術(shù)發(fā)揮健脾功效的深層次機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物3月齡雄性SD大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量（150±20）g，購自武漢塞維爾生物科技有限公司，動物質(zhì)量合格證號：56007500 034292；實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2018-0101，動物實驗方案經(jīng)湖北民族大學(xué)倫理委員會審批，批文號：2020043。

1.2 藥物及主要試劑厚樸（批號：200401）、枳實（批號：200203）、大黃（批號：200301）、麩炒蒼術(shù)（批號：200304），均購自湖北省恒信醫(yī)藥有限公司；上述飲片均經(jīng)湖北民族大學(xué)藥學(xué)院胡華副教授鑒定，符合2020 年版《中華人民共和國藥典（一部）》相關(guān)規(guī)定?？嗪茪夥剿幰褐苽浞椒ǎ汉駱?、枳實、大黃的組方質(zhì)量比為5∶3∶4，常規(guī)煎煮2 次，每次45 min；濾過，合并藥液，加熱濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1。麩炒蒼術(shù)藥液制備方法：麩炒蒼術(shù)飲片先后加入10、8 倍量蒸餾水，常規(guī)煎煮2 次，每次45 min；濾過，合并藥液，濃縮至生藥質(zhì)量濃度為1 g·mL-1。

復(fù)方谷氨酰胺腸溶膠囊，地奧集團(tuán)成都藥業(yè)股份有限公司，批號：20190508。密封蛋白2（Claudin-2，批號：B2022）、密封蛋白3（Claudin-3，批號：B2019）、黏蛋白（MUC2，批號：B2305）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9，批號：B2117）ELISA 檢測試劑盒，均購自上海信帆生物科技有限公司；一抗磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶（p-MLCK，批號：G4109）、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（p-Raf）兔多克隆抗體（批號：G3301）、HE 染色液套裝（批號：G1009）、RNA 提取液（批號：J253479），均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；Trizol 提取試劑盒（批號：J521013）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（批號：J397452），均購自美國Thermo科技公司。

1.3 主要儀器D3024R 型臺式高速冷凍型微量離心機(jī)，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司；Rt2100c型酶標(biāo)檢測儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；NE600 型光學(xué)顯微鏡，深圳西尼科光學(xué)儀器有限公司；NanoDrop2000 型超微量分光光度計，美國Thermo 科技公司；Stepone plus GC-1500 型實時熒光定量PCR儀，美國ABI 公司；alphaEaseFC灰度分析軟件，美國Alpha Innotech 公司；Adobe PhotoShop 圖像分析軟件，美國Adobe 公司；H-600 型透射電鏡，日本日立公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、復(fù)方谷氨酰胺組（9 mg·kg-1）及麩炒蒼術(shù)高、中、低劑量組（10.0、5.0、2.5 g·kg-1），每組10 只。參考相關(guān)研究[3-4]方法采用慢性束縛、苦寒破氣聯(lián)合饑飽失常法復(fù)制脾虛大鼠模型：除正常組外，其余各組大鼠每日以束縛架捆綁束縛3 h，并以苦寒破氣方10 g·kg-1灌胃1 次；隔日喂飼1次，且飼料量為常規(guī)量的一半；自由飲水，持續(xù)21 d。模型復(fù)制結(jié)束后的第2天開始按照上述設(shè)定劑量灌胃給藥，正常組和模型組給予蒸餾水灌胃（10 mL·kg-1），每日1次，持續(xù)14 d。

1.5 大鼠一般狀態(tài)觀察實驗期間每日觀察動物的宏觀表征、攝食情況，記錄每日體質(zhì)量增加情況。定期收集大鼠6 h的糞便，記錄烘干（50 ℃）前后的質(zhì)量（g），計算：糞便含水率（%）=（濕糞質(zhì)量-干燥糞便質(zhì)量）/濕糞質(zhì)量×100%。依據(jù)《中藥治療脾虛證的臨床研究指導(dǎo)原則》[5]對大鼠脾虛證進(jìn)行評分。

1.6 結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察（1）將部分大鼠結(jié)腸組織用4%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)取材、脫水、包埋后制備4 μm 石蠟切片；常規(guī)HE 染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察結(jié)腸組織病理改變。（2）另取部分結(jié)腸組織，置于2.5%戊二醛溶液中，經(jīng)固定、漂洗、脫水、包埋后制備超薄切片，鈾、鉛染色后，于透射電鏡下觀察結(jié)腸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化。

