子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1和circPUM1的表達(dá)及診斷價(jià)值

陰莉，許劍利，程其軍，陳新

作者單位：自貢市第一人民醫(yī)院，a婦產(chǎn)科，b中西醫(yī)結(jié)合肺病科，四川 自貢643000

子宮內(nèi)膜癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占據(jù)婦女腫瘤的第二位，病死率占據(jù)婦女腫瘤的第三位，多發(fā)年齡為圍絕經(jīng)期與絕經(jīng)后［1-2］。子宮內(nèi)膜癌相對宮頸癌與卵巢癌病死率低的原因?yàn)榭稍缙诎l(fā)現(xiàn)，早期發(fā)現(xiàn)盡早治療情況下預(yù)后較好，5年生存率高達(dá)90%，但若發(fā)現(xiàn)較遲，病死率將急劇升高［3］，因此提高子宮內(nèi)膜癌的早期診斷效能是臨床孜孜不倦追求的目標(biāo)。環(huán)狀RNA（Circular RNA，circRNAs）是一類非編碼RNA，具有難降解、高穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，其可海綿化miRNA，調(diào)控子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)進(jìn)程［4-6］。circWHSC1與circPUM1均屬于circRNAs，circWHSC1在宮頸癌細(xì)胞C-33A中過表達(dá)可促進(jìn)癌進(jìn)展，反之會(huì)抑制癌進(jìn)展［7］；circ-WHSC1可通過海綿化miR-212-5p調(diào)控AKT3表達(dá)參與三陰性乳腺癌的腫瘤進(jìn)展以及糖酵解途徑［8］。circPUM1可通過海綿吸附miR-615-5p與miR-6753-5p促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展［9］；circPUM1在結(jié)腸癌中可促進(jìn)惡性生物學(xué)行為［10］。但關(guān)于circWHSC1和circPUM1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況以及所發(fā)揮的作用仍未見研究。因此，本研究將從此著手，檢測子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平，分析其對子宮內(nèi)膜癌診斷的價(jià)值，為子宮內(nèi)膜癌早期診斷提供候選分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2020年6月自貢市第一人民醫(yī)院接受治療的120例子宮內(nèi)膜癌病人作為子宮內(nèi)膜癌組，年齡40～65（52.35±7.24）歲；其中絕經(jīng)者81例，未絕經(jīng)者39例。根據(jù)FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ期66例，Ⅱ期26例，Ⅲ期18例，Ⅳ期10例。根據(jù)組織學(xué)分化程度高低分為高分化（G1）組71例、中分化（G2）組35例、低分化（G3）組14例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病人均接受手術(shù)治療；②病理資料完整；③納入研究前未接受放化療以及分子靶向治療；④病人知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在其他腫瘤占位；②入院存在感染；③精神認(rèn)知障礙；④肝腎功能衰竭。

另選取自貢市第一人民醫(yī)院同期行診斷性刮宮確認(rèn)為子宮內(nèi)膜增生的病人123例作為子宮內(nèi)膜增生組，年齡40～65（54.21±7.17）歲。選取體檢健康者125例作為對照組，年齡40～65（53.37±7.58）歲。子宮內(nèi)膜癌組、子宮內(nèi)膜增生組、對照組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 血清標(biāo)本采集 子宮內(nèi)膜癌組病人術(shù)前、子宮內(nèi)膜增生組病人確診后、對照組體檢時(shí)抽取空腹靜脈血5 mL，4 ℃條件下離心，離心力設(shè)置為800g，得上清液保存至-20 ℃冰箱內(nèi)待測。

1.3 研究對象血清circWHSC1和circPUM1水平測定 Trizol法提取子宮內(nèi)膜癌組、子宮內(nèi)膜增生組和對照組血清總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參選用GAPDH，circWHSC1、circPUM1、GAPDH引物序列由上海生工生物工程有限公司構(gòu)建，序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

