改造乙酰羥酸合成酶提高L-亮氨酸產(chǎn)量

劉 寧， 徐建中*

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室， 江蘇 無錫 214122）

L-亮氨酸是主要的支鏈氨基酸之一，主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、動物飼料和化妝品行業(yè)。 目前工業(yè)生產(chǎn)L-亮氨酸的主要方法是微生物發(fā)酵法、直接提取法和化學(xué)合成法[1]。 微生物發(fā)酵法由于成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點而被廣泛運用，工業(yè)常用的菌株為谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌[2]。 在谷氨酸棒桿菌中，L-亮氨酸生物合成與L-異亮氨酸和L-纈氨酸合成密切相關(guān)， 因為這3 個支鏈氨基酸都以丙酮酸為前體，并且代謝步驟中經(jīng)過4 個相同的酶催化反應(yīng)[3-4]，依次由乙酰羥酸合成酶（AHAS，編碼基因ilvBN）、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶（AHAIR，編碼基因ilvC）、二羥酸脫氫酶（DHAD，編碼基因ilvD）以及支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（TAs， 編碼基因ilvE） 催化（見圖1）[5-6]。 其中AHAS 是由兩個ilvB 基因編碼的大亞基（催化亞基）和兩個ilvN 基因編碼的小亞基（調(diào)節(jié)亞基）組成的四聚體。 它是合成途徑中的第一個限速酶，其調(diào)節(jié)亞基受L-亮氨酸、L-纈氨酸和L-異亮氨酸的協(xié)同反饋阻遏， 作用原理是其能與AHAS 的調(diào)節(jié)位點結(jié)合，從而抑制AHAS 活性[7]。 在大腸桿菌（Escherichia coli） 和鼠傷寒桿菌（Salmonella typhimurium） 中，AHAS 存在3 種同工酶， 分別是AHASI、AHASII 和AHASIII， 由操縱子 ilvBN、ilvGMEDA 和ilvIH 所編碼，但并不是全部的細菌都有多種AHAS 同工酶，在谷氨酸棒桿菌中就只存在一種AHAS。 在谷氨酸棒桿菌中，AHAS 主要是受L-纈氨酸的反饋抑制，并且其可以同時催化2 個反應(yīng)， 第一個反應(yīng)是催化丙酮酸生成2-乙酰乳酸，進入L-亮氨酸和L-纈氨酸的合成途徑； 第二個反應(yīng)則是催化2-酮基丁酸和丙酮酸生成2-乙酰-2-羥基丁酸，進而合成L-異亮氨酸[8-9]。因此，AHAS 在支鏈氨基酸的合成過程中占有重要的地位。

圖1 L-亮氨酸合成代謝途徑Fig. 1 Metabolic pathway of synthetic L-leucine

目前對AHAS 的蛋白質(zhì)改造主要集中于降低其對支鏈氨基酸的敏感性，從而來降低支鏈氨基酸的反饋抑制[10]。 Guo 等發(fā)現(xiàn)A42V、A89V、K136E、A42V、A89V 這些突變位點對于AHAS 的蛋白質(zhì)改造具有一定意義[11]；Zhang 等首先過表達基因ilvBN， 然后將47 位異亮氨酸突變成酪氨酸來減少反饋抑制， 最終重組菌株的L-亮氨酸產(chǎn)量達到了32.1 g/L[12]；Hasegawa 等發(fā)現(xiàn)如果將谷氨酸棒桿菌中ilvN 基因的156 位Gly 定點突變成Glu， 并且敲除谷氨酸棒桿菌中的ldhA 基因， 同時過表達ilvBNCDE 可以有效提高AHAS 抗反饋抑制的能力，結(jié)合工藝優(yōu)化后L-纈氨酸產(chǎn)量可達227 g/L[13]；Lu 等通過定點誘變技術(shù)，定點誘變AHAS 調(diào)節(jié)亞基上的位點（N11S、T34I、A36V、T104S、N11F、G14E 和N29H），使突變體對L-異亮氨酸敏感性顯著下降[14]。同時，在代謝工程方面對AHAS 的改造也有一定的進展。 Hou 等在黃色短桿菌中串聯(lián)表達經(jīng)定點突變的ilvEBNrC 基因，L-纈氨酸產(chǎn)量達到了38 g/L[15]；Wang 等將基因ilvBNC 的原始啟動子替換成Ptuf啟動子后，重組菌株最終搖瓶發(fā)酵可獲得28.47 g/L 的L-亮氨酸[7]；崔毅引入L-纈氨酸生產(chǎn)菌中的AHAS突變體， 最終分批補料發(fā)酵生產(chǎn)39.8 g/L 的L-亮氨酸[9]；陳寧等改變中心碳代謝途徑，最終使得L-亮氨酸的產(chǎn)量（53.0 g/L）提高10.0%[16]。

