氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜測定魚肉中藍(lán)藻異味代謝物

虞銳鵬， 吳勝芳， 王利平， 宋啟軍

（1. 江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

近年來，湖泊富營養(yǎng)化加重造成水體中藍(lán)藻過度生長，頻繁引發(fā)藍(lán)藻水華[1]。 藻類死亡時(shí)將細(xì)胞內(nèi)大量代謝物釋放到水中[2]，使水質(zhì)嚴(yán)重惡化，散發(fā)的異味引起人們對(duì)水質(zhì)是否達(dá)標(biāo)的恐慌[3]，同時(shí)這些異味代謝物進(jìn)入水產(chǎn)品也引起消費(fèi)者的擔(dān)心。 由于其極低的氣味閾值，以及令人討厭的霉臭味[4-5]與水產(chǎn)品的腥味混在一起，極大地降低了人們的消費(fèi)欲望，同時(shí)魚肉中的復(fù)雜基質(zhì)給分析檢測和食品安全工作提出了挑戰(zhàn)。 國家現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)生活飲用水中臭味物質(zhì)土臭素和2-甲基異莰醇制定了檢測方法[6]，但對(duì)于水產(chǎn)品中各類異味物質(zhì)檢測缺少合適的分析方法。 因此，開發(fā)研究藍(lán)藻異味代謝物的篩查方法具有重要意義。

微波蒸餾和固相微萃取相結(jié)合，作為水蒸氣蒸餾的替代和補(bǔ)充方法，其微波加熱提供的熱量可以快速對(duì)復(fù)雜樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取[7]，SPME可以有效地富集、 凈化揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs），具有省時(shí)、富集效率高、再現(xiàn)性好、不需要使用溶劑，并具有一定的特異性吸附等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。 全自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)可減少轉(zhuǎn)移過程中分析物的損失，大大提高了工作效率，已經(jīng)成為環(huán)境、食品和臨床分析中廣泛使用的萃取技術(shù)之一。 Dias 等采用SPME 富集、GCMS 結(jié)合嗅覺測定鑒定出2-乙酰-1-吡咯啉是影響香米香氣的揮發(fā)性化合物[10]。 Deng 等采用MD 和SPME，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜定量分析，得到薄荷腦中精油和揮發(fā)物的化學(xué)特征[11]。Ternelli 等采用微波輔助蒸餾， 結(jié)合SPME 和氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)藥用橄欖油中的大麻素和萜烯進(jìn)行表征并定量分析[12]。

全二維氣相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（comprehensive two-dimensional gas chromatographyhigh resolution time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-HR-TOFMS） 通過全二維氣相色譜分離克服了傳統(tǒng)一維色譜分析過程中組分共流出的困擾，其高速率的采集數(shù)據(jù)能力和高靈敏度保證了分析信息的高密度和高通量[13]，廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)、食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)藥等復(fù)雜基質(zhì)中痕量化合物的定性定量分析。李楠等應(yīng)用GC×GC-HR-TOFMS精確質(zhì)量數(shù)及保留指數(shù)， 鑒定出熟制中華絨螯蟹122 種揮發(fā)性風(fēng)味成分[14]。黃玲等結(jié)合SPME 和GC×GC-TOFMS 對(duì)威代爾冰葡萄酒中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測分析[15]。

藍(lán)藻中揮發(fā)性物質(zhì)種類豐富并含有獨(dú)特成分，主要為醇類、萜烯類、脂肪族烴、烷基硫化物和鹵化物等。 萜烯類物質(zhì)因具有化感抑制作用，利于藻細(xì)胞在逆境脅迫中生存和繁殖，并抑制其他水生生物生長；大量存在于藻體中的脂肪族烴主要來自脂肪酸脫羧反應(yīng)；烷基硫化物與藻體死亡相關(guān)[16]。根據(jù)其揮發(fā)性代謝物的消長變化規(guī)律[17]，對(duì)其中8 種顯著性差異大、閾值低的異味代謝物進(jìn)行定量分析。 本研究中對(duì)夏秋季節(jié)的湖泊水產(chǎn)品進(jìn)行采集， 采用GC×GC-HR-TOFMS 分析檢測揮發(fā)性異味代謝物，建立了藍(lán)藻主要代謝物的高靈敏度定量分析方法，為評(píng)價(jià)水產(chǎn)品質(zhì)量和監(jiān)測環(huán)境提供了一種可靠手段并積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

