基于多組學(xué)分析高鹽飲食誘導(dǎo)的大鼠高血壓靶器官損傷機(jī)制

丁瑞豐， 朱嗣博， 周新麗*

（1. 上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093；2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院，上海 200438）

高血壓是導(dǎo)致心血管疾病和腎臟疾病的主要因素，造成的死亡人數(shù)占全球所有死亡人數(shù)的5.8%[1]。心臟、腎臟是主要靶器官，在高血壓的長(zhǎng)期影響下將破壞這些器官的正常結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致功能衰竭[2-3]。 高鹽飲食已被確定為引起高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，長(zhǎng)期的高鹽飲食會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)鈉潴留、外周血管阻力增大和血容量升高[4]。 隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，居民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，食鹽的攝入量提高到了約10 g/d，遠(yuǎn)高于世界衛(wèi)生組織推薦的5 g/d的攝鹽量[5]。 研究表明，攝鹽量每增加2 g/d，可使血壓升高1～2 mmHg[6]。 除此之外，過(guò)量的膳食鹽攝入會(huì)導(dǎo)致腎臟肥大和腎臟小動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈血管周?chē)w維化，雙心室缺血和心室舒張功能異常等一系列器官功能障礙[7-9]。

腸黏膜是吸收過(guò)量鹽分的主要部位，過(guò)多的攝鹽量會(huì)破壞腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)并上調(diào)高血壓特征菌群等有害菌豐度[10-12]。 一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，減少膳食鹽的攝入會(huì)增加高血壓患者體內(nèi)與血壓下降有關(guān)的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）水平，而大部分SCFA 都來(lái)源于腸道微生物代謝，間接說(shuō)明了鹽的攝入對(duì)于腸道菌群組成及功能的影響[13]。 一些研究則發(fā)現(xiàn)在高鹽飲食及高血壓的作用下，腎臟損傷和心血管疾病的發(fā)展受到了來(lái)自腸道微生物群通過(guò)免疫、代謝和神經(jīng)調(diào)控等一系列途徑的影響[14-17]。

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為揭示疾病的分子機(jī)制提供了新的途徑。 然而，高鹽飲食引起的高血壓靶器官損傷的潛在機(jī)制和對(duì)腸道微生物群的影響仍少有探究。 因此，作者通過(guò)高鹽飲食的方式構(gòu)建了高血壓大鼠模型，基于基因組和微生物組全面探討了高鹽誘導(dǎo)的高血壓大鼠靶器官損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（12 只，4周齡，體質(zhì)量（170±5） g）：上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。 實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置均遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》規(guī)定（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審核編號(hào)：SZY-201601007）。

普通標(biāo)準(zhǔn)飼料（SFS9112）、定制高鹽飼料（普通標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上含質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%NaCl）：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D 雙人單面凈化垂直送風(fēng)工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Ultra Pure UF 除熱源型超純水機(jī)：上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品；Sorvall ST 8臺(tái)式離心機(jī)、NanoDropTM2000 分光光度計(jì)： 北京賽默飛科技有限公司產(chǎn)品；Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀：美國(guó)Agilent 公司產(chǎn)品；BP98A 無(wú)創(chuàng)血壓儀：日本Softron 產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)采用12 只健康4 周齡雄性SD 大鼠，在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分成兩組，每組6 只：NC 組（空白對(duì)照組，喂養(yǎng)普通標(biāo)準(zhǔn)飼料）、HSD組（高鹽飲食組，喂養(yǎng)含質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%NaCl 定制高鹽飼料）。 所有大鼠允許自由飲水，并放置于晝夜光照條件為12 h 光照/12 h 黑暗、環(huán)境溫度（22±2） ℃、相對(duì)濕度（30±2）%的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境下，每4 周于同一時(shí)間測(cè)量大鼠體質(zhì)量和動(dòng)脈血壓。 連續(xù)喂養(yǎng)12 周后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死，待大鼠完全麻醉后放血處死。 收集腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)組織、心臟的心房和心室組織、結(jié)腸組織和糞便樣本，并立即放于液氮中速凍，隨后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱用于后續(xù)高通量測(cè)序， 實(shí)驗(yàn)總體設(shè)計(jì)和分析流程如圖1 所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)總體設(shè)計(jì)和分析流程Fig. 1 Experimental overall design and analytical procedures

