建立數(shù)字PCR檢測非小細(xì)胞肺癌溶酶體相關(guān)的4次跨膜蛋白B基因拷貝數(shù)變異方法

王 魯, 徐國兵, 張青云

(北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所檢驗科,惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室, 北京 100142)

溶酶體相關(guān)的4次跨膜蛋白B(lysosomal-associated protein transmembrane-4 beta, LAPTM4B)是2000年首次從肝細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)、克隆并鑒定的癌基因(NCBI GenBank NM_018407, Gene ID 55353)[10]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),LAPTM4B蛋白在人類正常組織中呈現(xiàn)廣泛表達(dá),在肝細(xì)胞癌、乳腺癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá),且與患者預(yù)后密切相關(guān)[11]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),LAPTM4B蛋白的過表達(dá)顯著增強(qiáng)細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力,抑制細(xì)胞凋亡、啟動細(xì)胞自噬及介導(dǎo)多重耐藥等[12,13]。此外,已證實非小細(xì)胞肺癌患者,組織和血清LAPTM4B蛋白水平存在顯著升高,適于作為潛在的腫瘤標(biāo)志物,對患者的診斷及療效監(jiān)測具有一定應(yīng)用價值[14]。但目前尚未有關(guān)于肺癌LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測的相關(guān)文獻(xiàn)報道。

數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)是繼實時定量PCR發(fā)展的一種絕對定量檢測技術(shù),將1個PCR反應(yīng)分配至2～3萬個微小的反應(yīng)單元中,每個反應(yīng)單元中包含或不包含1個或多個目標(biāo)分子。擴(kuò)增結(jié)束后讀取各反應(yīng)單元的陰性或陽性熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析得出拷貝數(shù),不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對樣本核酸的絕對定量[15],因其靈敏度及準(zhǔn)確度高,抗干擾能力強(qiáng),已廣泛應(yīng)用于稀有變異檢測、拷貝數(shù)變異分析及復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測。本研究旨在建立一種基于dPCR技術(shù)檢測基因拷貝數(shù)的方法,評估其檢測性能,并進(jìn)一步在非小細(xì)胞肺癌樣本中評估其臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 資料來源

收集2021年3月至2021年7月于北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院就診的NSCLC患者6例,男4例,女2例,平均年齡65(43～74)歲,經(jīng)病理診斷確診為NSCLC,收集上述患者的術(shù)中冰凍組織,本研究經(jīng)過北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查和批準(zhǔn)(2020KT20),其研究根據(jù)1975年赫爾辛基宣言的倫理準(zhǔn)則實施。

細(xì)胞株:人肺癌細(xì)胞株A549(EGFR野生型)、H1975(攜帶EGFR T790M和L858R雙突變)和HCC827(攜帶EGFR19外顯子缺失突變)均由本實驗室保存,細(xì)胞株均經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列分析(short tandem repeat analysis, STR)進(jìn)行鑒定。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 QuantStudioTM3D數(shù)字PCR系統(tǒng)及超微量分光光度計Nandrop均購自美國賽默飛公司;TIANamp Genomic DNA Kit購自中國天根公司;DNeasy Blood&Tissue Kit購自德國凱杰公司;數(shù)字PCR反應(yīng)液、芯片及內(nèi)參基因均購自科維思生物科技公司;針對LAPTM4B基因的引物及探針自主設(shè)計完成后由金斯瑞生物科技公司合成純化;細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清和胰酶(含EDTA)購自美國賽默飛公司。

1.2.2 基因組DNA的提取 細(xì)胞基因組DNA按照TIANamp Genomic DNA Kit(DP304)試劑盒說明書提取,患者冰凍組織DNA按照Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit(69504)試劑盒說明書進(jìn)行提取,經(jīng)非接觸式超聲波破碎儀Covaris M220 將抽提的細(xì)胞基因組DNA隨機(jī)打斷成長度為100～300 bp左右的片段;超微量分光光度計Nanodrop測量超碎后細(xì)胞基因組DNA片段的濃度及純度。核酸提取后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 探針引物的設(shè)計 應(yīng)用Pubmed網(wǎng)站提供的LAPTM4B基因原始序列,利用Primer-Express3.0.1結(jié)合參考文獻(xiàn)設(shè)計。LAPTM4B引物及探針序列如下:上游引物5′-TCAGCAACTCTCCTGT TGGT-3′,下游引物5′-GGGAAAGGTCCTCAGACA CA-3′,探針序列FAM-AGGTTTGCCCACATCCAAGA TGACCT-MGB。采用設(shè)計的引物探針建立dPCR反應(yīng)體系,優(yōu)化探針引物濃度。

