葛根素抑制NF-κB/MAPK通路治療雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎

吳超俊，王桂良，邱萍，徐林芳，龔敏，李興，文劍波

葛根素抑制NF-κB/MAPK通路治療雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎

吳超俊，王桂良，邱萍，徐林芳，龔敏，李興，文劍波

萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院消化內科，江西萍鄉(xiāng) 337000

探討葛根素抑制核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路治療雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎的分子機制。將24只SPF級健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為四組：空白對照組、葛根素組、雨蛙素組、葛根素+雨蛙素組，觀察四組小鼠的生物學行為變化，分析血清脂肪酶、淀粉酶、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10濃度及胰腺組織p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-IκB-α、IκB-α、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白水平。與空白對照組比較，葛根素組小鼠的生物學行為、生理特征、病理指數和血清脂肪酶、淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10濃度及胰腺組織的p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-IκB-α、IκB-α、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（>0.05），雨蛙素組小鼠的病理指數與血清脂肪酶、淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10濃度及胰腺組織的p-NF-κBp65、p-IκB-α、p-ERKl/2、p-p38和p-JNK蛋白水平顯著升高；與雨蛙素組比較，葛根素+雨蛙素組小鼠的癥狀緩解，病理指數和血清脂肪酶、淀粉酶、TNF-α、IL-6濃度及胰腺組織的p-NF-κBp65、p-IκB-α、p-ERKl/2、p-p38和p-JNK蛋白水平顯著降低，血清IL-10濃度顯著升高。葛根素可通過抑制NF-κB/MAPK信號通路治療雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎。

急性胰腺炎；葛根素；絲裂原活化蛋白激酶；核因子κB

急性胰腺炎是臨床上常見的危重病，發(fā)病機制復雜，進展快[1]。炎癥介質和細胞因子在發(fā)病過程中起重要作用，進入血液循環(huán)后進一步激活其他炎癥細胞，釋放更多的炎癥介質，形成級聯(lián)放大效應，加劇全身反應。絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）路徑和核因子-κB（nuclear factor -κB，NF-κB）信號通路是影響急性胰腺炎發(fā)生和發(fā)展的非常重要的信號通路，通過調控多種炎癥因子及炎性細胞的浸潤促進胰腺組織炎癥反應[2-3]。葛根素是從中藥葛根中提取的一種異黃酮類化合物，化學名為4,7-二羥基8β-D-吡喃葡萄糖醛基異黃酮，分子式為C21H20O9，具有抗炎、介導免疫細胞激活、調節(jié)炎癥因子表達及炎性信號通路轉導等作用[4]。葛根素能通過多條信號通路發(fā)揮抗炎作用，本研究以NF-κB和p38MAPK信號通路為靶點，探索葛根素對雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

動物SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，體質量18～22g，購自江西中醫(yī)藥大學動物部。葛根素注射液（生產批號：1009056，生產單位：成都地奧九泓制藥廠，規(guī)格：25mg/ml，2 ml/支）；雨蛙素購自美國Sigma公司；SYBR-GREEN PCR Kit購自日本TAKARA公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和IL-10 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）檢測試劑盒購自博士德生物工程有限公司；p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-IκB-α、IκB-α、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p38、p-JNK、JNK和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（recombinant glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購自美國Abcam公司。本研究經萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會審批通過（倫理審批號：2022A004-HS02）。

1.2 方法

1.2.1 動物建模與分組 24只C57BL/6小鼠，禁食12h，按照隨機數表法分為四組：空白對照組、葛根素組、雨蛙素組、葛根素+雨蛙素組，每組6只。空白對照組腹腔注射生理鹽水；葛根素組給予葛根素1.3ml/kg注射液腹腔注射；雨蛙素組給予腹腔注射雨蛙素50μg/kg，間隔1h注射1次，共7次，末次注射雨蛙素后腹腔注射脂多糖10mg/kg；葛根素+雨蛙素組給予腹腔注射50μg/kg雨蛙素，間隔1h注射1次，共7次，末次注射雨蛙素后腹腔注射脂多糖10mg/kg，1h后，給予葛根素注射液腹腔注射（1.3ml/kg）。48h后使用乙醚麻醉小鼠，采用眼球取血法，取血500～800μl，4℃靜置過夜后離心機離心取上層血清，置于4℃冰箱保存。處死小鼠后無菌條件下解剖小鼠，取出胰腺組織，剖離外層結締組織后，一部分置于–80℃冰箱，一部分放置于4%甲醛中。