1.3.2 大鼠血壓測(cè)量 使用無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)量大鼠尾部的收縮壓和舒張壓，并根據(jù)如下公式計(jì)算平均動(dòng)脈壓作為大鼠血壓測(cè)量結(jié)果。 測(cè)量前讓大鼠自由飲水并在籠中休息15 min 以保持冷靜。隨后將大鼠的尾巴放在溫度合適的尾套中，將其充氣和釋放多次，讓動(dòng)物適應(yīng)這個(gè)過(guò)程。 通過(guò)3～5 次連續(xù)成功的血壓讀數(shù)獲得平均動(dòng)脈壓。

式中：pMAP為平均動(dòng)脈壓 （mean arterial pressure），mmHg；pDBP為舒張壓 （diastolic blood pressure），mmHg；pSBP為收縮壓 （systolic blood pressure），mmHg。

1.3.3 組織RNA 提取和高通量測(cè)序 根據(jù)TRIzol試劑盒操作說(shuō)明分別提取各器官組織的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA 的完整性，NanoDropTM2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA 純度和濃度， 并用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀測(cè)定RNA 完整值（RNA integrity number，RIN）。 RNA 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為：OD260nm/280nm為1.8～2.2、 ρRNA≥200 ng/μL、RIN 值≥8。通過(guò)質(zhì)控的RNA 樣本使用SmartScribeTMReverse Transcriptase 試劑盒進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增和文庫(kù)制備，隨后用TruePrep?DNA Library Prep Kit V2 for Illumina 試劑盒對(duì)DNA 進(jìn)行片段化、加接頭和擴(kuò)增反應(yīng)，使用VANTS DNA Clean Beads 對(duì)各階段產(chǎn)物進(jìn)行分選， 使用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀對(duì)獲得的文庫(kù)樣品進(jìn)行定量分析， 最終獲得250～1 000 bp 文庫(kù)片段。 根據(jù)定量分析結(jié)果，構(gòu)建好的文庫(kù)樣品按照體積比1∶1 比例混合， 送交北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司通過(guò)Illumina NextSeq 500 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。 測(cè)序下機(jī)原始數(shù)據(jù)使用Fastqc（v0.11.9）和Multiqc（v1.11）軟件進(jìn)行質(zhì)控統(tǒng)計(jì)， 采用Trimmomatic （v0.39） 軟件過(guò)濾低質(zhì)量reads， 序列過(guò)濾后得到的高質(zhì)量reads， 利用HiSat（v2.1.0）軟件比對(duì)到Ensemble 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)布的大鼠參考基因組和基因序列Rnor6（release 102）上，比對(duì)結(jié)果利用featureCounts（v1.6.5）進(jìn)行基因水平定量，得到各樣本的基因表達(dá)矩陣。 通過(guò)每個(gè)組織的NC 組和HSD 組之間的基因表達(dá)譜差異倍數(shù)（fold change）來(lái)鑒定差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因使用R 包DESeq2 進(jìn)行篩選，差異倍數(shù)大于1.3 或小于0.77，P＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，隨后通過(guò)比對(duì)AnimalTFDB（v3_20210214）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步識(shí)別出差異表達(dá)基因中的轉(zhuǎn)錄因子，并進(jìn)行深入挖掘分析。 最后，通過(guò)R包c(diǎn)lusterProfiler 分析差異表達(dá)基因列表， 根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)探索其生物學(xué)功能。