1.2.4 dPCR反應(yīng)體系的建立 dPCR原理主要依據(jù)Sykes提出的基于模板無限稀釋及泊松分布的定量檢測理論。反應(yīng)原理正如Fig.1所示,FAM標(biāo)記的Taqman探針靶向LAPTM4B基因的穩(wěn)定區(qū)域,VIC標(biāo)記的探針靶向作為參考基因的內(nèi)部對照基因,使用微流控芯片將微升級別包含樣本的PCR反應(yīng)體系均勻分散至一張帶有2萬個微孔的芯片內(nèi),形成近2萬個相互獨立的微反應(yīng)體系,經(jīng)PCR擴(kuò)增,檢測每個微孔的熒光信號,使用泊松分布計算目的基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù),二者比值用作確定LAPTM4B基因擴(kuò)增水平的關(guān)鍵參數(shù)。

這種模式主要利用第三方平臺作為商品信息的展現(xiàn)渠道，常用的信息發(fā)布渠道有微博、微信、QQ空間、抖音等。比較典型的有拼多多，拼多多直接依靠微信等社交網(wǎng)絡(luò)的覆蓋和傳播實現(xiàn)客戶的裂變轉(zhuǎn)化。另一種常見的做法是邀請網(wǎng)絡(luò)紅人或者KOL在各種社交平臺上與粉絲進(jìn)行互動，利用粉絲的崇拜心理或趨同心理去推銷商品。這種方式相當(dāng)在線上開設(shè)專柜，網(wǎng)紅或KOL是網(wǎng)上的導(dǎo)購，利用社交網(wǎng)絡(luò)與客戶進(jìn)行溝通交流達(dá)到銷售商品的目的。

Fig.1 Design of LAPTM4B detection dPCR assay FAM probe targeted the LAPTM4B gene while VIC probe was designed to target a reference gene. DNA samples were prepared in a master mix and loaded on a chip for dPCR analysis. Wells on the chip containing the LAPTM4B gene target sequence will yield a positive FAM signal; wells containing the reference gene target sequence will yield a positive VIC signal. The ratio of FAM: VIC signal determines the level of LAPTM4B amplification in samples

dPCR預(yù)混液配制:7.25 μL Tapman Fast Advanced Master Mix,0.725 μL 250 nmol/L探針、0.725 μL 600 nmol/L PCR上下游引物,0.725 μL RNase P內(nèi)參基因,5 ng模板(細(xì)胞系和組織DNA),無酶水補(bǔ)足14.5 μL終體積,按照標(biāo)準(zhǔn)流程將反應(yīng)液上樣至數(shù)字PCR芯片,填充液填充密封上樣口。反應(yīng)條件:預(yù)變性96 ℃×10 min,1次循環(huán);退火和延伸60 ℃×2 min,變性98 ℃×30 s,39次循環(huán);終延伸60 ℃×2 min,1次循環(huán),最終降至10 ℃。

1.2.5LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測方法的性能評估

(1)最低檢測限:將陽性細(xì)胞株基因組DNA與人類基因組DNA按照不同比例進(jìn)行混合,得到100%、50%、25%、12.5%及6.25%不同濃度梯度的反應(yīng)模板,使用建立的dPCR檢測方法進(jìn)行檢測。每個濃度梯度進(jìn)行3個重復(fù)實驗。

(2)線性評估:分別檢測100%、50%、25%及12.5%不同濃度的陽性細(xì)胞株DNA,每個樣本重復(fù)檢測3次,分析預(yù)期結(jié)果與實際檢測結(jié)果的相關(guān)性,各濃度的檢測偏差百分比DEV<15%,且曲線的回歸系數(shù)R2>0.99可判斷為線性。

(3)精密度評估:將陽性細(xì)胞株基因組DNA與人類基因組DNA按比例混合,得到100%、50%、25%及12.5%的陽性細(xì)胞系DNA,對同一樣品在同一反應(yīng)體系條件下重復(fù)10次檢測,滿足CV≤10%認(rèn)定為此檢測方法的重復(fù)性較好。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 數(shù)字PCR檢測體系的建立