在谷氨酸棒桿菌中，AHAS 對2-酮基丁酸的親和力明顯高于丙酮酸，所以當丙酮酸和2-酮基丁酸同時存在時，AHAS 會優(yōu)先利用2-酮基丁酸合成L-異亮氨酸[17]。 由此可以推測出當存在較高含量的2-酮基丁酸時， 可能會造成L-纈氨酸和L-亮氨酸的合成受限制而造成生長缺陷[18]，從而不利于L-亮氨酸的積累。 作者通過蛋白質(zhì)改造工程對AHAS 進行理性改造，針對其底物偏好性做出優(yōu)化，利用同源建模和分子模擬找出合適突變位點，篩選出最優(yōu)突變體來提高AHAS 對丙酮酸的催化能力，從而提高L-亮氨酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

異丙基β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）、2×Phanta Max Master Mix、2×Tag Max Master Mix （Dye Plus）、卡那霉素： 南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶： 賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；酵母提取物、胰蛋白胨：英國Oxoid 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、定點突變試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 菌株與質(zhì)粒

出發(fā)菌株為作者所在實驗室保藏的C. glutamicum XL-3，由菌株C. glutamicum XQ-9 誘變而來的一株L-亮氨酸生產(chǎn)菌株[19]。 本研究中利用質(zhì)粒pET-28a 進行蛋白質(zhì)表達， 利用質(zhì)粒pK18mobsacB 進行基因的敲除或替換， 大腸桿菌JM109 用于質(zhì)粒構(gòu)建，大腸桿菌BL21（DE3）用于表達目的蛋白質(zhì)。 本實驗中所用的主要菌株與質(zhì)粒如表1 所示，所用引物如表2 所示。

表1 本研究中用到的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.3 培養(yǎng)基與誘導(dǎo)表達

LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10。 LBG 培養(yǎng)基：葡萄糖5、胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10。 EPO 培養(yǎng)基：在LBG 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加30 g/L 甘氨酸、4 g/L 異煙肼和1 g/L 吐溫-80。 LBHIS 培養(yǎng)基：在LB 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加91 g/L 山梨醇和18.5 g/L 腦心浸出液。 種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30、玉米漿30、硫酸銨5、酵母浸膏10、 檸檬酸鈉10、K2HPO4·3H2O 1.3、MnSO4·4H2O 0.01、MgSO4·7H2O 0.4、生物素2×10-4、硫胺素3×10-4和L-蛋氨酸0.4。 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖130、玉米漿25、醋酸銨15、硫酸銨15、檸檬酸鈉2、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO4·3H2O 1.3、L-蛋氨酸0.7、L-異亮氨酸0.06、L-谷氨酸0.5、MnSO4·H2O 0.01、 生物素1×10-4、硫胺素2×10-4、CaCO330。

大腸桿菌在LB 培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)條件是37 ℃、100 r/min。 谷氨酸棒桿菌在LBG 培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)條件是30 ℃、100 r/min[20]。 使用EPO 培養(yǎng)基和LBHIS 培養(yǎng)基構(gòu)建谷氨酸棒桿菌重組菌株[21]。此外，用50 μg/mL 卡那霉素構(gòu)建質(zhì)粒，用25 μg/mL 卡那霉素篩選重組菌株。