1.2.2 病理形態(tài)學檢測 取各組小鼠胰腺組織，經10%中性甲醛固定48h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，蘇木精–伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色，在光學顯微鏡下，隨機采集10處代表性圖像進行病理學分析。按照水腫、炎癥、出血、壞死程度評估胰腺組織的病理學損傷，參照 Amy法進行胰腺病理組織評分。評分標準：水腫>50%的葉間增寬并伴有破壞、分離的腺泡細胞計3分，20%～50%的廣泛小葉間隙增寬計2分，<20%的小葉間隙局部增寬計1分，無以上特征計0分；炎性浸潤：炎性細胞出現(xiàn)在胰腺實質>50%小葉計3分，<50%小葉計2分，炎性細胞出現(xiàn)在導管周圍或導管區(qū)域計1分，無以上特征計0分；壞死：20%～50%的廣泛胰腺實質壞死計3分，5%～20%的局灶性壞死計2分，>50%的導管周圍壞死計1分。胰腺總損傷評分為3項評分的總和。

1.2.3 ELISA檢測血清炎性因子水平 嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀在波長490nm處測定各樣品吸光度值，計算血清中TNF-α、IL-lβ、IL-6和IL-10水平。

1.2.4 Western blotting法測定p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-IκB-α、IκB-α、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白表達 剪取部分胰腺組織，液氮研磨后采用蛋白裂解液提取總蛋白，加入組織裂解液裂解，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法進行蛋白定量，加5×上樣緩沖液煮沸10min，進行十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳，經聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入一抗（1∶1000）稀釋液，室溫孵育2h，繼以辣根酶標記的二抗（1∶5000）稀釋液室溫孵育1h，用增強型化學發(fā)光試劑（electro- chemi-luminescence，ECL）顯色檢測蛋白信號，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行圖片采集，用Image Pro Plus圖像分析軟件分析各陽性條帶的積分灰度值，以作為GAPDH參照蛋白進行校準，計算各目標蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 四組小鼠的一般情況觀察

空白對照組及葛根素組小鼠皮毛濃密光澤、反應靈敏、呼吸正常、行為活躍、飲食飲水正常。雨蛙素組表現(xiàn)為瞇眼、皮毛雜亂失澤、倦臥嗜睡、反應遲鈍、少食怠動、消瘦倦臥、全身顫抖、腹瀉。葛根素+雨蛙素組小鼠癥狀改善。

2.2 四組小鼠的胰腺病理指數比較

空白對照組和葛根素組的胰腺組織中可觀察到完整的腺泡小葉，腺泡細胞排列緊密且胞間無間質性水腫。與空白對照組比較，葛根素組病理損傷指數差異無統(tǒng)計學意義（>0.05），雨蛙素組病理損傷指數顯著升高；與雨蛙素組比較，葛根素+雨蛙素組的胰腺病理損傷指數顯著降低，見圖1、圖2。

圖1 四組小鼠的胰腺組織HE染色結果

A.空白對照組；B.葛根素組；C.雨蛙素組；D.葛根素+雨蛙素組

圖2 四組小鼠的胰腺病理損傷指數比較

注：與空白對照組比較，*<0.05；與雨蛙素組比較，#<0.05

2.3 四組小鼠的血清脂肪酶及淀粉酶濃度比較

與空白對照組比較，葛根素組小鼠的脂肪酶及淀粉酶濃度差異無統(tǒng)計學意義，雨蛙素組小鼠的脂肪酶及淀粉酶濃度顯著升高；與雨蛙素組比較，葛根素+雨蛙素組小鼠的胰腺脂肪酶及淀粉酶濃度顯著降低，見圖3。

2.4 四組小鼠中血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平比較

與空白對照組比較，葛根素組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10濃度差異無統(tǒng)計學意義，雨蛙素組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10濃度顯著升高；與雨蛙素組比較，葛根素+雨蛙素組小鼠血清中TNF-α和IL-6濃度顯著降低，IL-10濃度顯著升高，見圖4。

2.5 四組小鼠胰腺組織中p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-IκB-α、IκB-α、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白水平比較