1.3.4 糞便16S rRNA 基因測(cè)序與分析 使用糞便DNA 基因組提取試劑盒從冷凍糞便樣本中提取細(xì)菌基因組，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢查合格后，采用16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)引物（338F：F5′-TCGTCG GCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGG GNGGCWGCAG-3′;806R：R5′-GTCTCGTGGGCTCG GAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTAT CTAATCC-3′） 進(jìn)行DNA 提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 擴(kuò)增， 擴(kuò)增采用KAPA HiFi HotStart Ready Mix 試劑盒。擴(kuò)增產(chǎn)物隨后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 合格的樣品使用TruePrep?DNA Library Prep Kit V2 for Illumina 試劑盒構(gòu)建基因文庫(kù)，VANTS DNA Clean Beads 回收各階段目標(biāo)片段擴(kuò)增產(chǎn)物。 使用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀對(duì)獲得的文庫(kù)樣品進(jìn)行定量，最終獲得630 bp 附近的文庫(kù)片段。 根據(jù)定量結(jié)果，構(gòu)建好的文庫(kù)樣品按照體積比1∶1 比例混合，送交晶能生物技術(shù) （上海） 有限公司通過(guò)Illumina Novaseq 6000 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。 下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)采用QIIME（v1.9.1）軟件進(jìn)一步處理，以97%的相似性分類閾值來(lái)進(jìn)行不同操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）的聚類和物種注釋，比對(duì)參照數(shù)據(jù)庫(kù)為Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)（2013 release）。使用R 包vegan 進(jìn)行腸道菌群數(shù)據(jù)的多樣性分析和主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）。 采用線上工具Galaxy（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）的線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）工具分析組間菌群差異。腸道菌群的KEGG 功能預(yù)測(cè)使用 PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states） 軟件進(jìn)行分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 使用GraphPad Prism（v8.4.2）和R 統(tǒng)計(jì)軟件（v3.6.2）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異顯著性檢驗(yàn)采用Mann-Whitney-Wilcoxon 檢驗(yàn)，采用Spearman 進(jìn)行相關(guān)性分析，差異比較結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），P＜0.05 作為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高鹽飲食對(duì)大鼠血壓和體質(zhì)量的影響

本研究的目的是根據(jù)長(zhǎng)期高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠組織和腸道微生物的差異來(lái)表征高血壓的潛在分子機(jī)制。 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠均未出現(xiàn)死亡；NC 組的大鼠活動(dòng)情況正常， 精神狀態(tài)良好；HSD 組大鼠活動(dòng)減少，精神狀態(tài)萎靡。 各組大鼠的體質(zhì)量和血壓變化情況如圖2 所示，與正常飲食（空白對(duì)照組）的大鼠相比，高鹽喂養(yǎng)的大鼠體質(zhì)量顯著降低，由（468.00±13.53）g 降至（411.67±31.82）g。在高鹽飲食的作用下，HSD 組的血壓顯著高于NC 組，在高鹽飲食喂養(yǎng)8 周后已經(jīng)觀察到了差異，并且在整個(gè)研究過(guò)程中都保持了顯著差異， 由NC 組（112.67±5.13） mmHg 升至HSD 組 （143.00±4.58）mmHg。 高鹽飲食造成了大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)減緩和血壓顯著升高，與Bier 等的研究結(jié)果[18]一致。