50/30 μm Divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane（SP DVB/CAR/PDMS）、85 μm SP CAR/PDMS、100 μm SP PDMS： 美國Supelco 公司產(chǎn)品；85 μm XT DVB/Carbon/PDMS：上海新拓儀器公司產(chǎn)品；20 mL 頂空瓶：德國Gerstel 公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純）：美國天地公司產(chǎn)品；二甲基二硫、二甲基三硫、2-甲基異莰醇、 β-環(huán)檸檬醛、 β-紫羅蘭酮、土臭素、吲哚、3-甲基吲哚及其他化學(xué)品（純度≥98%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)公司產(chǎn)品。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液： 配制質(zhì)量濃度為10 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， 用甲醇逐級(jí)稀釋至0.20 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液。 內(nèi)標(biāo)溶液：100 mg/L 的2-異丁基-3-甲氧基吡嗪用甲醇逐級(jí)稀釋至20.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 工作溶液：用不含目標(biāo)化合物的空白魚肉提取液逐級(jí)稀釋至合適濃度，即用即配。

實(shí)驗(yàn)中所用NaCl 為優(yōu)級(jí)純，在450 ℃烘干6 h后使用。

1.2 儀器與設(shè)備

Pegasus GC-HRT 4D+全二維氣相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（配有固相微萃取自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)）：美國LECO 公司產(chǎn)品；Mili-Q Direct 8 型超純水儀：美國Millipore 公司產(chǎn)品；Explorer 12 全自動(dòng)微波組合化學(xué)合成工作站：美國PYNN 公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微波蒸餾提取方法 取水產(chǎn)品可食用組織勻漿，凍干，稱約2 g 左右于150 mL 微波萃取燒瓶中，加入20 mL 純水充分浸泡。 在微波功率150 W、冷凝水溫8 ℃、提取時(shí)間15 min 條件下，收集蒸餾液，并用水定容，冷藏保存。

1.3.2 固相微萃取方法 于20 mL 萃取瓶內(nèi)加入8 mL 蒸餾餾分及2.0 g NaCl。 在平衡時(shí)間10 min、萃取溫度60 ℃、吸附萃取時(shí)間30 min、不分流進(jìn)樣、解析時(shí)間5 min、解析溫度250 ℃條件下進(jìn)行萃取。

1.3.3 GC×GC-HR-TOFMS 分析條件及數(shù)據(jù)分析GC×GC 條件： 一維色譜柱TR-FFAP （30 m×0.25 mm，0.25 μm），二維色譜柱Rxi-17sil MS（2 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 的速率升溫至230 ℃， 保持7 min； 調(diào)制器調(diào)制周期4 s，500 s 前冷卻時(shí)間1.2 s， 加熱時(shí)間0.8 s，500 s 后冷卻時(shí)間0.8 s，加熱時(shí)間1.2 s；二維色譜柱柱溫箱的溫度全程比一維色譜柱柱溫箱高5 ℃；以高純氦氣作為載氣，恒流模式，流量1 mL/min。

TOFMS 條件：采用EI+離子源，溫度210 ℃，電離能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，檢測器電壓1 800 V，采集質(zhì)量數(shù)范圍（m/z）33～450。

代謝物分析：經(jīng)LECO 軟件自動(dòng)解卷積處理總離子流圖，通過NIST2017 和Wiley9 譜庫匹配，與標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)比定性，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)其中目標(biāo)化合物進(jìn)行定量分析，8 種異味代謝物的信息如表1所示。

表1 異味代謝物的名稱、分子式、CAS 號(hào)、定量離子和定性離子Table 1 Name, formula, CAS number, quantitative and qualitative ions of odor metabolites