1.7 ELISA 法檢測結(jié)腸黏膜組織中Claudin-2、Claudin-3、MUC2、MMP-9 含量低溫下取部分結(jié)腸組織，用冰生理鹽水洗凈并濾干，加9倍體積生理鹽水勻漿，以4 ℃、3 500 r·min-1（離心半徑8.7 cm）離心10 min，收集上清液。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，采用ELISA雙抗體夾心法檢測結(jié)腸黏膜組織中Claudin-2、Claudin-3、MUC2、MMP-9含量。

1.8 免疫組化法檢測結(jié)腸組織中p-MLCK、p-Raf蛋白表達(dá)水平取結(jié)腸組織石蠟切片（4 μm），脫蠟至水，經(jīng)過消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性、抗原修復(fù)、BSA 封閉，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、乙醇脫水、中性樹脂封片、干燥后，光鏡下觀察結(jié)腸組織中p-MLCK、p-Raf蛋白表達(dá)情況。陽性染色為棕色或棕黃色，運(yùn)用Image-Pro Plus 軟件分析平均光密度值，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.9 Real-time PCR 法檢測結(jié)腸組織中MEK、ERK、MLCK mRNA 表達(dá)水平取勻漿管加入1 mL Trizol Reagent，預(yù)冷；取100 mg 結(jié)腸組織，置于勻漿管中充分研磨，離心取上清；加入250 μL 三氯甲烷，充分混勻，靜置；取上清加入異丙醇，混勻、離心；乙醇洗滌，加水溶解RNA，孵育5 min；檢測RNA 濃度及純度。取10 μL RNA 溶液，加入1 μL oligo（dT）18 和1 μL RevertAiM-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取0.2 mL PCR管，配制反應(yīng)體系；以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：預(yù)變性95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s。根據(jù)擴(kuò)增曲線讀取Ct 值，以β-actin 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)水平。引物由美國Thermo科技公司提供，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠一般狀態(tài)的影響結(jié)果見表2。與正常組比較，模型組大鼠的脾虛證積分、糞便含水率顯著升高（P＜0.01），每日體質(zhì)量増加量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠的脾虛證積分、糞便含水率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），每日體質(zhì)量増加量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，麩炒蒼術(shù)能改善脾虛大鼠的一般癥狀，具有燥濕健脾作用。

表2 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠糞便含水率、每日體質(zhì)量増加量及脾虛證積分的影響（ ±s，n=10）Table 2 Effects of bran-fried Atractylodes Rhizoma on daily mass gain，moisture content of faeces and integral of spleen deficiency syndrome in spleen deficiency rats（ ±s，n=10）

表2 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠糞便含水率、每日體質(zhì)量増加量及脾虛證積分的影響（ ±s，n=10）Table 2 Effects of bran-fried Atractylodes Rhizoma on daily mass gain，moisture content of faeces and integral of spleen deficiency syndrome in spleen deficiency rats（ ±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

脾虛證積分/分5.20±0.80 19.56±3.64**15.28±2.97#11.08±1.91#6.91±1.58##14.97±2.88#組別正常組模型組麩炒蒼術(shù)低劑量組麩炒蒼術(shù)中劑量組麩炒蒼術(shù)高劑量組復(fù)方谷氨酰胺組劑量/（g·kg-1）--2.5 5.0 10.0 9 mg·kg-1糞便含水率/%46.21±3.87 69.88±5.69**63.24±4.97#55.89±4.26#47.67±3.93##62.98±4.99#每日體質(zhì)量増加量/g 3.96±0.33 2.01±0.17**2.78±0.19#3.55±0.20##3.90±0.31##3.17±0.20##

2.2 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響結(jié)果見圖1、圖2。HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠結(jié)腸黏膜上皮及固有層完整。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜層上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的萎縮，黏膜表面結(jié)構(gòu)疏松水腫，固有膜結(jié)構(gòu)被破壞，可見炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞減少。與模型組比較，麩炒蒼術(shù)各劑量組大鼠結(jié)腸黏膜表面結(jié)構(gòu)明顯改善，水腫減輕，杯狀細(xì)胞排列形態(tài)漸趨整齊，數(shù)量明顯增多，以麩炒蒼術(shù)高劑量組修復(fù)效果最明顯。