以NSCLC細(xì)胞株A549(EGFR野生型)、H1975(攜帶EGFR T790M和L858R雙突變)和HCC827(EGFR 19Del突變)為模板,人類基因組DNA作為陰性對照,分別進(jìn)行dPCR反應(yīng),探索建立LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測體系的可行性。FAM通道為目的基因通道,VIC為內(nèi)參基因通道,藍(lán)色和綠色,紅色和綠色點分別代表目的基因和內(nèi)參基因的陽性孔,黃色為無擴(kuò)增陰性孔(Fig.2)。每個樣本重復(fù)檢測2次,結(jié)果匯總正如Table1所示。與人類基因組DNA相比,3株NSCLC細(xì)胞系的LAPTM4B拷貝數(shù)均出現(xiàn)缺失,其中以HCC827拷貝數(shù)降低最為明顯,且在FAM與VIC通道中,HCC827細(xì)胞系擴(kuò)增結(jié)果散點圖陰陽性孔位分得最開,熒光強(qiáng)度差異明顯,故選擇HCC827作為陽性對照評估所建立體系的檢測性能。

Table 1 Detection of the copy numbers of LAPTM4B gene in different lung adenocarcinoma cell lines by dPCR

2.2 方法性能評價

2.2.1最低檢測限 制備不同濃度梯度的LAPTM4B拷貝數(shù)缺失陽性細(xì)胞系DNA,按照建立的dPCR反應(yīng)體系進(jìn)行最低檢測限評估。結(jié)果正如Table 2所示,當(dāng)LAPTM4B基因拷貝數(shù)缺失低至6.25%時,其拷貝數(shù)無法有效地與對照組人類基因組DNA區(qū)分,故此檢測體系最低能夠檢測到12.50%比例的LAPTM4B基因拷貝數(shù)缺失。

2.2精密度評估 對預(yù)期LAPTM4B基因拷貝數(shù)缺失比例為0%、12.5%、25%、50%及100%的DNA樣品進(jìn)行10次重復(fù)檢測,評估其批間精密度。結(jié)果正如Table 3所示,結(jié)果分別為4.92%,7.26%,3.73%,3.40%,2.69%,精密度小于10%視為符合要求。

Table 3 Evaluation of the precision of the dPCR assay

2.2.3線性評估 以預(yù)期的LAPTM4B基因拷貝數(shù)缺失百分比為橫坐標(biāo),以實際檢測LAPTM4B基因拷貝數(shù)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性評估。結(jié)果正如Fig.3顯示,線性關(guān)系為Y=-0.5X+0.9795,R2>0.99(P<0.001,n=15),線性關(guān)系良好,表明該體系檢測結(jié)果具有較高的可信度。

Fig.3 Linear evaluation of the dPCR detection platform The diagram showed the linear fit of absolute quantification of the copy number of LAPTM4B gene. Each test was repeated 3 times

2.3 LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測的臨床驗證

依據(jù)建立的LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測方法,對6例NSCLC患者冰凍組織進(jìn)行DNA提取后進(jìn)行dPCR擴(kuò)增,4例患者為浸潤性腺癌,2例為浸潤性鱗狀細(xì)胞癌,EGFR分型包含野生型,19外顯子缺失及21外顯子點突變。結(jié)果正如Table4所示,病例1～5與健康人基因組DNA相比,均出現(xiàn)LAPTM4B基因拷貝數(shù)缺失,這一結(jié)果與肺癌細(xì)胞系檢測結(jié)果相符,但病例6卻呈現(xiàn)出LAPTM4B基因拷貝數(shù)增加,與細(xì)胞系結(jié)果相反,推測與此例患者術(shù)前化療有關(guān),未來仍需大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究支持。綜上,初步證實自主建立的dPCR方法能有效對臨床樣本進(jìn)行LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測,并具有一定的臨床實用性。

Table 4 Copy number detection of LAPTM4B gene in NSCLC tissues by the dPCR assay

3 討論

本研究首次以芯片式數(shù)字PCR為技術(shù)平臺,成功建立非小細(xì)胞肺癌LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測方法,進(jìn)行了基本的性能評估,在此基礎(chǔ)上,通過組織樣本檢測,初步證實該方法的臨床實用性。

LAPTM4B基因位于人染色體8q22.1,編碼III類跨膜分子包含4個跨膜區(qū)域,分布于以溶酶體為主的細(xì)胞漿內(nèi),在人類正常組織中呈現(xiàn)廣泛表達(dá)。其cDNA全長包含2個翻譯起始密碼子ATG,可編碼LAPTM4B-35和LAPTM4B-24兩種蛋白質(zhì)亞型。已有研究證實,LAPTM4B-35蛋白在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá),包括肝細(xì)胞癌、乳腺癌癌、肺癌、結(jié)腸癌、膽囊癌及卵巢癌等,且與腫瘤進(jìn)展及患者不良預(yù)后密切相關(guān)[16-26]。此外,LAPTM4B基因第1外顯子5′非翻譯區(qū)一段19 bp序列存在多態(tài)性,導(dǎo)致出現(xiàn)LAPTM4B*1和LAPTM4B*2兩種基因型。攜帶LAPTM4B*2型等位基因人群罹患腫瘤危險性更高,被證實為腫瘤的危險因子之一(OR=1.487, 95%CI 1.339-1.651)[27]。LAPTM4B作為原癌基因有助于EGFR信號通路的持續(xù)激活,促進(jìn)細(xì)胞增殖及增強(qiáng)細(xì)胞耐藥性,同時與非活化狀態(tài)的EGFR相互作用啟動自噬發(fā)生。因此,LAPTM4B有望成為EGFR的聯(lián)合靶分子應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌患者TKI治療中[28-29]。