反轉(zhuǎn)錄試劑盒（D7178M）購自上海碧云天；SYBR Premix Ex TaqTM（DRR420A）購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。qRT-PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；40個(gè)PCR循環(huán)（95 ℃變性10 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸15 s）。2-ΔΔCt方法計(jì)算子宮內(nèi)膜癌病人血清中circWHSC1、circPUM1相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0軟件。本研究計(jì)數(shù)資料均符合正態(tài)分布，以描述，多組間比較采用單因素方差分析，有差異后兩兩比較再采用SNK-q檢驗(yàn)；以例（%）描述計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)；logistic回歸分析法分析血清circWHSC1和circPUM1水平與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的關(guān)系；ROC曲線分析血清circWHSC1和circPUM1表達(dá)水平對子宮內(nèi)膜癌的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組研究對象血清circWHSC1和circPUM1表達(dá)水平比較 與對照組相比，子宮內(nèi)膜增生組血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），子宮內(nèi)膜癌組血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與子宮內(nèi)膜增生組相比，子宮內(nèi)膜癌組血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平均升高（P＜0.05），見表2。

表2 三組血清中circWHSC1和circPUM1表達(dá)水平比較/

表2 三組血清中circWHSC1和circPUM1表達(dá)水平比較/

注：①與對照組相比，P＜0.05。②與子宮內(nèi)膜增生組相比，P＜0.05。

circPUM1 1.01±0.18 1.02±0.17 1.76±0.25①②546.93＜0.001組別對照組子宮內(nèi)膜增生組子宮內(nèi)膜癌組F值P值例數(shù)125 123 120 circWHSC1 1.02±0.21 1.04±0.19 1.93±0.24①②715.08＜0.001

2.2 子宮內(nèi)膜癌不同組織學(xué)分化程度病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平比較 與G1組相比，G2組、G3組子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與G2組相比，G3組子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平均升高（P＜0.05），見表3。

表3 不同組織學(xué)分化程度子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平比較/

表3 不同組織學(xué)分化程度子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平比較/

注：①與G1組相比，P＜0.05。②與G2組相比，P＜0.05。

組別G1組G2組G3組F值P值circPUM1 1.28±0.19 2.35±0.28①2.78±0.52①②396.29＜0.001例數(shù)71 35 14 circWHSC1 1.36±0.22 2.43±0.24①3.89±0.32①②748.45＜0.001

2.3 子宮內(nèi)膜癌不同F(xiàn)IGO分期病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平比較 與Ⅰ期病人相比，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與Ⅱ期病人相比，Ⅲ期、Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與Ⅲ期病人相比，Ⅳ期子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平均升高（P＜0.05），見表4。

表4 不同F(xiàn)IGO分期子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平比較/

表4 不同F(xiàn)IGO分期子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平比較/

注：①與Ⅰ期相比，P＜0.05。②與Ⅱ期相比，P＜0.05。③與Ⅲ期相比，P＜0.05。

circPUM1 1.34±0.19 1.82±0.22①2.46±0.31①②2.94±0.58①②③181.87＜0.001組別Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期F值P值例數(shù)66 26 18 10 circWHSC1 1.28±0.18 1.79±0.20①3.36±0.44①②3.76±0.34①②③512.81＜0.001

2.4 logistic回歸分析法分析血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系 以血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平為自變量，以是否發(fā)生子宮內(nèi)膜癌為因變量，circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病密切相關(guān)（OR=2.75、3.71，P＜0.05），見表5。

表5 血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系

2.5 ROC曲線分析血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平對子宮內(nèi)膜癌的診斷價(jià)值 血清circWHSC1表達(dá)水平對子宮內(nèi)膜癌診斷的曲線下面積為0.88，最佳截?cái)嘀禐?.01，此時(shí)的靈敏度為88.2%，特異度為81.5%；血清circPUM1表達(dá)水平對子宮內(nèi)膜癌診斷的曲線下面積為0.82，最佳截?cái)嘀禐?.65，此時(shí)的靈敏度為79.8%，特異度為83.1%；二者聯(lián)合檢測對子宮內(nèi)膜癌診斷的曲線下面積為0.95，靈敏度為89.1%，特異度為93.5%。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性常見生殖道惡性腫瘤，其發(fā)病率隨社會(huì)發(fā)展而升高，圍絕經(jīng)期以及絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰竭，雌激素降低，免疫功能減弱，較容易發(fā)病。早期發(fā)現(xiàn)及早治療是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后良好的前提條件，治病于初有助于病人長期生存。因此診斷標(biāo)志物的探尋是臨床的長久課題，對于提升子宮內(nèi)膜癌的生存率具有重要意義。