圖1 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化的影響（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of bran-fried Atractylodes Rhizoma on intestinal histopathology of spleen deficiency rats（HE staining，×200）

圖2 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)變化的影響（透射電鏡，×8 000）Figure 2 Effect of bran-fried Atractylodes Rhizoma on ultracellular pathology in colon tissue of spleen deficiency rats（TEM，×8 000）

透射電鏡結(jié)果顯示，正常組大鼠結(jié)腸壁細(xì)胞胞膜及胞核正常，結(jié)構(gòu)及體積無明顯異常，胞核及胞質(zhì)飽滿充盈，外膜完整，線粒體在胞質(zhì)中分布較多，線粒體基質(zhì)分布均勻。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及體積明顯異常，體積變小，核固縮變形，染色質(zhì)及核仁形態(tài)模糊不清，線粒體數(shù)量明顯減少且結(jié)構(gòu)明顯異常。與模型組比較，麩炒蒼術(shù)各劑量組大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有不同程度修復(fù)，其中以麩炒蒼術(shù)高劑量組修復(fù)效果最為明顯，大部分線粒體排列整齊，嵴密，結(jié)構(gòu)完整。結(jié)果表明，麩炒蒼術(shù)能夠修復(fù)脾虛大鼠受損的腸黏膜及其組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，緩解腸黏膜炎性改變。

2.3 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸黏膜組織Claudin-2、Claudin-3、MUC2、MMP-9 含量的影響結(jié)果見表3。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Claudin-3、MUC2含量顯著降低（P＜0.01），Claudin-2、MMP-9含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸黏膜組織中Claudin-3、MUC2含量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），Claudin-2、MMP-9含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，麩炒蒼術(shù)能夠上調(diào)結(jié)腸組織緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-3、MUC2表達(dá)，下調(diào)Claudin-2、MMP-9蛋白表達(dá)。

表3 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸黏膜組織中Claudin-2、Claudin-3、MUC2、MMP-9 含量的影響（ ±s，n=10）Table 3 Effects of bran-fried Atractylodes Rhizoma on contents of Claudin-2，Claudin-3，MUC2、MMP-9 in colonic mucosal tissue of spleen deficiency rats（ ±s，n=10）

表3 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸黏膜組織中Claudin-2、Claudin-3、MUC2、MMP-9 含量的影響（ ±s，n=10）Table 3 Effects of bran-fried Atractylodes Rhizoma on contents of Claudin-2，Claudin-3，MUC2、MMP-9 in colonic mucosal tissue of spleen deficiency rats（ ±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

MUC2/（ng·mL-1）41.36±2.83 19.29±1.05**26.50±1.39#33.34±1.85##40.91±2.55##33.76±1.90##組別正常組模型組麩炒蒼術(shù)低劑量組麩炒蒼術(shù)中劑量組麩炒蒼術(shù)高劑量組復(fù)方谷氨酰胺組劑量/（g·kg-1）--2.5 5.0 10.0 9 mg·kg-1 Claudin-2/（ng·mL-1）16.38±1.05 34.28±3.88**28.04±2.57#23.01±2.33##16.99±1.82##22.48±2.44##Claudin-3/（ng·mL-1）57.57±3.88 24.19±1.02**33.73±2.09#45.58±2.88#56.73±3.65##34.16±2.11#MMP-9/（ng·mL-1）20.39±2.31 51.21±4.93**42.18±4.06#31.28±3.38#21.09±2.77##40.43±4.01#

2.4 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織中p-MLCK、p-Raf 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖3、圖4、表4。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織p-MLCK、p-Raf蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織p-MLCK、p-Raf 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織p-MLCK、p-Raf 蛋白表達(dá)具有抑制作用。

圖3 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織中p-MLCK 蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×400）Figure 3 Effect of bran-fried Atractylodes Rhizoma on protein expression of p-MLCK in colon tissue of spleen deficiency rats（IHC，×400）

圖4 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織中p-Raf 蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×400）Figure 4 Effect of bran-fried Atractylodes Rhizoma on protein expression of p-Raf in colon tissue of spleen deficiency rats（IHC，×400）