誘導(dǎo)表達：將大腸桿菌BL21（DE3）接種于10 mL 液體LB 培養(yǎng)基中， 在37 ℃、100 r/min 的搖床中培養(yǎng)10～12 h，然后以5%接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)移到TB 培養(yǎng)基中。當菌液OD600nm達到0.5～0.6 時加入誘導(dǎo)劑IPTG（0.5 mmol/L），然后放置于16 ℃、100 r/min的搖床中培養(yǎng)16～20 h。 將誘導(dǎo)表達培養(yǎng)后的菌體在4 ℃下以10 000 r/min 離心10 min， 用體積分數(shù)2%的冷KCl 溶液洗滌細胞2 次。 然后用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）懸浮細胞。 利用超聲破碎儀進行細胞破碎15～20 min，然后離心收集上清液，則為粗酶液[11]。

1.4 蛋白質(zhì)純化

首先將粗酶液通過0.45 μm 孔徑的過濾頭進行過濾處理， 然后用結(jié)合液 （10 mmol/L 咪唑、100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，pH 7.4，15 mL）清洗純化柱。用洗脫液 （300 mmol/L 咪唑、100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，pH 7.4，15 mL）洗脫掛柱的蛋白質(zhì)。 洗脫時間為20 min， 洗脫過程中結(jié)合液和洗脫液體積比從90∶10 至40∶60。純化后的酶在4 ℃或-80 ℃下保存。

1.5 分析方法

1.5.1 軟件分析 本研究中使用了蛋白質(zhì)分析軟件 Schordinger、PyMOL 以及同源建模網(wǎng)站Swissmodel。

1.5.2 目的產(chǎn)物測定 目的產(chǎn)物以及支鏈氨基酸主要通過高效液相色譜測定[22]。色譜柱為Agilent HC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A 為乙腈-水溶液 （體積比60∶40）， 流動相B 為乙腈-0.014 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 8.2，體積比20∶80），流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為360 nm，進樣體積為10 μL，每個樣品30 min，最終流動相A 與B的體積比為80∶20。

1.5.3 酶活力測定 反應(yīng)體系為磷酸鉀緩沖液（100 mmol/L，pH 7.4），含50 mmol/L 丙酮酸鈉、10 mmol/L MgCl2、100 mmol/L 硫胺素焦磷酸鹽（TPP）和100 mmol/L 黃素腺嘌呤二核苷酸。 首先添加100 μL 酶液至2.5 mg 磷酸鉀緩沖液中開始反應(yīng)，然后在37 ℃下孵育1 h，最后添加200 μL 3 mol/L H2SO4終止反應(yīng)， 混合物在60 ℃處理15 min。1 mL 體積分數(shù)0.5%肌酸和1 mL 體積分數(shù)5%α-萘酚（在2.5 mol/L NaOH 中進行制備）添加到混合物中， 然后在60 ℃處理20 min， 最終在525 nm處測量反應(yīng)的吸光度。 對照組以同樣的方式進行處理。 一個酶活力單位被定義為每毫克蛋白質(zhì)每分鐘形成的1 nmol 乙酰乳酸[11]。

1.6 谷氨酸棒桿菌雙交換同源重組策略

谷氨酸棒桿菌雙交換同源重組策略如圖2 所示[23]，整個過程使用自殺型質(zhì)粒pK18mobsacB。首先通過融合PCR 技術(shù)將要敲除或替換基因的同源臂進行融合，獲得目的片段，然后將目的片段通過酶切酶連技術(shù)與空質(zhì)粒載體pK18mobsacB 連接在一起，獲得敲除或替換質(zhì)粒。 將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入提前制備好的谷氨酸棒桿菌感受態(tài)中完成第一次同源重組，這一步驟通過卡那霉素抗性以及瓊脂糖凝膠電泳進行篩選，成功獲得完成一次同源的菌株之后進行二次同源篩選。由于質(zhì)粒pK18mobsacB 攜帶了sacB基因，此基因編碼的蛋白質(zhì)使得完成一次同源的菌株不能在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生存，利用sacB 蔗糖致死原理將質(zhì)粒從菌株中脫落來完成二次同源，從而獲得目的重組菌株。