circRNAs是非編碼RNA中的一種，是目前RNA領(lǐng)域的新研究熱點(diǎn)，其呈閉環(huán)狀，含有大量miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，可作為miRNA海綿吸附miRNA，進(jìn)而調(diào)控miRNA下游靶基因，發(fā)揮對靶基因的調(diào)控作用，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用。比如谷文露等［11］通過高通量測序技術(shù)篩選得到hsa_circ_0008234在肺腺癌組織中低表達(dá)，并通過臨床肺腺癌組織、癌旁組織標(biāo)本以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，沉默hsa_circ_0008234表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖與遷移；鄒晨等［12］研究發(fā)現(xiàn)circ_0076704在人胃癌組織中高表達(dá)。而circWHSC1來源于WHSC1基因的外顯子反向剪接。Zong等［13］研究顯示，circWHSC1可通過吸附miR-145與miR-1182，調(diào)節(jié)其下游靶點(diǎn)MUC1以及hTERT表達(dá)。MUC1、hTERT被證實(shí)在子宮內(nèi)膜樣腺癌中高表達(dá)［14-15］。推測circWHSC1可能在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮一定作用。本研究中子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1表達(dá)水平顯著高于對照組以及子宮內(nèi)膜增生組病人血清circWHSC1表達(dá)水平，提示circWHSC1可能在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮促癌作用，logistic回歸分析與ROC曲線結(jié)果顯示，circWHSC1與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病密切相關(guān)，且當(dāng)circWHSC1表達(dá)水平高于3.013時(shí)，對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病有較高診斷價(jià)值，此時(shí)診斷曲線下面積為0.86，靈敏度、特異度均較高，提示circWHSC1有望作為子宮內(nèi)膜癌診斷的血清標(biāo)志物。進(jìn)一步研究顯示，血清circWHSC1與子宮內(nèi)膜癌病人臨床FIGO分期、組織學(xué)分化程度等臨床病理特征相關(guān)，提示circWHSC1與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展有一定關(guān)系。

circPUM1是一種功能性circRNA，定位于線粒體，其在肺腺癌中高表達(dá)，在體內(nèi)與體外增強(qiáng)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生［16］；circPUM1可通過對miR-615-5p與miR-6753-5p的調(diào)控參與卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展［9］；circPUM1在食管癌中有致癌特性，可能通過抑制食管癌細(xì)胞的細(xì)胞焦亡促進(jìn)腫瘤生長［17］。但其在子宮內(nèi)膜癌中仍未見研究，基于子宮內(nèi)膜癌是一個(gè)受多基因調(diào)控的惡性腫瘤，且circPUM1擁有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，我們猜測circPUM1可能在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮作用。本研究中子宮內(nèi)膜癌病人血清circPUM1水平顯著高于對照組以及子宮內(nèi)膜增生組，提示子宮內(nèi)膜癌中血清circPUM1表達(dá)異常，可能與癌進(jìn)展有關(guān)，logistic回歸分析顯示，circPUM1表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病密切相關(guān)，提示血清circPUM1可能作為診斷子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的一個(gè)血清標(biāo)志物，本研究進(jìn)一步使用ROC曲線分析，結(jié)果顯示血清circPUM1表達(dá)水平診斷子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的曲線下面積為0.80，診斷效能高，當(dāng)血清circPUM1表達(dá)水平高于1.650時(shí)，病人罹患子宮內(nèi)膜癌的可能性較高，此時(shí)診斷靈敏度、特異度分別為78.3%、84.8%，診斷可靠性較高，病人需做進(jìn)一步檢查確診。本研究進(jìn)一步對子宮內(nèi)膜癌病人臨床病理特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)血清circPUM1表達(dá)水平與組織學(xué)分化程度、臨床FIGO分期有一定相關(guān)性，提示其可能參與子宮內(nèi)膜癌的癌進(jìn)展，可作為一個(gè)長期監(jiān)控指標(biāo)。通過將血清circWHSC1與circPUM1聯(lián)合檢測，發(fā)現(xiàn)可提高對子宮內(nèi)膜癌的診斷效能，診斷靈敏度與特異度均升高。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌病人血清circWHSC1、circPUM1表達(dá)水平處于高位，二者聯(lián)合檢測有望作為篩查子宮內(nèi)膜癌病人的血清標(biāo)志物，為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷做貢獻(xiàn)。但本研究存在樣本量不足、研究不深入等局限，下一步將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行細(xì)胞以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步探討。