基于泡沫鎳載納米材料的電化學傳感器檢測肉制品中亞硝酸鹽

張 也， 馬 亮， 李亞蕾， 王松磊

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

亞硝酸鹽是指含有亞硝酸根陰離子（NO2-）的一類鹽，被用作食品添加劑廣泛應用于腌制肉類罐頭及肉制品中，具有護色、增進風味和防腐等作用[1-3]。人體攝入過量亞硝酸鹽，可使血紅蛋白轉化為高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力造成機體缺氧[2，4-5]。 此外，亞硝酸鹽還可與體內的胺類結合成具有致癌作用的亞硝胺，嚴重危害人體健康[1，4]。 因此，建立準確、快速檢測食品中亞硝酸鹽的方法具有重要的研究意義。

檢測食品中亞硝酸鹽的方法主要有分光光度法[6-8]、離子色譜法[9-11]、毛細管電泳法[12]、熒光光譜法[13-14]和電化學法[5，15-17]等。 對比傳統(tǒng)方法，電化學方法具有操作簡單、 響應迅速和靈敏度較高等優(yōu)點，在亞硝酸鹽檢測中具有廣闊的應用前景[18]。 電化學傳感器的原理是電極敏感材料與目標物的相互作用和識別，對電極進行納米材料的修飾，從而降低電極電勢，提高電極催化性能，實現(xiàn)對待測物的準確和靈敏測定[2-3，19]。

過渡金屬氧化物（如氧化銅[20-21]、氧化鈷[22]和氧化鎳[23]等）由于成本低、來源廣和催化性出色等優(yōu)點已經(jīng)受到廣泛關注。 各種鈷基催化劑被發(fā)現(xiàn)具有類似酶催化作用，其中鈷氧化物被研究最多，與生物酶相比具備許多優(yōu)勢，如不易失活、成本低廉、易保存、催化性能穩(wěn)定等[24]。 泡沫鎳因具有三維立體結構、大的表面積、低成本、優(yōu)良導電性等優(yōu)點而常被用作支撐材料[25-26]，通過水熱合成法可以在金屬泡沫鎳上生長出納米材料，從而用于構建電化學傳感器。

通過水熱合成法在泡沫鎳上生成鈷基氫氧化物前驅體，然后將其放置管式爐中于空氣中高溫煅燒，制備泡沫鎳基負載Co3O4納米復合材料，構建電化學傳感器，用于食品中亞硝酸鹽的檢測。 通過電化學工作站研究該傳感器的電催化機理和電化學性能，表明該修飾電極對亞硝酸鹽的檢測具有大的檢測范圍和高靈敏度。 并進行了實際樣品檢測，所得結果與國家標準中方法檢測結果基本一致，表明該傳感器可用于快速檢測食品中的亞硝酸鹽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硝酸鈷（Co（NO3）2·6H2O）、氟化銨（NH4F）、脲（尿素，CH4N2O）、無水乙醇、丙酮、 鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、亞硝酸鈉、濃鹽酸等（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品；泡沫鎳：天津艾維信化工科技有限公司產品；實驗中清洗、配制溶液等均使用超純水。

1.2 儀器與設備

CHI660E 電化學工作站、飽和甘汞電極、鉑絲電極：上海辰華儀器有限公司產品；電熱真空干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司產品；管式爐：合肥科晶技術有限公司產品；電子分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司產品；超聲波清洗器：深圳潔盟清洗設備有限公司產品；磁力攪拌器：上海弗魯克儀器有限公司產品；微量移液器：賽默飛世爾科技（中國）有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 電化學傳感器制備 泡沫鎳預處理[27]：用剪刀將泡沫鎳裁剪為1.0 cm×1.0 cm 的薄塊， 置于3 mol/L 鹽酸溶液中超聲浸泡30 min， 然后依次用丙酮、無水乙醇和去離子水分別超聲清洗8 min，以便除去泡沫鎳表面的油污和氧化層等雜質，最后將清洗后的泡沫鎳片放入電熱真空干燥箱中， 于60 ℃下真空干燥6 h 備用。

水熱合成法制備鈷基氫氧化物/泡沫鎳[24]：分別稱取2 mmol 的Co（NO3）2·6H2O、8 mmol 的NH4F、1 mmol 的CH4N2O 溶于40 mL 超純水中，用磁力攪拌器以5 000 r/min 攪拌10 min 至為均勻溶液。 然后將上述處理好的泡沫鎳和混合溶液轉移至100 mL的水熱反應釜中， 置于電熱真空干燥箱中于120 ℃條件下反應10 h，待反應結束后使反應釜自然冷卻至室溫，然后用鑷子取出泡沫鎳，用超純水沖洗表面2～3 次， 再置于電熱真空干燥箱中于60 ℃下真空干燥6 h。