2 結(jié)果與分析

2.1 全二維氣相色譜分離條件優(yōu)化

魚肉組織的揮發(fā)性化合物和基質(zhì)十分復(fù)雜，使用GC×GC-HR-TOFMS 在全掃描模式下采集樣品原始數(shù)據(jù)，通過對(duì)譜庫檢索并結(jié)合保留指數(shù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)正、反匹配因子得到類似度大于800 的揮發(fā)性化合物共430 個(gè)。 這些揮發(fā)性化合物形成的非主要碎片雖然量少，但可能會(huì)對(duì)痕量目標(biāo)化合物特征碎片產(chǎn)生干擾，而傳統(tǒng)的一維氣相色譜技術(shù)進(jìn)行分離檢測時(shí)存在峰容量不足、共流出、靈敏性低等問題，因此無法滿足目前肌肉組織中痕量異味代謝物的定量要求。 全二維氣相色譜的冷熱調(diào)制通過冷噴、熱噴時(shí)間的設(shè)定，使眾多化合物能得以更好分離。 在一個(gè)正交GC×GC 系統(tǒng)中，峰容量為其兩個(gè)色譜柱各自峰容量的乘積，分辨率為兩個(gè)色譜柱各自分辨率平方加和的平方根。 因此全二維氣相色譜具有分離能力強(qiáng)、峰容量大、選擇性高的特點(diǎn)。

由圖1（a）可知，樣品的一維總離子流色譜圖中存在大量化合物共流出的現(xiàn)象，即在同一個(gè)一維色譜保留時(shí)間點(diǎn)上，存在多個(gè)物質(zhì)。 經(jīng)過質(zhì)譜鑒定，主要的雜峰來自魚肉組織中醛、酯、酮、酸和烷烴等的干擾，相鄰峰或雜質(zhì)的共流出會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的定性定量有一定干擾。 而經(jīng)二維色譜分離，這些共流出雜質(zhì)并未對(duì)目標(biāo)峰造成干擾，即可在二維色譜上得到較好分離（見圖1（b））。二維色譜具有強(qiáng)大的分離能力， 可清晰地分辨出不同目標(biāo)化合物的色譜峰，更好地進(jìn)行復(fù)雜組分的分離鑒定。 通過兩個(gè)維度的分離避免了性質(zhì)相似VOCs 的彼此干擾， 提高了定量的準(zhǔn)確性，避免假陽性的出現(xiàn)。

圖1 加標(biāo)魚肉揮發(fā)性化合物GC×GC-HR-TOFMS 一維總離子流色譜圖及二維總離子流色譜圖Fig. 1 GC×GC-HR-TOFMS total 1D and 2D ion chromatogram of volatile compounds of odor metabolites in fish samples with added standards

藻類生長典型的代謝物β-環(huán)檸檬醛，其與魚肉基質(zhì)中的丁酸、2-（2-丙烯基）呋喃在一維色譜中難以達(dá)到基線分離， 但在二維色譜中保留時(shí)間分別為：1.210、0.665、0.880 s，即二維色譜能有效分離此3 種化合物；同樣，在一維色譜具有相同保留時(shí)間的土臭素、己酸、某一未知物在二維色譜中得以分離，出峰時(shí)間分別為1.170、0.735、1.280 s； 在一維色譜具有相同保留時(shí)間的3-甲基吲哚、 二苯甲酮、γ-十二內(nèi)酯在二維色譜中得以分離， 出峰時(shí)間分別為0.885、1.145、1.185 s。

2.2 微波蒸餾條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中于樣品組織中添加相同質(zhì)量目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，勻漿凍干，進(jìn)行浸泡時(shí)間、料液質(zhì)量體積比、微波功率及提取時(shí)間等條件優(yōu)化，并以8種異味代謝物色譜峰的總峰面積衡量提取效率。

2.2.1 浸泡時(shí)間的影響 樣品被水浸濕的程度很大程度影響了微波加熱的效果。 在微波功率150 W、料液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL 的情況下， 考察浸泡時(shí)間分別為10、30、60、 90、180 min 時(shí)對(duì)異味代謝物提取效率的影響（見圖2）。 結(jié)果表明隨著浸泡時(shí)間的增長，樣品提取效率變大，由于浸泡會(huì)使組織中細(xì)胞間隙增大，使水分進(jìn)一步進(jìn)入，使得提取效率有所增加。 當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到60 min 時(shí)，基本穩(wěn)定不變，樣品已被水完全浸潤。 因此，選擇浸泡時(shí)間為60 min。

