持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)上調(diào)PGC-1α/Irisin/BDNF表達(dá)改善肥胖小鼠認(rèn)知功能障礙

張鵬鵬

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)體育部, 山西 晉中 030801)

全球肥胖人數(shù)逐年上升且呈年輕化趨勢(shì),肥胖已成為全球重大公共衛(wèi)生問題[1]。肥胖癥患者常伴隨多種合并癥,易發(fā)生腦功能損傷、心血管疾病和糖尿病[2-4]。腦的重要功能區(qū)域前額葉易受肥胖影響,出現(xiàn)皮質(zhì)萎縮、白質(zhì)退化和功能連接損傷,引發(fā)前額葉相關(guān)的認(rèn)知功能包括感知力、記憶力、控制力與決策力受損[5]。文獻(xiàn)表明,氧化應(yīng)激和炎癥可能是大腦功能受損與肥胖的潛在聯(lián)系因素[2, 3]。脂肪組織肥大和增生會(huì)導(dǎo)致全身慢性炎癥和活性氧增加,誘發(fā)神經(jīng)炎癥和氧化還原反應(yīng)失衡,進(jìn)而導(dǎo)致腦區(qū)結(jié)構(gòu)與功能受損[6-8]。因此,肥胖癥群體尤其需要關(guān)注其腦部病變情況及相關(guān)功能衰退等不良后果。研究發(fā)現(xiàn),肥胖小鼠大腦皮層和海馬炎性細(xì)胞因子水平過高會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元病理性重塑和過度氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展[9, 10]。前額葉氧化應(yīng)激與炎癥水平過高將導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,并使血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性增加,細(xì)胞毒性物質(zhì)進(jìn)入腦區(qū),加劇神經(jīng)元丟失,最終導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能障礙[11, 12]。因此,抑制關(guān)鍵腦區(qū)例如前額葉的過度氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),緩解神經(jīng)元過度凋亡,減輕神經(jīng)元損傷,對(duì)于預(yù)防和緩解肥胖群體前額葉損傷和認(rèn)知功能的改善尤為重要。

過氧化物酶體增殖體激活受體γ共激活因子1α(peroxisome-proliferator-activated receptorγcoactivator-1α, PGC-1α)作為在骨骼肌中廣泛存在的核受體轉(zhuǎn)錄共激活因子,可被運(yùn)動(dòng)激活并直接調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞中的線粒體的生物合成及能量代謝[13]。鳶尾素(irisin)是一種可被運(yùn)動(dòng)激活的肌肉因子,由纖連蛋白III型含結(jié)構(gòu)域5(fibronectin typeⅢ domain-containing protein 5,FNDC5)加工而成,主要由脂肪和骨骼肌分泌,可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)可促進(jìn)大腦發(fā)育,是運(yùn)動(dòng)保護(hù)大腦的關(guān)鍵中介,被運(yùn)動(dòng)刺激并在多個(gè)腦區(qū)中表達(dá),包括前額葉和海馬體等[15]。目前,PGC-1α、Irisin和BDNF三者對(duì)于肥胖誘導(dǎo)腦損傷的影響知之甚少,其機(jī)制尚未完全明確。研究表明,有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)通過激活肥胖小鼠PGC-1α降低前額葉氧化應(yīng)激水平[16]。高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)和中等強(qiáng)度連續(xù)運(yùn)動(dòng)可通過激活中老年人Irisin/BDNF通路改善衰老導(dǎo)致的認(rèn)知能力降低[17]。研究表明,高水平Irisin和BDNF會(huì)顯著改善腦功能,緩解大鼠腦缺血再灌注損傷,并減輕過度氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng), 改善腦內(nèi)神經(jīng)突觸可塑性[18-20]。運(yùn)動(dòng)緩解衰老和疾病導(dǎo)致的感覺運(yùn)動(dòng)能力損失與激活PGC1α/FNDC/BDNF密切相關(guān)[21]。綜上,PGC-1α、Irisin和BDNF三者均有改善腦損傷和功能障礙的作用,但運(yùn)動(dòng)是否可以上調(diào)PGC-1α/Irisin/BDNF表達(dá),從而改善肥胖誘導(dǎo)的前額葉損傷和認(rèn)知功能障礙,目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬采用中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)和中高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行干預(yù),探討并比較2種運(yùn)動(dòng)方式對(duì)前額葉PGC-1α/Irisin/BDNF表達(dá)的影響,以及對(duì)前額葉損傷和認(rèn)知功能障礙的緩解改善效果,為今后作用靶點(diǎn)篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備