鈷基氫氧化物/泡沫鎳轉變?yōu)镃o3O4/Ni foam[24]：將干燥后的鈷基氫氧化物/泡沫鎳置于瓷舟中，再將瓷舟放入管式爐的石英管升溫區(qū)中心， 以5 ℃/min的升溫速率升溫至350 ℃，并在空氣的氛圍下煅燒2 h，自然冷卻至室溫得到Co3O4/Ni foam。

Co3O4/Ni foam 的制備流程如圖1 所示。

圖1 Co3O4/Ni foam 電極的制備過程Fig. 1 Preparation process of Co3O4/Ni foam nanomaterials

1.3.2 電化學檢測

所有電化學測量均在CHI660E 電化學工作站上進行，將制備的Co3O4/Ni foam 納米復合材料用作工作電極，鉑絲電極用作對電極，飽和甘汞電極用作參比電極。 在室溫下進行檢測，以0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（PBS 緩沖液，pH 6.0）作為電解液，實驗前需通氮氣除去溶液中的氧氣。 采用循環(huán)伏安法分別設置不同的掃描速率（50、100、150、200、250、300 mV/s）， 掃描電壓0～1.2 V， 研究NO2-在Co3O4/Ni foam 表面的電化學行為。 采用計時安培滴定法研究電化學傳感器的亞硝酸根（NO2-） 檢測范圍及檢測限，外加電壓為0.83 V。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Origin、Digital Micrograph、Jade 等軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析以及圖形處理。

2 結果與分析

2.1 修飾電極材料的形貌表征

通過掃描電子顯微鏡（SEM）和高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）對Co3O4/Ni foam 納米復合材料的形貌進行了表征。 如圖2（a）所示，未生長金屬氧化物的泡沫鎳骨架表面平滑，可為納米材料生長提供大的表面。由圖2（c）中可以看到在金屬泡沫鎳架構上均勻地嵌插生長著許多梭狀顆粒；進一步放大觀察倍數(shù)后（如圖2（e）所示)，可以看到Co3O4納米顆粒均勻地嵌插在泡沫鎳架構上， 由3～5 μm 的針狀團簇組成。 這種特殊的結構能夠使材料充分接觸電解液，從而提高電子傳輸性能，利于電解液的滲透，使得催化劑能夠與電解質有更多更大的接觸面積，能夠為催化反應提供更多的反應活性位點，有利于提高電催化性能。 結合HRTEM 圖可以清晰地觀察到晶格條紋，用Digital Micrograph 軟件測量晶格間距為0.224 nm，對應立方晶相Co3O4的（311）晶面間距，與現(xiàn)有的研究結果一致[24]，表明成功地合成了Co3O4/Ni foam 納米復合材料。

2.2 Co3O4/Ni foam 電極對亞硝酸鹽的電化學行為

電化學阻抗譜 （electrochemical impedance spectroscopy，EIS）法可以表征電極材料的電子傳遞電阻，阻抗圖的直線部分表示電子轉移過程受擴散控制，半圓部分表示受動力學控制，圓弧半徑越大表明材料對電子阻礙作用越大[28]。 Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極在含0.1 mol/L KCl 的5 mmol/L Fe（CN）6）3-/4-溶液中的電化學阻抗譜圖如圖3 所示，設置電化學工作站參數(shù)，頻率在0.01～100.00 Hz，頻率數(shù)為50，振幅為0.2 V。從圖3 中可以看出，與Ni foam 電極相比，Co3O4/Ni foam 電極的半圓部分明顯減小， 表明Co3O4/Ni foam 納米復合材料導電性較好，利于電子傳遞，因此合成的Co3O4/Ni foam 具有良好的導電性，表明該納米復合材料適用于制備傳感器。

圖3 Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極的電化學阻抗譜圖Fig. 3 Electrochemical impedance spectra of Ni foam electrodes and Co3O4/Ni foam electrodes

以0.1 mol/L、pH 6.0 的磷酸鹽緩沖液 （PBS 緩沖液）為電解液，加入2 mmol/L NaNO2溶液，測得Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極的循環(huán)伏安曲線如圖4 所示。 在0～1.2 V 時，Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極在空白緩沖液中都沒有氧化峰。 當NO2-存在時，Ni foam 電極沒有明顯響應，Co3O4/Ni foam 電極在0.83 V 處有一個明顯的氧化峰，峰電流為480 μA，且反向掃描無還原峰出現(xiàn)，表明NO2-在電解液中發(fā)生了不可逆的氧化還原反應，從而表明Co3O4/Ni foam 對亞硝酸鹽的氧化具有良好的催化能力，能夠增強電極的信號強度，有助于提高檢測的靈敏度， 對亞硝酸鹽的檢測有良好的電化學響應。NO2-失去電子被氧化成NO3-，引起電流增大，形成電信號，從而被電化學工作站檢測到，NO2-的電化學電解的機理[29-30]如下：