圖2 pK18mobsacB 敲除基因流程Fig. 2 Gene knockout of pK18mobsacB plasmid

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點的選擇

AHAS 是由基因ilvBN 編碼的合成支鏈氨基酸的第一個限速酶，是由兩個大亞基和兩個小亞基組成的四聚體，效應(yīng)物主要與小亞基結(jié)合，使小亞基結(jié)構(gòu)改變達到催化底物的作用，所以后續(xù)的蛋白質(zhì)改造主要針對AHAS 的小亞基結(jié)構(gòu) （編碼基因ilvN）進行突變改造。代謝過程中丙酮酸與小亞基結(jié)合， 催化兩分子丙酮酸脫羧縮合形成2-乙酰乳酸，同時也可催化一分子丙酮酸與一分子2-酮基丁酸縮合形成2-乙酰-2-羥基丁酸。當丙酮酸和2-酮基丁酸同時存在時，AHAS 會優(yōu)先利用2-酮基丁酸合成L-異亮氨酸， 而為了使L-亮氨酸的產(chǎn)量進一步得到優(yōu)化，本研究中嘗試突變AHAS 使其更偏向催化丙酮酸生成2-乙酰乳酸，用于合成目的產(chǎn)物。 考慮到想要改變酶對底物丙酮酸的親和性，首先增加酶與底物的結(jié)合穩(wěn)定性，所以研究過程中主要針對AHAS 與丙酮酸底物結(jié)合位點4 ? 范圍內(nèi)的氨基酸殘基進行突變。

目前還未有報道谷氨酸棒桿菌中AHAS 小亞基精確的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，所以首先利用了同源建模網(wǎng)站Swissmodel 進行AHAS 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測，以2pc6A（2.5 ?）作為模板同源建模得到了AHAS 小亞基的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過分子對接軟件Schordinger 將小亞基和丙酮酸進行對接， 然后將對接結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMOL 進行分析[24]。 結(jié)果如圖3（a）所示，對接之后發(fā)現(xiàn)Ser38、Ile92、Pro134、Arg138、Gln154、Ser155 和Gln157 位于丙酮酸結(jié)合位點附近，推測這7 個氨基酸殘基可能對底物丙酮酸的結(jié)合有一定的作用。 為了找出對底物結(jié)合有重要作用的氨基酸殘基，分別將以上7 個氨基酸突變成丙氨酸，并測定突變酶催化丙酮酸的酶活力。

圖3 分子對接以及突變體的酶活力分析結(jié)果Fig. 3 Results of molecular docking and enzyme activity analysis of mutants

突變體酶活力測定結(jié)果如圖3（b）所示，可以看出，對比AHASWT（野生型），突變體AHASIle92Ala、AHASPro134Ala以及AHASSer155Ala的酶活力變化較小，推測可能不是催化過程中關(guān)鍵的氨基酸殘基，而突變體AHASSer38Ala、AHASArg138Ala、AHASGln154Ala和AHASGln157Ala的酶活力明顯下降， 分別下降至初始酶活力的21%、28%、53%和45%， 在一定程度上說明這4 個位點可能對丙酮酸底物結(jié)合口袋比較重要。 通過分子模擬軟件進一步分析以上位點與丙酮酸的相互作用，結(jié)果如圖3（c）所示，Ser38、Arg138 與底物丙酮酸之間形成氫鍵，理論上這兩個氨基酸殘基對于酶催化底物起著關(guān)鍵的作用，同時這也可能是導(dǎo)致突變體AHASSer38Ala和AHASArg138Ala酶活力明顯下降的原因。 Gln154 和Gln157 雖然與丙酮酸沒有直接的相互作用力， 但是其突變成Ala 后酶活力也受到了較大的影響，推測這兩個位點可能對催化反應(yīng)有重要的作用。 因此后續(xù)研究將圍繞這4 個位點進行定點突變來提高酶活力。

2.2 突變體篩選

目前對于蛋白質(zhì)改造主要通過序列比對、分子模擬技術(shù)以及定點突變挖掘潛在保守位點，將氨基酸突變成性質(zhì)相同或者相反的氨基酸，可能使蛋白質(zhì)與分子間形成新的空間構(gòu)象或者形成新的鍵，從而導(dǎo)致兩者結(jié)合更加緊密，也可能使底物結(jié)合口袋發(fā)生變化使得蛋白質(zhì)對底物的偏好性發(fā)生改變。 為了進一步對Ser38、Arg138、Gln154 和Gln157 這4個位點進行研究， 嘗試進行以下突變Ser38Thr、Arg138Lys、Gln154Lys 以及Gln157Arg，通過定點突變試劑盒得到突變質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到菌株大腸桿菌BL21（DE3）中獲得重組菌株BL21/pET-28ailvBNSer38Thr、BL21/pET -28a -ilvBNArg138Lys、BL21/pET -28a-ilvBNGln154Lys和BL21/pET-28a-ilvBNGln157Arg， 酶活力測定方法參考1.5.3 部分。