3月齡健康雄性C57BL/6J野生型小鼠40只,購(gòu)于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有小鼠自由飲食進(jìn)水,后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control,CON)、高脂飲食組(High-fat diet,HFD)、高脂飲食+中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)組(High-fat diet with moderate intensity continuous training,HFD+MICT)、高脂飲食+中高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)組(High-fat diet with high-intensity interval training,HFD+HIIT),每組10只。CON組小鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng),剩余3組小鼠HFD飼料喂養(yǎng)。HFD有20%的千卡來自蛋白質(zhì),20%的千卡來自碳水化合物,60%的千卡來自脂肪(北京科澳協(xié)力飼料公司)。在喂食高熱量膳食開始階段和直至訓(xùn)練結(jié)束期間,每2周用小動(dòng)物電子秤(上海香川電子公司)和自動(dòng)化學(xué)分析儀(科華ZY KHB-1280)稱量體重和測(cè)定血清甘油三酯(TG)。喂養(yǎng)12周小鼠平均體重和TG平均比開始喂養(yǎng)時(shí)增加20%以上,被認(rèn)為肥胖模型已經(jīng)建立。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器:八通道小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(ZH-PT,安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司),320R低溫高速離心機(jī)(THERMO),冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica),電泳儀(美國(guó)Bio-Rad),多色凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad),正置熒光顯微鏡(日本NiKon),OlymPusBX51光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)等。

PGC-1α、Irisin、BDNF(Cell Signaling Test),Bcl-2、Bax、裂解胱天蛋白酶3(Cell Signaling Test),IL-10、IL-1β、TNF-α、NF-κB(Abcam),兔多克隆抗體GAPDH和β-微管蛋白(β-tubulin),山羊抗兔二抗(天德悅),BCA蛋白定量試劑盒(西安晶彩),牛血清蛋白BSA(美國(guó)Amresco公司)。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案及取材

CON和HFD組不運(yùn)動(dòng)。HFD+MICT和HFD+HIIT組的小鼠在HFD喂養(yǎng)12周并進(jìn)行8周的跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)。根據(jù)既往研究及經(jīng)驗(yàn),運(yùn)動(dòng)方案略有修改[22]。首先,運(yùn)動(dòng)組中的小鼠在跑步機(jī)上接受適應(yīng)性訓(xùn)練3 d(5 m/min,10 min/d)。在正式訓(xùn)練期間,兩組都以10 m/min的速度熱身5 min。HFD+MICT組進(jìn)行了45 min的連續(xù)耐力跑,速度為14 m/min。在HFD+HIIT組中,2 min的中等強(qiáng)度(14 m/min,50%VO2max)跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)與1 min的高強(qiáng)度(25 m/min,90%VO2max)跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)交替進(jìn)行。上午進(jìn)行訓(xùn)練,每周5次,持續(xù)8周。在8周訓(xùn)練結(jié)束時(shí)后1周內(nèi)完成感覺認(rèn)知相關(guān)功能測(cè)試,后續(xù)頸椎脫臼處死小鼠,用于Western 印跡測(cè)試標(biāo)本速入預(yù)冷的EP管內(nèi),-80 ℃超低溫冰箱保存待用。用于組織學(xué)制片標(biāo)本速入中性甲醛固定24 h后制片和染色。