圖2 大鼠的體質(zhì)量、血壓變化情況Fig. 2 Changes in body weight and blood pressure of rats

2.2 高血壓靶器官的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

為了明確長(zhǎng)期高鹽飲食所導(dǎo)致的高血壓靶器官損傷機(jī)制，對(duì)上述兩組大鼠腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)組織、 心房和心室組織和結(jié)腸組織共30 個(gè)組織樣本進(jìn)行了高通量測(cè)序，共測(cè)定了20 207 個(gè)基因的表達(dá)量。 無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)中的主成分分析（PCA） 和層次聚類分析（HCA）是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析前質(zhì)量控制的常用方法之一，通過(guò)二維坐標(biāo)或聚類樹(shù)查看樣本之間的聚類情況， 以判定樣本的組間差異和組內(nèi)差異。 PCA 的結(jié)果如圖3（a）所示，第一主成分的貢獻(xiàn)度為36.12%，第二主成分的貢獻(xiàn)度為12.77%，相同器官組織樣本聚集在一起。 從HCA 的結(jié)果可以看出（見(jiàn)圖3（b）），每個(gè)器官組織中的樣本大致分成2個(gè)大類，大多數(shù)高鹽飲食組單獨(dú)形成一類，空白對(duì)照組形成另一大類?？傮w來(lái)說(shuō)，PCA 和HCA 結(jié)果相互印證，均證實(shí)樣本的組間差異大于組內(nèi)差異。 本研究比較了每個(gè)組織的基因表達(dá)譜差異以表征由高鹽高血壓引起的分子變化。 根據(jù)基因表達(dá)譜差異倍數(shù)和顯著性對(duì)基因進(jìn)行篩選比較，各個(gè)器官組織的差異表達(dá)基因數(shù)如表1 所示。

表1 各組織差異表達(dá)基因的數(shù)量Table 1 Numbers of differentially expressed genes in each tissue

圖3 器官組織基因表達(dá)譜差異分析圖Fig. 3 Gene expression profile analysis of organs and tissues

為了更好地闡明高鹽飲食對(duì)高血壓靶器官損傷的潛在機(jī)制，進(jìn)一步篩選了差異表達(dá)基因中的轉(zhuǎn)錄因子，如圖4 所示。 結(jié)果表明，HSD 組中結(jié)腸中的基因Irf1 和心室中的基因Irf7 的表達(dá)量高于NC組，而心房中的基因Zfp91、心室中的基因Epas1 表達(dá)量低于NC 組。 除此之外，HSD 組中Id 基因家族在多個(gè)器官組織中的表達(dá)量均低于NC 組， 如腎髓質(zhì)中的基因Id1、Id2、Id3，腎皮質(zhì)的基因Id2、Id3、Id4。

圖4 各組織的差異轉(zhuǎn)錄因子Fig. 4 Differential transcription factors in each tissue

為了解高鹽飲食可能影響的細(xì)胞功能與代謝過(guò)程，本研究中對(duì)各個(gè)器官組織的組間差異表達(dá)基因分別采用了GO 和KEGG 進(jìn)行富集分析，結(jié)果如圖5 和圖6 所示。 GO 分類結(jié)果表明，高鹽飲食所導(dǎo)致的差異表達(dá)基因在心房主要參與前體代謝產(chǎn)物和能量產(chǎn)生，在心室和腎皮質(zhì)則主要與ATP 代謝過(guò)程有關(guān)，結(jié)腸和腎皮質(zhì)組織的差異表達(dá)基因分別與細(xì)胞修飾的氨基酸代謝過(guò)程和線粒體呼吸鏈復(fù)合體組裝過(guò)程有關(guān)。 KEGG 富集結(jié)果表明各器官組織的差異表達(dá)基因與多種代謝過(guò)程密切相關(guān)，在心房和腎皮質(zhì)主要與三羧酸循環(huán)有關(guān)，腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的差異表達(dá)基因主要與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝有關(guān)， 心房和結(jié)腸的差異表達(dá)基因與膽固醇代謝有關(guān)。

圖5 各組織的差異表達(dá)基因GO 分類Fig. 5 GO classification of differentially expressed genes in each tissue

圖6 各組織的差異表達(dá)基因KEGG 富集Fig. 6 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in each tissue

2.3 高鹽飲食對(duì)大鼠腸道菌群組成及多樣性的影響

為了明確高鹽飲食對(duì)腸道微生物群組成的影響， 本研究中通過(guò)16S rRNA 基因測(cè)序分析了各組大鼠腸道微生物群結(jié)構(gòu)組成情況。 如圖7（a）所示，兩組大鼠腸道菌群在門(mén)水平上主要由擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）和藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）構(gòu)成。Yang 等的研究結(jié)果表明，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度的比值（F/B 值）升高是高血壓腸道菌群失調(diào)的標(biāo)志[19]。 如圖7（b）所示，在本研究中高鹽飲食組大鼠相比于空白對(duì)照組大鼠的厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)豐度的比值顯著升高，反映了在高鹽飲食及高血壓的影響下大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的改變。