圖2 浸泡時(shí)間對(duì)魚肉中異味代謝物提取效率的影響Fig. 2 Effect of immersion time on the relative extraction efficiency of odor metabolites in fish samples

2.2.2 料液質(zhì)量體積比的影響 水作為溶劑將異味代謝物共同蒸餾出來，水量的多少直接影響了提取效率。 在微波功率150 W、浸泡時(shí)間60 min 的情況下， 考察料液質(zhì)量體積比分別為1 g∶5 mL、1 g∶10 mL、1 g∶15 mL 時(shí)對(duì)異味代謝物提取效率的影響。結(jié)果如圖3 所示，隨著水量增大異味代謝物提取效率增大，當(dāng)料液質(zhì)量體積比達(dá)到1 g∶10 mL 時(shí)，已基本蒸餾完全。 因此，選擇料液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 料液質(zhì)量體積比對(duì)魚肉中異味代謝物提取效率的影響Fig. 3 Effect of solid-liquid ratio on the relative extraction efficiency of odor metabolites in fish samples

2.2.3 微波功率及提取時(shí)間的影響 微波輻射的能量在水與提取物之間進(jìn)行傳遞，以水分子為主的分子劇烈運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生高熱，使細(xì)胞破裂，在較短的時(shí)間內(nèi)釋放出提取物。 微波功率對(duì)于提取效率有較大的影響，在浸泡時(shí)間60 min、料液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL 的條件下， 考察微波功率分別為100、150、200 W 以及不同的提取時(shí)間（5、10、15、20 min）對(duì)異味代謝物提取效率的影響。 結(jié)果如圖4 所示，隨著微波功率逐漸提高，溫度上升，總峰面積也在逐漸升高，在150 W 時(shí)達(dá)到了最大值，之后其提取效率有所下降，這種現(xiàn)象可能由于功率過大也會(huì)使水蒸氣快速逸出，導(dǎo)致水蒸氣來不及將提取物分子完全帶出，有時(shí)會(huì)因?yàn)楫a(chǎn)生較大的氣流量將樣品沖出樣品管， 故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇微波功率150 W 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，較難揮發(fā)化合物β-紫羅蘭酮及3-甲基吲哚需要更長的蒸餾時(shí)間，15 min 可以達(dá)到較完全的回收，收集液體積可達(dá)16 mL。 此外，在不同的蒸餾時(shí)間下會(huì)相應(yīng)得到4～20 mL 的收集液。隨著收集液體積的逐漸增大， 異味代謝物峰面積不斷升高，當(dāng)收集液體積為16 mL 或更多時(shí)，峰面積基本不變，說明已提取完全。 為了保證異味代謝物完全流出，選擇收集液體積為16 mL 及以上，即提取時(shí)間15 min 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 微波功率和提取時(shí)間對(duì)魚肉中異味代謝物提取效率的影響Fig. 4 Effect of microwave power and irritation time on the relative extraction efficiency of odor metabolites in fish samples

2.3 固相微萃取條件優(yōu)化

纖維涂層選擇不同時(shí)萃取纖維頭對(duì)樣品的實(shí)際萃取能力是不同的。 實(shí)驗(yàn)考查了4 種不同萃取纖維頭對(duì)魚肉樣品微波蒸餾餾分萃取能力，8 種目標(biāo)化合物峰面積如圖5 所示。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XT DVB/Carbon/PDMS 對(duì)目標(biāo)化合物萃取效率最大， 總峰面積為1.26×1011，是另外3 種萃取纖維頭的1.18～5.12倍（SP DVB/CAR/PDMS 時(shí)總峰面積為1.07×1011、SP CAR/PDMS 時(shí)總峰面積為9.18×1010、SP PDMS 時(shí)總峰面積為2.46×1010）。 同樣是三合一模式，SP DVB/CAR/PDMS 是雙涂層模式[18]，可能會(huì)對(duì)某些分子產(chǎn)生吸附障礙， 而XT DVB/Carbon/PDMS 采用更加粗糙的無定形顆粒物碳與球狀顆粒物DVB 均勻散布在PDMS 中，可以提高表面積，從而提高異味代謝物的吸附能力。 另外兩種SPME 涂層對(duì)分子的大小、極性強(qiáng)弱各有偏重，不適于性質(zhì)差異大的藍(lán)藻代謝物萃取。 因此， 后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用XT DVB/Carbon/PDMS。