1.4 脫粘測(cè)試

通過脫粘測(cè)試(adhesive removal test)評(píng)估小鼠感覺運(yùn)動(dòng)障礙程度[23, 24]。在8周訓(xùn)練前和訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)行小鼠脫粘測(cè)試。將Tough-Spots diameter 3/8圓標(biāo)簽紙(北京海德生物公司)粘于小鼠前爪,記錄小鼠第1次發(fā)現(xiàn)粘貼物并開始搖動(dòng)前爪或?qū)⑵浞胖米爝叺臅r(shí)間,即為反應(yīng)潛伏期的時(shí)長(zhǎng);記錄小鼠成功撕除標(biāo)簽紙所需的時(shí)間。

1.5 Y迷宮測(cè)試

Y型迷宮測(cè)試用于評(píng)估空間學(xué)習(xí)能力[25]。測(cè)試裝置由3個(gè)相同的空間臂組成(30 cm長(zhǎng),8 cm寬,16 cm高)以120°等角度放置。在測(cè)試中,小鼠被放在固定臂的中間,面向迷宮的中心。然后允許小鼠在迷宮中自由探索8 min。當(dāng)小鼠的4個(gè)爪子都越過中心區(qū)的門檻并進(jìn)入空間臂,并且動(dòng)物的鼻子朝向臂的末端時(shí),就被定義為進(jìn)入1個(gè)臂。1次正確的交替被定義為小鼠在連續(xù)3次進(jìn)入迷宮不同的臂。交替的最大次數(shù)等于小鼠進(jìn)入的手臂之和減去2。自發(fā)交替率用以下公式計(jì)算:自發(fā)交替率=(正確交替次數(shù)/最大交替次數(shù))×100%。同時(shí),記錄進(jìn)入的總臂數(shù)。

1.6 新型物體識(shí)別測(cè)試

新型物體識(shí)別測(cè)試(novel object recognition,NOR)是在1個(gè)無光澤的白色盒子(30×30×30 cm3)中進(jìn)行,用于評(píng)估長(zhǎng)期記憶和空間記憶[26]。連續(xù)3 d對(duì)空盒子進(jìn)行了20 min的習(xí)慣性訓(xùn)練。在任務(wù)的第4 d,動(dòng)物被進(jìn)入到訓(xùn)練階段,包括對(duì)2個(gè)相等的物體(玻璃瓶)進(jìn)行10 min的探索。第5 d,在新物體識(shí)別階段,熟悉的物體之一被新的物體(積木)取代,小鼠被放置在競(jìng)技場(chǎng)中,并允許探索這2種物體10 min。這項(xiàng)試驗(yàn)評(píng)估了第1次接觸后24 h內(nèi)識(shí)別新物體的能力,評(píng)價(jià)了長(zhǎng)期識(shí)別記憶。在籠子里間隔1 h,新物體被移到盒子的另一側(cè),允許小鼠探索這個(gè)新位置。在總的探索時(shí)間中,對(duì)新的或移位的物體的探索時(shí)間被用作衡量物體偏好的標(biāo)準(zhǔn),分別反映長(zhǎng)期記憶和空間記憶能力。

1.7 前額葉HE、Nissl和TUNEL染色

小鼠麻醉后PBS和4%多聚甲醛灌流。灌流完畢速取全腦,浸入4%多聚甲醛過夜再固定。樣品經(jīng)水洗、脫水、透明、石蠟包埋后切片,用于HE與Nissl染色,觀察前額葉神經(jīng)元形態(tài)及尼氏體溶解情況。樣品經(jīng)蔗糖溶液置換沉底和OCT包埋后制作冰凍切片,TUNEL評(píng)估前額葉神經(jīng)元凋亡水平,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。染色切片過程中,每組選擇3個(gè)樣品,每個(gè)樣品中選擇3個(gè)切片,在每個(gè)切片中選擇3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù),其中HE染色統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)藍(lán)紫色細(xì)胞核數(shù)量,Nissl染色通過Image J計(jì)算視野內(nèi)尼氏小體整體光密度,TUNEL染色通過計(jì)算視野內(nèi)紅色陽性凋亡顆粒數(shù)量。最終得到每組樣品的最終數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 生化試劑盒檢測(cè)