與空白對照組比較，葛根素組小鼠胰腺組織中p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-IκB-α、IκB-α、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p38、p-JNK 和JNK蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義，雨蛙素組小鼠胰腺組織中p-NF-κBp65、p-IκB-α、p-ERKl/2、p-p38、p-JNK水平顯著升高，而NF-κBp65、IκB-α、ERKl/2、p38和JNK蛋白無顯著變化；與雨蛙素組比較，葛根素+雨蛙素組小鼠胰腺組織中p-NF-κBp65、p-IκB-α、p-ERKl/2、p-p38、p-JNK蛋白水平顯著降低，而NF-κBp65、IκB-α、ERKl/2、p38和JNK蛋白無顯著變化，見圖5。

3 討論

急性胰腺炎發(fā)病機制復雜，涉及多環(huán)節(jié)、多因素，如炎癥介質、促炎細胞因子的大量釋放等，胰腺內被異常激活，從而導致胰腺組織的自身消化、水腫、出血、壞死[5]。炎癥信號通路在胰腺炎的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，NF-κB和MAPK信號是兩條非常關鍵的信號通路，二者通過調控多種炎癥因子及炎性細胞的浸潤促進胰腺組織炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展[6]。生理情況下NF-κB磷酸化位點被IκB封閉，處于無活性狀態(tài)；在各種炎性損傷中，上游κB抑制因子激酶（inhibitor of κB kinase，IκK）降解IκB后，使p50的核定位信號暴露，攜帶p65迅速轉移至核內，p65則可識別特定的DNA序列，與某些炎癥因子基因啟動區(qū)或增強子上的κB位點結合，啟動炎癥因子黏附分子炎癥反應相關酶相關基因轉錄，誘導多種炎性介質的表達。MAPK的磷酸化在多器官纖維化中發(fā)揮重要作用，由ERK1/2、JNK、p38MAPK介導的3條級聯(lián)反應可促進炎癥細胞因子的生成而加劇炎癥反應。急性胰腺炎過程中p38MAPK被激活，參加炎癥反應與細胞應激、凋亡等，調控多種細胞因子的轉錄[7]。p38MAPK信號通路與NF-κB信號途徑相互影響，p38MAPK信號通路可促進IκB-α的磷酸化和降解，進而激活NF-κB通路[8]。各種炎癥細胞的聚集與活化導致腺泡細胞的進一步損傷，并引起促炎因子表達上調，形成級聯(lián)放大反應，產生全身炎癥反應綜合征，甚至多器官功能障礙[9]。TNF‐α是重癥急性胰腺炎中釋放最早、最重要的促炎因子，其主要來源是單核巨噬細胞和T淋巴細胞，可通過多種細胞促進多種炎癥介質及細胞因子的產生，引起多器官功能損傷[10]。IL-6是一種多效性細胞因子，通常在組織中產生并釋放到循環(huán)系統(tǒng)中而造成穩(wěn)態(tài)擾動，進而引起內毒素肺損傷、急性感染等[11]。IL-1β的局部激活是介導促炎反應的中心環(huán)節(jié)，導致繼發(fā)性炎癥介質的激活[12]。IL-10是一種重要的抗炎癥細胞因子，由Th2細胞產生，具有抑制Th1產生細胞因子的作用，能有效抑制巨噬細胞的MHC-2分子表達，從而抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等促炎因子的合成，減輕炎癥損害[13]。

圖3 四組小鼠的血清脂肪酶及淀粉酶濃度比較

A.血清脂肪酶濃度；B.血清淀粉酶濃度

注：與空白對照組比較，*<0.05；與雨蛙素組比較，#<0.05

圖4 四組小鼠的血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10濃度比較

A.TNF-α濃度；B.IL-1β濃度；C.IL-6濃度；D.IL-10濃度

注：與空白對照組比較，*<0.05；與雨蛙素組比較，#<0.05

圖5 四組小鼠的p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-IκB-α、IκB-α、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白水平比較