表4 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織中p-MLCK、p-Raf蛋白表達(dá)的影響（ ±s，n=10）Table 4 Effects of bran-fried Atractylodes Rhizoma on protein expressions of p-MLCK and p-Raf in colon tissue of spleen deficiency rats（ ±s，n=10）

表4 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織中p-MLCK、p-Raf蛋白表達(dá)的影響（ ±s，n=10）Table 4 Effects of bran-fried Atractylodes Rhizoma on protein expressions of p-MLCK and p-Raf in colon tissue of spleen deficiency rats（ ±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

p-Raf 平均光密度值69.38±5.34 138.59±10.59**103.64±8.65#88.47±6.35##70.16±5.54##90.67±4.33#組別正常組模型組麩炒蒼術(shù)低劑量組麩炒蒼術(shù)中劑量組麩炒蒼術(shù)高劑量組復(fù)方谷氨酰胺組劑量/（g·kg-1）--2.5 5.0 10.0 9 mg·kg-1 p-MLCK 平均光密度值81.46±7.33 153.49±10.34**128.82±9.39#106.62±10.12##82.24±8.98##107.83±10.96#

2.5 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織MEK、ERK、MLCK mRNA 表達(dá)的影響結(jié)果見表5。與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織MEK、ERK、MLCK mRNA 表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織中MEK、ERK、MLCK mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織MEK、ERK、MLCK基因表達(dá)具有抑制作用。

表5 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織中MEK、ERK、MLCK mRNA 表達(dá)的影響（ ±s，n=10）Table 5 Effect of bran-fried Atractylodes Rhizoma on mRNA expressions of MEK，ERK and MLCK in colon tissue of spleen deficiency rats（ ±s，n=10）

表5 麩炒蒼術(shù)對脾虛大鼠結(jié)腸組織中MEK、ERK、MLCK mRNA 表達(dá)的影響（ ±s，n=10）Table 5 Effect of bran-fried Atractylodes Rhizoma on mRNA expressions of MEK，ERK and MLCK in colon tissue of spleen deficiency rats（ ±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

MEK mRNA 相對表達(dá)量1.09±0.05 5.32±0.19**3.81±0.20#2.98±0.26##1.25±0.11##3.09±0.24#組別正常組模型組麩炒蒼術(shù)低劑量組麩炒蒼術(shù)中劑量組麩炒蒼術(shù)高劑量組復(fù)方谷氨酰胺組劑量/（g·kg-1）--2.5 5.0 10.0 9 mg·kg-1 MLCK mRNA 相對表達(dá)量1.67±0.07 6.96±0.36**5.05±0.24#3.40±0.21##1.71±0.11##4.90±0.22#ERK mRNA 相對表達(dá)量1.08±0.07 4.67±0.24**3.54±0.23#2.60±0.36##1.21±0.13##2.98±0.24#

3 討論

脾虛證是以消化系統(tǒng)功能障礙為主，涉及神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)功能異常的全身性病理狀態(tài)，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展都有密切關(guān)系[6]。研究[7-8]認(rèn)為，多因素復(fù)合的脾虛證動物模型制備方法與臨床真實情況更加接近，較單因素模型復(fù)制方法更為科學(xué)。為全面反映脾虛證本質(zhì)，本研究采用慢性束縛、苦寒破氣聯(lián)合饑飽失常三因素復(fù)合方法構(gòu)建脾虛證動物模型。模型復(fù)制過程中，造模大鼠逐漸表現(xiàn)出倦怠疲乏、食少、運(yùn)動遲滯、大便溏薄、形體消瘦、體質(zhì)量增加緩慢、肛溫下降明顯、被毛枯槁等比較典型的脾虛癥狀。通過病理學(xué)觀察顯示，模型大鼠結(jié)腸組織黏膜層上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的萎縮，黏膜表面結(jié)構(gòu)疏松水腫，炎性細(xì)胞浸潤明顯，杯狀細(xì)胞減少，核固縮變形，線粒體數(shù)量明顯減少且結(jié)構(gòu)明顯異常。而麩炒蒼術(shù)干預(yù)可以明顯改善脾虛大鼠一般狀況，降低脾虛宏觀證候積分，并修復(fù)受損的腸黏膜及其組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，緩解腸黏膜炎性改變。