前額葉總超氧化物歧化酶(Total Superoxide Dismutase,T-SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量均使用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測(cè),活性氧(reactive oxygen species,ROS)使用上海研生生化公司ELISA試劑盒檢測(cè),每組數(shù)據(jù)都由3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到,且每次重復(fù)試驗(yàn)選擇同組中的不同樣品,步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 前額葉Western 印跡檢測(cè)

Western 印跡檢測(cè),采用常規(guī)預(yù)冷蛋白質(zhì)抽提試劑并勻漿,4 ℃離心后取上清液,BCA蛋白質(zhì)定量。常規(guī)制膠、上樣、電泳和轉(zhuǎn)膜,5%BSA室溫封閉1 h,孵育一抗PGC-1α、Irisin、BDNF、Bcl-2、Bax、裂解胱天蛋白酶3、IL-10、IL-1β、TNF-α、NF-κB(1∶1 000),內(nèi)參為GAPDH和β-微管蛋白(1∶5 000),4 ℃過夜。次日室溫復(fù)溫30 min,TBST清洗5 min/次×3次,室溫孵育二抗(1∶5 000)1 h,TBST清洗二抗5 min/次×3次,ECL發(fā)光,多色凝膠成像系統(tǒng)成像與分析。

1.10 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Western 印跡結(jié)果圖像用Image J進(jìn)行處理分析。光學(xué)顯微鏡拍攝圖像并用Image-ProPlus5.1軟件處理分析。所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ±SD)表示,SPSS23.0統(tǒng)計(jì),組間比較采用單因素方差分析,Graph Pad Prism 8作圖,顯著性水平選擇P<0.05和P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)改善減輕小鼠體重并改善認(rèn)知功能障礙

經(jīng)與高脂喂養(yǎng)前相比,高脂喂養(yǎng)后小鼠平均體重和血清TG增長(zhǎng)幅度超過20%(P<0.01)(Fig.1A和B)。表明肥胖模型制備成功。

Fig.1 Results of obesity and cognitive function in mice (A and B) Trend of body weight and blood lipids changes in each group of mice during high-fat feeding and exercise intervention. (C and D) Body weight and blood lipid levels among different groups of mice after exercise intervention. (E and F). Reaction times of mice in each group in adhesive removal test. (G and H) Results of the Y-maze tests for each group of mice. (I and J) Results of novel object recognition test for each group of mice. Data were presented as means ± SD (n=10). *P<0.05, **P<0.01

經(jīng)與CON組比較,HFD組體重和TG均顯著增加(P<0.01),與HFD組比較,HFD+MICT組和HFD+HIIT組體重和TG均顯著降低(P<0.01)(Fig.1C和D)。表明持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)均顯著降低高脂喂養(yǎng)后小鼠肥胖水平。

脫粘實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與CON組比較,HFD組反應(yīng)潛伏期的時(shí)長(zhǎng)和成功撕除標(biāo)簽所需的時(shí)間顯著增加(P<0.01);與HFD組比較,HFD+MICT和HFD+HIIT組反應(yīng)潛伏期的時(shí)長(zhǎng)和成功撕除標(biāo)簽所需的時(shí)間顯著減少(P<0.01)(Fig.1E和1F);較HFD+MICT組,HFD+HIIT組成功撕除標(biāo)簽所需的時(shí)間更短(P<0.05)表明肥胖小鼠出現(xiàn)感覺反應(yīng)功能障礙,而持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)可顯著改善肥胖小鼠前額葉的感覺反應(yīng)功能,其中間歇運(yùn)動(dòng)效果略優(yōu)。

Y迷宮試驗(yàn)結(jié)果顯示,與CON組小鼠相比,HFD組自發(fā)交替的百分比顯著降低(P<0.01)。HFD+MICT和HFD+HIIT組小鼠與HFD小鼠相比,自發(fā)交替的百分比顯著增加(P<0.05,P<0.01);較HFD+MICT組和HFD+HIIT組自發(fā)交替的百分比更高(P<0.05)(Fig.1G和1H)。4組之間進(jìn)入迷宮臂的總數(shù)未見顯著差異。結(jié)果顯示,HFD組的空間工作能力受損,持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)能顯著改善空間學(xué)習(xí)能力,且間歇運(yùn)動(dòng)效果略優(yōu)。