圖7 門(mén)水平上大鼠微生物菌群的物種組成分析Fig. 7 Rat microbial species composition analysis on the phylum level

α-多樣性能夠反映出樣品中微生物群落的豐富度和均勻程度。 Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)可定量評(píng)估樣本中菌群豐富度和均勻程度，Shannon指數(shù)越大或者Simpson 指數(shù)越小則代表樣本菌群多樣性越高。 ACE 指數(shù)與Chao1 指數(shù)類似，通過(guò)統(tǒng)計(jì)樣本中OTUs 數(shù)量來(lái)對(duì)樣本多樣性進(jìn)行評(píng)估，其值越大，代表樣本菌群多樣性越豐富。 樣本的α-多樣性指數(shù) （ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)）具體數(shù)值如表2 所示，高鹽飲食會(huì)使大鼠的腸道菌群豐富度和均勻程度略微降低，但是Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、ACE 指數(shù)與NC 組差異不顯著，Chao1 指數(shù)顯著下降（P＜0.05），本研究結(jié)果表明了高鹽飲食對(duì)大鼠的腸道菌群豐富度和均勻程度有影響。

表2 大鼠腸道菌群α-多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity index of rat intestinal microflora

進(jìn)一步比較高鹽飲食對(duì)大鼠腸道菌群組成的影響，本研究中采用PCoA 比較了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在門(mén)、屬水平上微生物組成的菌群多樣性差異。 如圖8 所示， 在門(mén)水平上PC1 坐標(biāo)軸貢獻(xiàn)率占總成分的94.67%，在屬水平上為89.98%，符合PCoA 要求。分析結(jié)果表明了本研究中兩實(shí)驗(yàn)組各自的樣本都能顯著分為一個(gè)群體，并且微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度都有自己明顯的特征。

圖8 大鼠腸道菌群的PCoA 分析結(jié)果Fig. 8 PCoA analysis of rat intestinal microflora

2.4 高鹽飲食對(duì)特定菌群和功能的影響

為了明確高鹽飲食造成的關(guān)鍵差異菌群，為相關(guān)疾病的分類、檢測(cè)和機(jī)理研究等臨床應(yīng)用提供參考。 本研究中采用了LEfSe 方法分析了不同樣本組別間的菌群差異，通過(guò)計(jì)算LDA 分?jǐn)?shù)來(lái)區(qū)分兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中對(duì)菌群結(jié)構(gòu)差異貢獻(xiàn)較大的標(biāo)志性微生物。如圖9 所示， 兩組樣本的腸道菌群存在一定的差異，NC 組中對(duì)菌群結(jié)構(gòu)差異影響較大的微生物主要來(lái)自擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、梭菌綱（Clostridia）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae），而高鹽飲食組中對(duì)菌群結(jié)構(gòu)差異影響較大的微生物主要來(lái)自厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目 （Burkholderiales）、 放線菌目（Actinomycetales）和費(fèi)克藍(lán)姆菌屬（Facklamia）等。本研究結(jié)果說(shuō)明了高鹽飲食能夠改變大鼠腸道中特定菌群的相對(duì)豐度，對(duì)大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)組成有顯著影響。 PICRUSt 可以用于樣本腸道微生物群的基因功能預(yù)測(cè)。 如圖10 所示，結(jié)果顯示高鹽飲食影響了多個(gè)微生物組代謝途徑，下調(diào)較大的途徑為初級(jí)膽汁酸生物合成，次級(jí)膽汁酸生物合成，果糖和甘露糖代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；上調(diào)途徑主要為脂肪酸代謝和賴氨酸降解。 總之，上述結(jié)果表明高鹽飲食改變了大鼠腸道微生物群的組成和功能。