圖5 不同萃取纖維頭對(duì)魚肉中8 種異味代謝物萃取效果的比較Fig. 5 Comparison of different extracted fibers for the extraction of odor metabolites in fish samples

參照作者所在課題組建立的優(yōu)化SPME 萃取條件的方法[17]確定萃取溫度60 ℃、吸附萃取時(shí)間30 min、 質(zhì)量分?jǐn)?shù)20% NaCl 溶液作為水產(chǎn)品異味代謝物分析條件。

2.4 方法學(xué)考察

配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.20、1.00、10.00、100.00 μg/L 的混合校準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用所建立的GC×GC-HR-TOFMS 方法分別進(jìn)樣分析。 方法線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限如表2 所示。 以各化合物的峰面積為縱坐標(biāo)， 對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 異味代謝物在質(zhì)量濃度0.01～100.00 μg/L 時(shí)呈良好線性，分別以3 倍和10 倍信噪比方法計(jì)算得到檢出限為0.07～3.30 μg/kg，定量限為0.2～10.0 μg/kg， 在加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 μg/kg 添加水平下， 日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.26%～8.04%（見表3）。

表2 目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限（3S/N，n＝6）Table 2 Retention time,linear ranges,linear equations,correlation coefficient,limit of detection and limit of quantitation of the target compound（3S/N，n＝6）

表3 異味代謝物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Spiked recovery rate and relative standard deviation of odor metabolites

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本方法收集藍(lán)藻水華暴發(fā)期間（2020 年4月—2021 年9 月）太湖水域12 批次淡水魚樣，包括鯉魚、鯽魚、梅鱭魚、鰱魚、銀魚等常見的水產(chǎn)品進(jìn)行分析。 結(jié)果表明魚樣中8 種異味代謝物檢出率達(dá)11.2%以上， 其中二甲基三硫、 土臭素、 β-環(huán)檸檬醛、 β-紫羅蘭酮、 吲哚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高分別可達(dá)：7.21×102、3.18、1.85×102、94.6、4.69×102μg/kg。 鄒劍敏等發(fā)現(xiàn)羅非魚肉中土臭素達(dá)到0.64～0.97 μg/kg[19]，Deng 等檢測到不同魚組織中β-環(huán)檸檬醛達(dá)到6.0～9.0 μg/kg、β-紫羅蘭酮達(dá)到17～35 μg/kg[20]。 由此可見，淡水魚在春夏季藍(lán)藻暴發(fā)時(shí)期，確實(shí)受到藍(lán)藻異味代謝物影響。

3 結(jié) 語

全二維氣相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜法靈敏度高、采集數(shù)據(jù)能力強(qiáng)，能夠克服復(fù)雜基質(zhì)的共流出問題。 利用高分辨特征離子的精確質(zhì)量數(shù)來準(zhǔn)確測定目標(biāo)化合物，作者應(yīng)用GC×GC-HR-TOFMS 方法檢測8 種藍(lán)藻異味代謝物，所有檢測目標(biāo)化合物分離良好、重現(xiàn)性好，并且采用微波蒸餾將目標(biāo)化合物從魚肉組織中快速提取， 通過固相微萃取富集，該前處理方法簡便快捷，消除復(fù)雜基質(zhì)的干擾，使檢測效率提高。 8 種異味代謝物檢出限可達(dá)到0.07～3.30 μg/kg，低、中、高3 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的加標(biāo)回收率為72.5%～103.7%，RSD≤14.30%。 該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，在實(shí)際應(yīng)用中，檢測效果良好，提高了樣品篩查、定性和定量檢測的準(zhǔn)確性，可用于魚肉樣品中多種藍(lán)藻異味代謝物的篩查及確證，并為食品安全和環(huán)境監(jiān)測提供研究方法與數(shù)據(jù)支持。