單突變體酶活力測定結(jié)果如圖4 （a） 所示，與AHASWT相比較，AHASArg138Lys和AHASGln154Lys分別下降了13%和2%， 但是AHASSer38Thr和AHASGln157Arg的酶活力分別上升了14%和41%，結(jié)果表明通過單突變使得酶活力有了一定的提升。 為了進一步提高酶活力， 將選擇的4 種突變體分別進行兩兩組合突變， 從而獲得了新的突變體AHASSer38Thr/Arg138Lys、AHASSer38Thr/Gln154Lys、AHASSer38Thr/Gln157Arg、AHASArg138Lys/Gln154Lys、AHASArg138Lys/Gln157Arg以及AHASGln154Lys/Gln157Arg。雙突變體酶活力測定結(jié)果如圖4（b）所示，突變體AHASSer38Thr/Gln154Lys和AHASArg138Lys/Gln157Arg的酶活力與AHASWT相比分別上升了20%和14%， 但是都沒有單突變體AHASGln157Arg酶活力高，推測可能是組合突變對酶的催化空間構(gòu)型產(chǎn)生了較大的影響，使得蛋白質(zhì)與底物結(jié)合不緊密。 實驗中測定了野生型和突變體酶對丙酮酸的動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3 所示，與AHASWT相比， 突變體AHASGln157Arg對底物丙酮酸的Km值下降，說明將AHAS 的157 位從Gln 突變?yōu)锳rg 后在一定程度上改變了底物偏好性，提高了酶對丙酮酸的催化能力。 同時從表中可以得到突變體AHASGln157Arg的Kcat/Km高于AHASWT， 所以突變酶與野生酶相比有更高的催化效率， 最終選擇AHASGln157Arg為最優(yōu)突變體。

表3 野生型和突變體酶對丙酮酸合成的動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of wild-type enzyme and mutants to pyruvate

圖4 突變體的酶活力分析Fig. 4 Enzyme activity analysis of mutants

2.3 AHAS 及突變體結(jié)構(gòu)分析

通過上述實驗得到了一個最佳的突變體AHASGln157Arg，提高了酶活力，且顯著提高了AHAS 對底物丙酮酸的親和性。 為了進一步探究酶活力提高的原因， 利用蛋白質(zhì)分子軟件對突變體進行解析。首先利用分子對接軟件Schordinger 將突變后的酶與底物丙酮酸和2-酮基丁酸進行對接，隨后將結(jié)果導(dǎo)入PyMOL 進行相互作用的分析[24]，分析結(jié)果如圖5 所示。 由圖5（a）可知，AHAS 的Gln157 在沒有突變之前雖然與底物丙酮酸結(jié)合位點比較相近，但是與丙酮酸沒有直接的相互作用。 然而突變體AHASGln157Arg的氨基酸殘基Arg157 與底物丙酮酸之間多了一個氫鍵（見圖5（b）），氫鍵對于蛋白質(zhì)與小分子配體之間起著十分關(guān)鍵的作用，這使得丙酮酸與AHAS 之間結(jié)合更加穩(wěn)定， 增加了底物親和性，這可能是突變提高酶活力的重要原因。其次，157 位氨基酸從Gln 突變?yōu)锳rg 后氨基酸殘基的側(cè)鏈變大，這個改變可能會縮小底物結(jié)合口袋，而丙酮酸體積本身就比較小， 縮小的口袋就會更契合丙酮酸，推測這也是突變體酶活力提高的原因之一。

圖5 突變前后蛋白質(zhì)與底物之間的相互作用Fig. 5 Interaction between protein and substrate before and after mutation