圖9 基于LEfSe 分析大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)差異Fig. 9 Analysis of differences in the composition and structure of rat intestinal microflora based on LEfSe

圖10 基于PICRUSt 的大鼠腸道菌群基因功能預(yù)測(cè)Fig. 10 Genomic functional prediction of rat intestinal microflora based on PICRUSt

2.5 高鹽飲食影響下大鼠基因表達(dá)和腸道菌群的串?dāng)_

腸道屏障作為一個(gè)通道，通過(guò)跨細(xì)胞和細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，使大量代謝產(chǎn)物和免疫信號(hào)在腸道和循環(huán)系統(tǒng)之間雙向傳遞[20]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食會(huì)損害腸道屏障功能，最終導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)從而引發(fā)免疫反應(yīng)和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[14]。為了揭示在高鹽飲食的作用下腸道菌群影響靶器官組織基因表達(dá)的潛在機(jī)制，采用了Spearman 相關(guān)性分析探索了靶器官組織的差異轉(zhuǎn)錄因子與腸道菌群OTUs 之間的共表達(dá)關(guān)系。 如圖11 所示，5 個(gè)器官組織共有23 個(gè)差異轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與9 個(gè)微生物群菌屬具有顯著相關(guān)性。 薩特氏菌屬（Sutterella） 主要與結(jié)腸中 Nr0b2、Atf3、Hopx、Hmgb2、Irf1 和Crebrf 的表達(dá)高度相關(guān)（見(jiàn)圖11，粉色節(jié)點(diǎn)），乳酸桿菌屬（Lactobacillus）則與多個(gè)組織中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)相關(guān)， 如心房的Ciz1 基因 （圖11，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)）、結(jié)腸的Irf1 和Atf3 基因（見(jiàn)圖11，粉色節(jié)點(diǎn)）、腎髓質(zhì)的Id2 和Zfp91 基因（見(jiàn)圖11，黃色節(jié)點(diǎn)）。

圖11 差異轉(zhuǎn)錄因子與腸道菌群的共表達(dá)分析Fig. 11 Co-abundance analysis between differential transcription factors and the gut microbiome

2.6 討論

作者成功構(gòu)建了高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型，與空白對(duì)照組相比，高鹽飲食組大鼠的血壓在第8 周開(kāi)始至第12 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均顯著升高。為了揭示在高鹽飲食影響下產(chǎn)生高血壓的潛在分子機(jī)制，本研究中基于高通量測(cè)序技術(shù)探索了高鹽飲食對(duì)大鼠模型高血壓靶器官以及腸道微生物群的影響。 本研究中所發(fā)現(xiàn)的一系列差異轉(zhuǎn)錄因子有助于解釋高血壓疾病發(fā)展過(guò)程中分子機(jī)制，高鹽飲食造成的大鼠腸道菌群組成的改變與微生物組代謝功能失調(diào)密切相關(guān)，并基于多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析為高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓及其靶器官心-腎-腸軸損傷的分子機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)。

轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境刺激和微生物群信號(hào)等胞外信號(hào)調(diào)節(jié)變化的關(guān)鍵響應(yīng)節(jié)點(diǎn)[21]，明確高鹽飲食所導(dǎo)致的靶器官差異轉(zhuǎn)錄因子有助于更好地理解疾病發(fā)展的分子機(jī)制。 通過(guò)對(duì)高血壓靶器官進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一系列失調(diào)的差異轉(zhuǎn)錄因子。 有研究表明，高鹽飲食會(huì)導(dǎo)致腸道和血管炎癥，并驅(qū)動(dòng)T 細(xì)胞產(chǎn)生γ 干擾素（IFN-γ）和白細(xì)胞介素17A（IL-17A）[22-23]。Irf1 是IFN-γ 介導(dǎo)Th1 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因[24]。 既往研究表明，Irf1 能夠特異性抑制Foxp3 的表達(dá)，負(fù)向調(diào)節(jié)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的發(fā)育和功能，從而破壞宿主免疫穩(wěn)態(tài)[25]。 本研究中發(fā)現(xiàn)了Irf1在高鹽飲食組的結(jié)腸組織中上調(diào)，提示了高鹽飲食造成的腸黏膜損傷和腸道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵基因。 Id基因家族能夠拮抗堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）[26-27]。 有研究表明，高鹽飲食會(huì)激活大鼠腎小管細(xì)胞EMT 過(guò)程， 并導(dǎo)致鈣黏蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的異常表達(dá)[28]。本研究中，高鹽飲食組中腎臟Id 基因家族的基因表達(dá)均降低，高鹽飲食造成的EMT 異常激活可能與Id 基因家族的抑制作用減弱有關(guān)。 Wu 等的研究發(fā)現(xiàn)Zfp91 基因調(diào)控多個(gè)與心臟舒張功能相關(guān)基因的表達(dá)[29]。 Tanaka 等的研究發(fā)現(xiàn)Epas1 能夠響應(yīng)環(huán)境刺激進(jìn)而誘導(dǎo)腎上腺髓質(zhì)素的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[30]。在本研究中，Zfp91 和Epas1 在高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠心臟中表達(dá)顯著下調(diào)，提示高鹽飲食造成的心臟損害和血壓升高可能與一系列心肌穩(wěn)態(tài)以及炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因功能失調(diào)有關(guān)。 高血壓常伴有代謝異常，一些研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體的能量代謝和鹽的攝入量顯著相關(guān)[6，18，31-32]。 本研究中的GO 分類結(jié)果表明，高鹽飲食組中多個(gè)組織的線粒體功能發(fā)生了改變。KEGG 富集表明高鹽飲食造成的功能差異還集中在三羧酸循環(huán)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，膽固醇代謝等代謝相關(guān)途徑。 Binger 等研究發(fā)現(xiàn)高鹽飲食會(huì)抑制巨噬細(xì)胞的活化，并通過(guò)AKT/mTOR 信號(hào)通路破壞線粒體功能[33]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)途徑受損與高鹽攝入導(dǎo)致的ATP 生成減少以及氧消耗降低有關(guān)[34-35]。 而脂質(zhì)代謝紊亂將直接導(dǎo)致過(guò)量飲食但體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢[36]，多種代謝途徑紊亂可能是本研究中高鹽飲食組大鼠體質(zhì)量低于空白對(duì)照組的關(guān)鍵原因。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)期高鹽飲食改變宿主腸道微生物群的組成[18，37-38]。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，失調(diào)的腸道微生物群會(huì)產(chǎn)生血管活性激素并促進(jìn)高血壓的發(fā)生[39-40]。 本研究中發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期高鹽飲食的影響下大鼠的腸道Actinomycetales 水平升高，這與之前一項(xiàng)針對(duì)高鹽飲食喂養(yǎng)的小鼠腸道微生物群組成分析結(jié)果一致，這項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)了腸道放線菌門(mén)與保護(hù)性SCFA 丁酸呈負(fù)相關(guān)， 腸道處于慢性炎癥狀態(tài)[18]。 而本研究中發(fā)現(xiàn)了高鹽飲食組中丁酸的主要產(chǎn)生菌Ruminococcaceae 的相對(duì)豐度減少， 進(jìn)一步驗(yàn)證了高鹽飲食造成了保護(hù)性SCFA 丁酸含量的降低。 SCFA 在人類正常生理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，例如丁酸能夠通過(guò)抑制IFN-γ/STAT1 信號(hào)通路、促進(jìn)Foxp3 基因表達(dá)從而減弱組織炎癥反應(yīng)[41-43]。 此外，在一項(xiàng)針對(duì)高血壓患者的腸道微生物群臨床分析研究中發(fā)現(xiàn)，Betaproteobacteria 和Burkholderiales菌群豐度的降低與運(yùn)動(dòng)能力減弱顯著相關(guān)[44]，這與本研究中高鹽飲食組大鼠的腸道菌群改變情況以及活動(dòng)與精神狀態(tài)表現(xiàn)一致，提示了一種新的高鹽飲食所造成的高血壓損傷表型，并可能與腸道菌群的改變密切相關(guān)。 除此之外，本研究中發(fā)現(xiàn)高鹽飲食影響了多個(gè)微生物組代謝途徑， 這與Miranda 等的研究結(jié)果[38]一致。 正常情況下，大約有5%的膽汁酸將在腸肝循環(huán)中作為腸道微生物群的轉(zhuǎn)化底物參與體內(nèi)循環(huán)，這些膽汁酸的正常代謝對(duì)維持結(jié)腸轉(zhuǎn)錄因子RORγ 和Treg 細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[45-47]。此外，在多項(xiàng)關(guān)于高血壓的研究中發(fā)現(xiàn)腸道微生物群的氨基酸代謝途徑異常[38，48-49]，這與本研究中高鹽飲食所導(dǎo)致的高血壓大鼠腸道菌群氨基酸代謝異常的結(jié)果一致。 作者探索了在高鹽飲食影響下腸道微生物群的變化，這些潛在生物途徑以及標(biāo)志物對(duì)高鹽飲食造成的腸道損傷以及微生物靶向治療具有重要參考價(jià)值。