NOR的結(jié)果顯示,與CON組小鼠相比,HFD組小鼠新物體及位移物體的探索時(shí)間百分比顯著降低(P<0.01)。而HFD+MICT和HFD+HIIT組小鼠與HFD小鼠相比,新物體及位移物體的探索時(shí)間百分比顯著增加(P<0.05,P<0.01);較HFD+MICT組,HFD+HIIT組位移物體的探索時(shí)間百分比更長(zhǎng)(P<0.05)(Fig.1I和1J)。結(jié)果顯示,HFD組的長(zhǎng)期和空間記憶受損,持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)能顯著改善長(zhǎng)期和空間記憶,且間歇運(yùn)動(dòng)效果略優(yōu)。

2.2 持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)顯著改善肥胖小鼠前額葉損傷

前額葉HE和Nissl染色結(jié)果顯示,與CON組比較,HFD組前額葉神經(jīng)元排列疏散,出現(xiàn)神經(jīng)元固縮,殘存細(xì)胞皺縮變形,細(xì)胞核數(shù)量顯著減少(P<0.01),尼氏體明顯模糊并減少呈空泡狀,部分核仁消失;與HFD組比較,HFD+MICT和HFD+HIIT組前額葉神經(jīng)元胞體呈圓形或橢圓形,核仁明顯,細(xì)胞核數(shù)量顯著增多,尼氏體與核仁變得清晰可見(P<0.05,P<0.01);較HFD+MICT組,HFD+HIIT組細(xì)胞核數(shù)量更多(P<0.05)(Fig.2A,2B和2C)。TUNEL染色結(jié)果顯示,與CON組比較,HFD組前額葉TUNEL陽性顆粒顯著增加,神經(jīng)元凋亡增多(P<0.01);與HFD組比較,HFD+MICT和HFD+HIIT組前額葉神經(jīng)元凋亡明顯減少(P<0.01)(Fig.2A和2 D)。結(jié)果表明,肥胖小鼠前額葉出現(xiàn)一定程度神經(jīng)元損傷和代謝功能下降,而持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)會(huì)顯著改善肥胖小鼠的神經(jīng)結(jié)構(gòu)損傷,且間歇運(yùn)動(dòng)效果略優(yōu)。

Fig.2 The results of HE, Nissl and TUNEL staining of prefrontal lobe in obese mice (A and B) HE staining and statistical results of mice prefrontal cortex. (A and C) Nissl staining and statistical results of mice prefrontal cortex. (A and D) TUNEL staining and statistical results of mice prefrontal cortex. Data were presented as means ± SD (n=3). *P<0.05, **P<0.01

2.3 持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)顯著上調(diào)肥胖小鼠前額葉PGC-1α/Irisin/BDNF表達(dá)

Western 印跡結(jié)果顯示,與CON組比較,HFD組前額葉PGC-1α、Irisin和BDNF表達(dá)顯著減少(P<0.05,P<0.01);與HFD組比較,HFD+MICT和HFD+HIIT組PGC-1α、Irisin和BDNF表達(dá)顯著增加(P<0.01),且HFD+HIIT較HFD+MICT的激活程度更高(P<0.05,P<0.01)(Fig.3)。表明肥胖小鼠前額葉PGC-1α/Irisin/BDNF較正常小鼠激活程度不足,而持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)能激活該通路,且間歇運(yùn)動(dòng)效果更好。

Fig.3 Comparison of the protein levels of PGC-1α, Irisin and BDNF in prefrontal lobe of obese mice Western blotting for PGC-1α, Irisin and BDNF expression. Data were presented as means ± SD (n=3). *P<0.05, **P<0.01