葛根素對多器官有良好的抗炎和抗纖維化作用[14]。Li等[15]發(fā)現(xiàn)葛根素對橫主動脈收縮引起的心肌纖維化有保護作用，這可能與PPAR-γ的上調和TGF-1/ smad2介導的內皮–間質轉化的抑制有關。葛根素能阻滯β受體，抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎、利尿、調節(jié)血壓和血糖血脂、調節(jié)炎性細胞因子及信號通路，抑制促炎因子對中性粒細胞的趨化作用，但對胰腺炎的治療作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，葛根素組小鼠的生物學行為、生理特征無明顯改變，病理指數、脂肪酶和淀粉酶濃度及血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10濃度及胰腺組織的p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-IκB-α、IκB-α、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白水平無統(tǒng)計學差異，說明葛根素幾乎沒有毒副作用，安全性很好。雨蛙素組病理指數、血清脂肪酶和淀粉酶濃度與血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10濃度及胰腺組織的p-NF-κBp65、p-IκB-α、p-ERKl/2、p-p38和p-JNK水平顯著升高，而NF-κBp65、IκB-α、ERKl/2、p38和JNK蛋白無顯著變化，說明雨蛙素可誘導小鼠胰腺炎的發(fā)生，導致胰腺組織損傷，NF-κB通路激活，p-NF-κBp65、p-IκB-α蛋白濃度升高，p-NF-κB進入細胞核，啟動促炎因子和抗炎因子的轉錄和蛋白表達，MAPK通路激活，p-IκB-α、p-ERKl/2、p-p38和p-JNK蛋白濃度升高，啟動炎癥因子的轉錄和蛋白表達。與雨蛙素組比較，葛根素+雨蛙素組小鼠癥狀緩解、病理指數、血清脂肪酶和淀粉酶濃度與血清TNF-α和IL-6濃度及胰腺組織的p-NF-κBp65、p-IκB-α、p-ERKl/2、p-p38和p-JNK蛋白水平顯著降低，血清IL-10濃度顯著升高，而NF-κBp65、IκB-α、ERKl/2、p38和JNK蛋白無顯著變化，說明葛根素能抑制NF-κB的磷酸化和MAPK通路蛋白的磷酸化和激活，抑制促炎因子的表達，促進抗炎因子的表達，減輕胰腺組織的病理損傷，發(fā)揮保護作用。

綜上所述，葛根素安全性好，能通過抑制NF-κB/ MAPK信號通路治療雨蛙素誘導的小鼠急性胰腺炎。

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Puerarin inhibits NF-κB/MAPK signaling pathway in treatment of caerulein- induced acute pancreatitis in mice

Department of Gastroenterology, Pingxiang People’s Hospital, Pingxiang 337000, Jiangxi, China

To investigate the role of puerarin inhibiting nuclear factor κB (NF-κB)/mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway in the treatment of caerulein-induced acute pancreatitis in mice.24 SPF healthy male C57BL/6 mice were randomly assigned into four groups: Placebo group, puerarin group, caerulein group, puerarin + caerulein group. The biological behavior changes of the four groups were observed. The concentrations of serum lipase and amylase, tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β, IL-6 and IL-10 were detected. The protein levels of p-NF-κBp65、NF-κBp65、p-IκB-α、IκB-α、p-ERKl/2、ERKl/2、p-p38、p38、p-JNK and JNK in the pancreatic tissues were detected.Compared with the placebo group, there were no significances in the biological behavior, physiological characteristics, pathological index, serum lipase concentration, amylase concentration, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 concentration, p-NF-κBp65, NF-κBp65, p-IκB-α, IκB-α, p-ERKl/2, ERKl/2, p-p38, p38, p-JNK, JNK in the pancreatic tissue in puerarin group (>0.05). The pathological index, serum lipase, amylase, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 concentration, p-NF-κBp65, p-IκB-α, p-ERKl/2, p-p38, p-JNK protein levels in the pancreatic tissue significantly increased in caerulein group. Compared with caerulein group, symptom relief, pathological index, serum lipase, amylase, TNF-α, IL-6 concentration, pancreatic p-NF-κBp65, p-IκB-α, p-ERKl/2, p-p38 and p-JNK protein levels significantly decreased, while serum IL-10 concentration significantly increased in puerarin + caerulein group.Puerarin can treat caerulein-induced acute pancreatitis by inhibiting NF-κB/MAPK signaling pathway in mice.

Acute pancreatitis; Puerarin; MAPK; Nuclear factor Κb

R332

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.021

江西省中醫(yī)藥管理局科技計劃項目（SZYYB20215656）

王桂良，電子信箱：guiliangwang@126.com

（2022–12–06）

（2023–09–02）