一些研究發(fā)現(xiàn)了腸道微生物群與炎癥性腸病[50-51]、心血管疾病[52]和腎臟疾病[53-54]等多種疾病都存在一定的聯(lián)系。 高鹽飲食會(huì)破壞腸道屏障，導(dǎo)致腸道黏膜滲漏性增高，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素等細(xì)菌物質(zhì)進(jìn)入血液參與全身循環(huán)[55-57]。 本研究中發(fā)現(xiàn)，一些腸道微生物群與多個(gè)器官組織的基因表達(dá)具有顯著相關(guān)性。比如，Sutterella 與結(jié)腸中Nr0b2、Hopx 的表達(dá)高度相關(guān)，這些基因主要與代謝功能以及IFN-γ 的轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)[58-60]。 有多個(gè)研究證實(shí)，Sutterella 與血壓獨(dú)立相關(guān)，并影響腸道免疫調(diào)節(jié)功能[61-63]。 此外，本研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus 與多個(gè)組織中的差異轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)高度相關(guān)。 目前的證據(jù)表明，Lactobacillus與腸道黏膜免疫和屏障功能密切相關(guān)[38]。 目前宿主基因與腸道微生物群的相互作用機(jī)制尚不完全清楚，了解微生物與基因組之間的共表達(dá)關(guān)系有助于解釋高血壓復(fù)雜的病因和發(fā)病機(jī)制。 本研究為揭示高鹽飲食引起的宿主-菌群串?dāng)_提供了可靠的參考依據(jù)。

本研究的局限性在于沒(méi)有對(duì)大鼠代謝組學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，基因組、微生物組以及代謝組的聯(lián)合分析能夠提供更加完備的參考依據(jù)。 此外，本研究中微生物組檢測(cè)樣本來(lái)源于大鼠糞便，進(jìn)一步采用結(jié)腸內(nèi)容物進(jìn)行分析能夠更有效地避免相關(guān)干擾因素。 總之，基于多組學(xué)分析揭示了在高鹽飲食作用下高血壓靶器官基因表達(dá)和腸道微生物群的變化。

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究中發(fā)現(xiàn)的一系列失調(diào)差異轉(zhuǎn)錄因子和腸道菌群有助于解釋高鹽飲食在高血壓疾病發(fā)展過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制，高鹽飲食造成的大鼠腸道菌群組成和功能的顯著變化與多種微生物代謝功能失調(diào)密切相關(guān)。 創(chuàng)新的多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析為探索高血壓及其相關(guān)疾病的分子機(jī)制提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為腸道菌群的靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。