2.4 抗阻運(yùn)動(dòng)顯著提高肥胖小鼠前額葉抗氧化能力并抑制炎癥和細(xì)胞凋亡

試劑盒檢測(cè)和Western 印跡結(jié)果顯示,與CON組比較,HFD組前額葉MDA和ROS水平顯著升高(P<0.01),T-SOD水平顯著降低(P<0.01);與HFD組比較,HFD+MICT和HFD+HIIT組MDA和ROS水平顯著降低(P<0.01),T-SOD水平顯著升高(P<0.01)(Fig.4)。研究結(jié)果表明,持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)會(huì)顯著提高肥胖小鼠前額葉抗氧化能力,降低氧化應(yīng)激水平。

Fig.4 Comparison of the levels of MDA, ROS and T-SOD in prefrontal lobe of obese mice Biochemical assay kit results for MDA, ROS and T-SOD levels in the prefrontal cortex. Data were presented as means ± SD (n=3). *P<0.05, **P<0.01

Western 印跡結(jié)果顯示,與CON組比較,HFD組前額葉IL-10蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),TNF-α、NF-κB和IL-1β蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);與HFD組比較,HFD+MICT和HFD+HIIT組IL-10蛋白表達(dá)顯著提高(P<0.01),TNF-α、NF-κB和IL-1β蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低(P<0.01)(Fig.5)。結(jié)果表明,肥胖小鼠前額葉炎癥水平較高,抗炎能力較低,而持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)能顯著提升抗炎能力,降低炎癥水平。

Fig.5 Comparison of the protein levels of IL-10, IL-1β, TNF-α, and NF-κB in prefrontal lobe of obese mice Western blotting for IL-10, IL-1β, TNF-α, and NF-κB expression. Data were presented as means ± SD (n=3). *P<0.05, **P<0.01

Western 印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,與CON組比較,HFD組前額葉裂解胱天蛋白酶3表達(dá)和Bax/Bcl-2比值顯著升高(P<0.01);與HFD組比較,HFD+MICT和HFD+HIIT組裂解胱天蛋白酶3表達(dá)和Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.01)(Fig.6)。表明持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)會(huì)顯著抑制肥胖小鼠前額葉細(xì)胞凋亡。

Fig.6 Comparison of the protein levels of Bax, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 in prefrontal lobe of obese mice Western blotting for Bax, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 expression. Data were presented as means ± SD (n=3). *P<0.05, **P<0.01

3 討論

腦功能受多種生理病理因素影響[27]。運(yùn)動(dòng)可降低大腦氧化應(yīng)激和炎癥水平,促進(jìn)神經(jīng)元存活和生長(zhǎng),改善部分腦區(qū)結(jié)構(gòu)與功能損傷[28-30]。脂肪組織過量和內(nèi)分泌紊亂會(huì)引起全身性的過度氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)元凋亡和膠質(zhì)細(xì)胞的病理性活化,導(dǎo)致部分腦區(qū)結(jié)構(gòu)與功能受損[31]。因此,抑制相關(guān)腦區(qū)(例如前額葉)的過度氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),對(duì)減輕肥胖誘導(dǎo)的相關(guān)腦區(qū)結(jié)構(gòu)與損傷具有重要意義。