機(jī)械屏障、化學(xué)屏障是構(gòu)成腸道屏障的重要組成部分。腸黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接是腸黏膜機(jī)械屏障的主要結(jié)構(gòu)，其組成包括Occludin、Claudins等跨膜蛋白和蛋白支架[9-12]。緊密連接骨架蛋白Claudin-3 在腸黏膜細(xì)胞中高表達(dá)，參與結(jié)腸上皮細(xì)胞的緊密連接[13]。Claudin-2 是一種孔道形成蛋白，可上調(diào)內(nèi)皮及上皮細(xì)胞的通透性并調(diào)節(jié)腸道屏障，其高表達(dá)可致腸黏膜功能障礙[14]。MMP-9 屬于蛋白裂解酶，在結(jié)腸黏膜上皮損傷中發(fā)揮重要作用，可降解結(jié)腸黏膜細(xì)胞外基質(zhì)，損壞結(jié)腸緊密連接結(jié)構(gòu)，破壞黏膜通透性[15]。結(jié)腸化學(xué)屏障主要由腸上皮杯狀細(xì)胞所分泌的黏液構(gòu)成，腸黏液層發(fā)揮著至關(guān)重要的腸屏障功能，其主要成分是黏蛋白MUC2[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，脾虛證模型大鼠結(jié)腸組織中Claudin-3、MUC2表達(dá)水平均顯著下降，提示脾虛大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接關(guān)鍵蛋白低表達(dá)，同時腸道化學(xué)屏障亦被破壞；Claudin-2、MMP-9 表達(dá)水平顯著升高，提示腸黏膜機(jī)械屏障被破壞，結(jié)腸上皮通透性增加。而麩炒蒼術(shù)干預(yù)可上調(diào)模型大鼠結(jié)腸組織中Claudin-3、MUC2 表達(dá)水平，同時下調(diào)Claudin-2、MMP-9 表達(dá)，提示麩炒蒼術(shù)可雙相調(diào)節(jié)結(jié)腸緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)，改善腸道屏障功能，從而降低結(jié)腸細(xì)胞間通透性并修復(fù)受損腸黏膜。

Raf/MEK/ERK 信號通路可調(diào)節(jié)胃腸黏膜上皮細(xì)胞遷移、增殖/凋亡、分化等多種生物學(xué)反應(yīng)[17-18]。Ras 作為上游激活蛋白，能夠和Raf 結(jié)合后激活Raf，并與MEK結(jié)合后激活MEK[19]。ERK是將信號從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，MEK1/2 雙特異性激酶可以催化ERK1、ERK2 在蘇氨酸和酪氨酸殘基上的磷酸化。磷酸化激活的ERKl/2 由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持等多種生物學(xué)反應(yīng)[20]。Raf/MEK/ERK 信號級聯(lián)通路可調(diào)控激活MLCK，MLCK磷酸化激活形成p-MLCK[21]。Raf/MEK/ERK 信號通路異?；罨烧T導(dǎo)多種疾病如消化性潰瘍、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、消化道腫瘤等[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，脾虛證模型大鼠結(jié)腸組織p-MLCK、p-Raf 蛋白表達(dá)及MEK、ERK、MLCK 基因表達(dá)均明顯上調(diào)，提示脾虛證結(jié)腸病變過程存在Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)通路及下游MLCK信號通路的激活。而麩炒蒼術(shù)干預(yù)可以下調(diào)脾虛大鼠結(jié)腸組織p-MLCK、p-Raf 蛋白表達(dá)，下調(diào)MEK、ERK、MLCK 基因表達(dá)，提示麩炒蒼術(shù)可能通過調(diào)控Raf/MEK/ERK 信號通路發(fā)揮治療脾虛證相關(guān)胃腸疾病的作用。

綜上所述，麩炒蒼術(shù)能夠降低脾虛大鼠結(jié)腸黏膜炎癥水平，保護(hù)結(jié)腸上皮，改善結(jié)腸組織細(xì)胞的病理狀態(tài)，其機(jī)制可能與干預(yù)Raf/MEK/ERK 信號通路，雙相調(diào)節(jié)腸黏膜Claudin-2、MMP-9、Claudin-3等緊密連接蛋白及黏蛋白MUC2的表達(dá)，從而增強(qiáng)腸道屏障功能有關(guān)。