圖4 Ni foam 電極和Co3O4/Ni foam 電極在不同緩沖液中的循環(huán)伏安曲線Fig. 4 Cyclical voltammetry of Ni foam and Co3O4/Ni foam in different solutions

2.3 掃描速率對Co3O4/Ni foam 電化學性能的影響

采用循環(huán)伏安法（CV）研究掃描速率（50、100、150、200、250、300 mV/s）對Co3O4/Ni foam 電催化氧化NO2-的影響，結果如圖5 所示，隨著掃描速率的增加， 氧化峰的峰電流逐漸增加， 在50～300 mV/s時，峰電流與掃描速率的平方根（V1/2）呈良好的線性關系， 所對應的線性方程為y=3.990+0.102x （R2=0.998）， 說明NO2-在電極表面的電化學氧化反應是受擴散控制的電子轉移過程。

圖5 不同掃描速率對Co3O4/Ni foam 電催化氧化NO2-的影響Fig. 5 Effect of different scanning rates on the catelytic oxidation of NO2-by Co3O4/Ni foam

2.4 電解液pH 對Co3O4/Ni foam 電化學性能的影響

亞硝酸鹽的電化學氧化反應過程中有氫離子（H+）參與，溶液的pH 是氫離子物質的量濃度的負對數(shù)， 因此溶液的pH 對亞硝酸鹽的測定有重要影響。 緩沖液pH 對電極檢測NO2-的氧化峰電流的影響如圖6 所示， 在pH 從5.0 增加到6.0 過程中，氧化峰電流逐漸增大，這可能是由于亞硝酸鈉在酸性條件下易于分解成NO 和NO3-[5]。 當pH 為6.0～8.0時，氧化峰電流逐漸減小，這可能是由于伴隨pH 逐漸增大，氫質子不斷減少，導致電催化氧化NO2-變得相對困難，電信號減小。 因此，本實驗選用pH 6.0作為后續(xù)研究的最優(yōu)pH。

圖6 緩沖液pH 對亞硝酸鹽循環(huán)伏安響應的影響Fig. 6 Effect of buffer pH on cyclic voltammetry response of nitrite

2.5 Co3O4/Ni foam 的工作曲線和檢測限

采用計時安培滴定法對不同濃度NaNO2進行測定，結果如圖7 所示。在磁力攪拌器均勻攪拌下，恒電壓為0.83 V，100 s 為間隔連續(xù)向0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0） 中滴加10 μL 不同濃度的NaNO2溶液， 得到電流-時間曲線和峰電流與NO2-濃度的線性關系圖。 從圖7（a）中可以明顯看出，當向PBS 緩沖液中滴加了一定量的NaNO2時，響應電流迅速上升并在3 s 左右達到穩(wěn)定電流值， 表明該傳感器對NO2-響應靈敏。隨著NaNO2濃度的不斷增加，響應電流逐漸增大，在NO2-濃度5～2 100 μmol/L時，呈良好的線性關系，線性擬合方程分別為y=6.29+0.001 42x（R2=0.998），y=4.59+0.007 21x（R2=0.999），Co3O4/Ni foam 對NO2-的檢測限為3.14 μmol/L，低于已報道與泡沫鎳相關的修飾電極的NO2-電化學傳感器[31-32]，說明制備用于檢測NaNO2的Co3O4/Ni foam 傳感器具有靈敏度高、檢測限低、線性范圍寬的優(yōu)點。

圖7 Co3O4/Ni foam 在0.1 mol/L PBS（ pH 6.0） 緩沖液中對不同濃度的亞硝酸鹽的計時電流響應Fig. 7 Chronoamperometry response of Co3O4/Ni foam to nitrite of different concentrations in 0.1 mol /L PBS solution(pH 6.0)

2.6 電極的選擇性和穩(wěn)定性研究

為了研究Co3O4/Ni foam 電極對NO2-的選擇性和抗干擾性，選擇食品中常見存在的離子（包括K+、Na+、NO3-、S2-、Cl-、CO32-、苯甲酸根、山梨酸根）作為干擾物質代表，干擾離子濃度為0.2 mol/L（NO2-濃度的100 倍）。 在磁力攪拌器均勻攪拌的條件下，分別取上述離子加入到2 mmol/L NaNO2溶液中，通過計時安培滴定法獲得電流-時間曲線， 從圖8 中可以明顯看出NO2-的氧化峰電流沒有明顯變化，是因為制備的Co3O4/Ni foam 電極對NO2-具有特異性，當干擾離子存在時只對NO2-有催化氧化的作用，表明該傳感器有良好的選擇性，可用于實際樣品的檢測。