前額葉與認(rèn)知功能密切相關(guān),認(rèn)知功能包括感覺運(yùn)動(dòng)能力、學(xué)習(xí)能力和記憶能力等方面;其中,感覺運(yùn)動(dòng)能力與脫粘試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)掛鉤,其反映前額葉感覺運(yùn)動(dòng)功能是否正常;Y迷宮測(cè)試中的自發(fā)交替率則評(píng)估空間學(xué)習(xí)能力;NOR測(cè)試中總探索時(shí)間和對(duì)新的或移位的物體的探索時(shí)間則分別反映長(zhǎng)期記憶和空間記憶能力[23, 25, 26]。尼氏體是神經(jīng)元中合成蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)酶類以及神經(jīng)調(diào)質(zhì)的細(xì)胞器,在代謝功能旺盛的前額葉神經(jīng)元中尼氏體極豐富,當(dāng)前額葉中的神經(jīng)元出現(xiàn)損傷時(shí),尼氏體會(huì)發(fā)生解體甚至消失;當(dāng)前額葉損傷得到恢復(fù)后,尼氏體重新出現(xiàn),甚至?xí)謴?fù)至正常水平,因此,尼氏體數(shù)量直接反映前額葉神經(jīng)元代謝功能[32]。本研究形態(tài)學(xué)和功能學(xué)結(jié)果顯示,前額葉發(fā)生神經(jīng)元固縮,殘存細(xì)胞皺縮變形,尼氏體數(shù)量顯著減少,凋亡細(xì)胞數(shù)量增多;肥胖小鼠脫粘反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)顯著增加,自發(fā)交替百分比顯著、新物體及位移物體的探索時(shí)間百分比顯著降低。研究表明,肥胖小鼠前額葉出現(xiàn)一定程度的神經(jīng)元損傷和代謝功能下降,伴隨感覺運(yùn)動(dòng)、空間學(xué)習(xí)和記憶等功能受損;而MICT和HIIT顯著減輕前額葉神經(jīng)元尼氏體消解和細(xì)胞凋亡,促進(jìn)尼氏體恢復(fù)及神經(jīng)元存活,提高神經(jīng)元代謝效率,改善前額葉結(jié)構(gòu)受損,進(jìn)而緩解認(rèn)知功能障礙。本研究證明了MICT和HIIT可以顯著改善肥胖誘導(dǎo)的前額葉損傷和認(rèn)知功能障礙。

文獻(xiàn)表明,PGC-1α可減輕神經(jīng)元損傷,緩解增齡性和退行性神經(jīng)疾病的發(fā)展進(jìn)程[33-35]。PGC-1α級(jí)聯(lián)Irisin/BDNF,促進(jìn)抑郁小鼠前額葉皮層和海馬神經(jīng)可塑性,抑制過度氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[36, 37]。Irisin和BDNF通過激活A(yù)kt和ERK1/2或Notch信號(hào)通路促進(jìn)血管生成,減輕腦梗塞、腦水腫導(dǎo)致的腦損傷[38]。運(yùn)動(dòng)促進(jìn)PGC-1α釋放,激活I(lǐng)risin-BDNF通路,調(diào)節(jié)下游抗氧化因子活性保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受ROS侵襲,緩解增齡性抑郁焦慮樣情緒和認(rèn)知功能障礙,表明高水平的PGC-1α/Irisin/BDNF對(duì)多個(gè)腦區(qū)發(fā)揮保護(hù)作用[39, 40]。本文證實(shí),MICT和HIIT均顯著促進(jìn)肥胖小鼠前額葉PGC-1α/Irisin/BDNF表達(dá),發(fā)揮對(duì)前額葉的保護(hù)效應(yīng),且中高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)作用更顯著。

研究表明,脂肪組織的過度增生可誘發(fā)全身炎癥和過度氧化應(yīng)激,進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)炎癥與細(xì)胞凋亡,最終導(dǎo)致部分腦結(jié)構(gòu)和功能損傷[6-8]。運(yùn)動(dòng)可激活衰老大鼠海馬PGC-1α/Irisin/BDNF通路,改善增齡誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙,Irisin和BDNF的高表達(dá)緩解海馬氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[40]。大量研究表明,運(yùn)動(dòng)可降低動(dòng)脈粥樣硬化小鼠大腦促炎因子IL-1β、TNF-α、NF-κB以及氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA水平,提高抗氧化酶SOD水平[41];降低腦炎性大鼠大腦皮層中促凋亡因子胱天蛋白酶3(Caspase-3)水平和Bax/Bcl-2比值,抑制細(xì)胞過度凋亡[42];抑制小鼠海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞病理性重塑,發(fā)揮對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用,改善認(rèn)知功能[43]。本研究證實(shí),8周MICT和HIIT降低前額葉促炎因子IL-1β、TNF-α和NF-κB,促凋亡蛋白Bax、裂解胱天蛋白酶3以及ROS和MDA水平,提高抗炎因子IL-10、抗凋亡蛋白Bcl-2、抗氧化酶T-SOD水平,結(jié)果表明,MICT和HIIT有效提高了肥胖小鼠前額葉抗氧化和抗炎能力,降低炎癥和氧化應(yīng)激水平,抑制細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明,MICT和HIIT抑制前額葉過度氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,其可能與運(yùn)動(dòng)提高小鼠前額葉中PGC-1α/Irisin/BDNF的表達(dá)關(guān)系密切。此外,PGC-1α通過級(jí)聯(lián)Irisin通路,增強(qiáng)線粒體功能,促進(jìn)了白色脂肪組織褐色化,提高全身能量代謝,緩解脂肪的進(jìn)一步增加[44, 45]。表明運(yùn)動(dòng)可能還通過促進(jìn)能量消耗,減少脂肪堆積,緩解全身慢性炎癥,減少肥胖帶來的負(fù)面影響,間接發(fā)揮對(duì)前額葉的保護(hù)作用。