目前,針對LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測的報道較少,僅在路易體癡呆(dementia with Lewy bodies, DLB)患者中發(fā)現(xiàn)存在LAPTM4B基因拷貝數(shù)缺失,此變異會通過溶酶體途徑影響疾病發(fā)展[30]。我們的前期研究[14]已明確,LAPTM4B在非小細(xì)胞肺癌組織及血清表達(dá)水平均顯著增高,但其高表達(dá)狀態(tài)是否與基因拷貝數(shù)變異有關(guān)尚無相關(guān)報道。本研究通過芯片式數(shù)字PCR技術(shù),成功建立LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測方法,同時基于優(yōu)化的dPCR反應(yīng)體系開展檢測限、靈敏度和線性評估,以驗證方法的可靠性。研究顯示,與LAPTM4B基因高表達(dá)狀態(tài)不同的是,非小細(xì)胞肺癌中LAPTM4B基因拷貝數(shù)相較正常人出現(xiàn)了顯著降低,推測這一結(jié)果可能與LAPTM4B的基因調(diào)控有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子特化蛋白1(transcription specificity protein 1, SP1),環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(cyclic AMP responsive element-binding protein-1, CREB1)及激活增強(qiáng)子結(jié)合蛋白4(activating enhancer binding protein 4, AP4)均可結(jié)合于LAPTM4B基因啟動子區(qū),正向調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平[31-32, 12-13]。此外,LncRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)與調(diào)控LAPTM4B的miRNAs相互作用,正向調(diào)控LAPTM4B基因的表達(dá)水平,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[33]。性能評估結(jié)果顯示,數(shù)字PCR作為一種實現(xiàn)單分子級的高靈敏度檢測技術(shù),最低可檢測到12.5%的LAPTM4B基因拷貝數(shù)缺失,同時具有良好的精密度和線性。

應(yīng)用dPCR檢測6例NSCLC患者術(shù)中冰凍組織LAPTM4B基因,5例患者均出現(xiàn)了拷貝數(shù)降低,但出現(xiàn)1例浸潤性鱗癌LAPTM4B基因拷貝數(shù)較正常組織升高,可能與該例患者術(shù)前接收化療相關(guān)。此外受取材位點,組織異質(zhì)性等影響也可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異。因此,未來應(yīng)聯(lián)合ctDNA檢測探索外周血LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測的可行性,實現(xiàn)“液體活檢”有效避免組織異質(zhì)性。此外,在激素受體陰性的乳腺癌患者組織中進(jìn)行FISH檢測發(fā)現(xiàn),LAPTM4B基因拷貝數(shù)增加與蒽環(huán)類化療藥物反應(yīng)不佳有關(guān)[34]。因此,建立外周血LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測方法可能對患者化療療效進(jìn)行有效監(jiān)測。此外,本文注意到在細(xì)胞株的檢測中,EGFR野生型的細(xì)胞株A549的LAPTM4B基因拷貝數(shù)明顯高于EGFR突變型細(xì)胞株,在組織樣本中出現(xiàn)基因拷貝數(shù)升高的患者EGFR也為野生型,未來需要擴(kuò)大樣本量,探索EGFR突變狀態(tài)是否與LAPTM4B基因拷貝數(shù)存在關(guān)聯(lián)。

本研究首次建立dPCR檢測非小細(xì)胞肺癌LAPTM4B基因拷貝數(shù)檢測平臺,初步評估該檢測方法基本性能和臨床應(yīng)用價值,但入組患者樣本過少仍需大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步研究?？蛇M(jìn)一步分析LAPTM4B基因拷貝數(shù)與患者臨床病理特征及療效評估間的關(guān)系,同時可利用dPCR絕對定量特點動態(tài)監(jiān)測患者基因拷貝數(shù),可能為指導(dǎo)臨床治療方案提供新依據(jù)。