圖8 Co3O4/Ni foam 在不同離子存在下對2 mmol/L NO2-檢測的計時電流響應Fig. 8 Chronoamperometry response of Co3O4/Ni foam to 2 mmol/L NO2- detection in the presence of different ions

為了考察Co3O4/Ni foam 電極的穩(wěn)定性，在含有2 mmol/L NaNO2的0.1 mol/L PBS 緩沖液中連續(xù)循環(huán)掃描30 圈，氧化峰電流基本不變，說明該傳感器穩(wěn)定性好。 將制備的Co3O4/Ni foam 電極放置于自封袋中，在室溫、干燥的條件下保存，并使用該Co3O4/Ni foam 電極作為工作電極，對NO2-進行檢測，連續(xù)記錄每天獲得的循環(huán)伏安曲線，20 d 后電流信號為最初響應電流信號的96.5%（見圖9），表明Co3O4/Ni foam 電極長期儲藏后也是穩(wěn)定的。 以上結果表明Co3O4/Ni foam 電極具有良好的穩(wěn)定性。

圖9 連續(xù)記錄存放20 d 的Co3O4/Ni foam 在含有2 mmol/L NO2-的緩沖液中的循環(huán)伏安曲線Fig. 9 Continuous record of the cyclic voltammetry curves of Co3O4/Ni foam stored for 20 days in buffer solution containing 2 mmol/L NO2-

2.7 對實際樣品的檢測

購買醬牛肉作為待測樣品， 進行加標回收檢測。各取2 g 上述樣品搗碎置于50 mL 離心管中，加入25 mL 緩沖液， 渦旋振蕩混勻2 min， 再超聲10 min， 保證固相分散均勻， 加入硫酸鋅使蛋白質沉淀，然后置于75 ℃水浴20 min，取出冷卻至室溫過濾，保留濾液待用，然后加入亞硝酸鹽標準品進行3次平行檢測（n=3）。 Co3O4/Ni foam 傳感器檢測濾液中亞硝酸鹽質量分數(shù)為18.8 mg/kg， 低于國家標準GB 2760—2014 規(guī)定的最大殘留量30 mg/kg， 如表1 所示， 根據(jù)研究結果計算可得相對標準偏差（RSD） 為3.82%～4.74%， 加標回收率為97.9%～101.2%。 研究結果表明，基于Co3O4/Ni foam 構建亞硝酸鹽電化學傳感器成功應用于實際食品中亞硝酸鹽的檢測。采用國家標準GB 5009.33—2016 規(guī)定的分光光度法（鹽酸萘乙二胺法）測得樣品中的亞硝酸鹽含量[33]，兩種方法的檢測結果基本一致，驗證了實驗結果的準確性，說明基于Co3O4/Ni foam 構建的電化學傳感器用于檢測肉制品亞硝酸鹽具有準確性好和穩(wěn)定性高的優(yōu)點。

表1 Co3O4/Ni foam 電極對醬牛肉中亞硝酸鹽的檢測Table 1 Detection of nitrite in soy sauce beef with Co3O4/Ni foam electrode

3 結 語

通過水熱合成法和高溫煅燒法成功地制備了泡沫鎳基負載Co3O4納米復合材料， 構建高靈敏度亞硝酸鹽電化學傳感器。利用SEM 和HRTEM 對材料的結構和形貌進行表征， 發(fā)現(xiàn)Co3O4納米顆粒呈針狀均勻覆蓋在泡沫鎳上，能夠加快反應時的電子傳輸速率，增強電化學信號。 通過循環(huán)伏安法、計時安培滴定法等電化學方法研究了Co3O4/Ni foam 傳感器對NO2-檢測性能。 Co3O4與泡沫鎳有協(xié)同作用，能提高對NO2-電催化活性，同時提高電信號傳輸速率，傳感器的線性響應范圍為5～2 100 μmol/L，最低檢測限為3.14 μmol/L，該修飾電極制備的亞硝酸鹽電化學傳感器具有靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性高和可以長期存放等優(yōu)點，可用于肉制品中亞硝酸鹽快速檢測。 本研究中基于三維多孔材料與過渡金屬氧化物結合制備的Co3O4/Ni foam 傳感器，為食品中亞硝酸鹽的快速檢測提供了新思路。