本研究證實(shí),運(yùn)動(dòng)一方面上調(diào)PGC-1α/Irisin/BDNF表達(dá),另一方面抑制過度炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,最終緩解了肥胖小鼠前額葉損傷,為防治肥胖誘導(dǎo)的腦損傷及其相關(guān)疾病提供了靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究還發(fā)現(xiàn),PGC-1α/Irisin/BDNF的激活與炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡水平降低關(guān)系密切。未來有望通過基因敲除阻斷PGC-1α/Irisin/BDNF或者離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證二者的因果關(guān)系。此外,本文還發(fā)現(xiàn),HIIT在減輕肥胖小鼠前額葉損傷和改善認(rèn)知功能障礙的效果優(yōu)于MICT。這表明,前額葉結(jié)構(gòu)和功能的改善可能受到運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的調(diào)節(jié)。研究證實(shí),HIIT作為短時(shí)間的劇烈無氧運(yùn)動(dòng)與恢復(fù)期交替進(jìn)行的鍛煉模式,相比MICT可以更大幅提升大鼠海馬、血清、骨骼肌或心血管等多組織器官PGC-1α、Irisin和BDNF的表達(dá)水平[46-49]。此外,從肌肉募集角度看,HIIT作為一種結(jié)合了有氧和力量的訓(xùn)練范式,比單純的有氧運(yùn)動(dòng)能募集更多的肌群,即同時(shí)刺激Ⅰ型肌纖維和Ⅱ型肌纖維,在提高肌肉耐力和爆發(fā)力外還在更大程度上促進(jìn)肌肉因子的分泌和釋放,并通過循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮對(duì)前額葉的保護(hù)作用[50, 51]。近期研究表明,在同等時(shí)間下HIIT相較MICT可消耗更過量的氧氣并增強(qiáng)脂肪的氧化,并改善基礎(chǔ)代謝率,提高減脂效率[52, 53]。上述結(jié)果結(jié)合本研究,推測(cè)HIIT對(duì)于改善肥胖小鼠前額葉損傷和增強(qiáng)認(rèn)知功能是一種更高效的運(yùn)動(dòng)方案,其潛在機(jī)制可能涉及三方面,一方面HIIT較MICT可以在更大程度上調(diào)前額葉自身的PGC-1α/Irisin/BDNF水平,直接發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元更深層次的保護(hù)作用;另一方面HIIT在更大程度上促進(jìn)骨骼肌分泌并釋放肌肉因子,例如Irisin,通過循環(huán)系統(tǒng)間接作用于前額葉并改善認(rèn)知功能;此外HIIT還可以高效促進(jìn)脂肪分解,減輕肥胖對(duì)于前額葉帶來的負(fù)面影響,從側(cè)面改善前額葉功能。

持續(xù)和間歇運(yùn)動(dòng)可顯著上調(diào)肥胖小鼠前額葉PGC-1α/Irisin/BDNF表達(dá)水平,減輕氧化應(yīng)激和炎癥,改善神經(jīng)元尼氏體消解,抑制細(xì)胞凋亡,減輕肥胖小鼠前額葉損傷并改善認(rèn)知功能障礙,且HIIT效果優(yōu)于MICT。