此外，分析了AHASWT和AHASGln157Arg與底物2-酮基丁酸的結(jié)合情況。如圖5（c）所示，AHASWT與底物2-酮基丁酸之間形成了3 個氫鍵，氨基酸結(jié)合位點分別是Ser38、Gln157 以及Arg138。當157 位氨基酸從Gln 突變?yōu)锳rg 后， 突變體AHASGln157Arg的157位氨基酸殘基失去了與2-酮基丁酸的氫鍵作用（見圖5（d）），這可能會減弱突變體對2-酮基丁酸的親和力， 改變其對底物丙酮酸和2-酮基丁酸的偏好性， 從而使更多的碳通量流向L-亮氨酸合成途徑，減少副產(chǎn)物L(fēng)-異亮氨酸的積累。

2.4 重組菌株的產(chǎn)量測定

選擇了最優(yōu)突變體AHASGln157Arg，使用谷氨酸棒桿菌雙交換同源重組策略將突變位點引入到基因組，菌株構(gòu)建過程參考1.6 部分。 通過測序驗證獲得重組菌株C. glutamicum XL-3-ilvBNGln157Arg（C. glutamicum XL-3-1）。 將獲得的重組菌株C. glutamicum XL-3-1 搖瓶發(fā)酵結(jié)果進行測定，結(jié)果如圖6 所示。 從圖中可以得出重組菌株C. glutamicum XL-3-1 與出發(fā)菌株的生長情況相近，說明引入的突變并未對菌株的生長造成影響，其L-亮氨酸產(chǎn)量達到了（23.5±1.8）g/L，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了51%；副產(chǎn)物L(fēng)-纈氨酸產(chǎn)量為（4.7±0.7）g/L，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了18%；副產(chǎn)物L(fēng)-異亮氨酸產(chǎn)量為（1.2±0.3） g/L，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量下降了45%。 從產(chǎn)量結(jié)果表明，將AHAS 的Gln157 位點突變成Arg 能夠有效提高AHAS 催化丙酮酸的能力， 減弱其對2-酮基丁酸的親和力， 實現(xiàn)了AHAS底物偏好性的改變，在提高L-亮氨酸產(chǎn)量的同時減少了副產(chǎn)物L(fēng)-異亮氨酸的積累。

圖6 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物分析Fig. 6 Analysis of shake flask fermentation products

3 結(jié) 語

目前關(guān)于支鏈氨基酸主要集中在蛋白質(zhì)水平上解除支鏈氨基酸對AHAS 的反饋抑制以及改造代謝途徑減少副產(chǎn)物來實現(xiàn)支鏈氨基酸的積累[25-26]。然而，關(guān)于通過蛋白質(zhì)改造改變AHAS 的底物偏好性增加支鏈氨基酸積累的研究較少。 本研究中圍繞谷氨酸棒桿菌中AHAS 的調(diào)節(jié)亞基進行定點突變，提高了酶催化底物丙酮酸的活性，從而提高丙酮酸流向L-亮氨酸的代謝通量。首先通過同源建模得到了小亞基的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，然后利用Schordinger 通過分子對接找到AHAS 與丙酮酸底物結(jié)合位點4 ?范圍內(nèi)的7 個氨基酸殘基， 分別為Ser38、Ile92、Pro134、Arg138、Gln154、Ser155 和Gln157， 之后通過丙氨酸掃描確定了4 個重要的氨基酸殘基（Ser38、Arg138、Gln154 和Gln157）。通過測定單突變體 AHASSer38Thr、AHASArg138Lys、AHASGln154Lys、AHASGln157Arg以及雙突變體AHASSer38Thr/Arg138Lys、AHASSer38Thr/Gln154Lys、AHASSer38Thr/Gln157Arg、AHASArg138Lys/Gln154Lys、AHASArg138Lys/Gln157Arg、AHASGln154Lys/Gln157Arg酶活力，發(fā)現(xiàn)單突變AHASGln157Arg的酶活力最高，比AHASWT提高了41%。通過軟件分析可知，酶活力提高可能在于底物與酶結(jié)合更穩(wěn)定或者底物口袋縮小增加了底物親和性。 最后將最優(yōu)突變體AHASGln157Arg引入，獲得重組菌株谷氨酸棒桿菌XL-3-1。 對重組菌株進行搖瓶發(fā)酵可知，L-亮氨酸產(chǎn)量為（23.5±1.8） g/L，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了51%。本研究為AHAS 蛋白質(zhì)改造促進L-亮氨酸的生物合成提供了一種新的思路。