基于循環(huán)腫瘤DNA的分子殘留病灶檢測及其在非小細胞肺癌術后中的應用價值

張金偉，白曉鳴，馬駿

作者單位：1山西醫(yī)科大學第五臨床醫(yī)學院，山西 太原030001；2山西省人民醫(yī)院胸外科，山西 太原030001

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，2020年有近180萬人死于肺癌［1］。而肺癌病人中，大約有85%的病例是腺癌和鱗狀細胞癌為主要亞型的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）［2］。因此非小細胞肺癌的診治對提高肺癌病人的長期預后及生存質量至關重要。在當前NSCLC的治療手段中，手術仍是早中期NSCLC（Ⅰ～Ⅲ期）的主要治療方法［3］。然而，盡管對Ⅰ～Ⅲ期NSCLC病人采取了多模式綜合治療的根治性治療方法，但經此根治性治療后的病人仍有較高的復發(fā)率［4-5］。一是因為目前NSCLC根治性治療后，病人可能存在影像學未發(fā)現(xiàn)的分子殘留病灶（molecular residual disease，MRD），從而導致復發(fā)和預后差［6］。二是當前NSCLC根治術后是使用影像學宏觀地監(jiān)測腫瘤的復發(fā)，但對腫瘤復發(fā)及轉移的識別靈敏度不高（診斷腫瘤復發(fā)較晚）以及缺乏評估治療效果的有效手段；導致病人在腫瘤治療過程中，存在干預過晚、治療不足或治療過度等情況，從而導致預后較差［7］。因而如何及時有效的發(fā)現(xiàn)存在腫瘤復發(fā)或轉移可能的病人、如何對腫瘤病人進行精準的個體化治療并有效的評估其療效，已成為現(xiàn)在NSCLC治療的迫切需求。隨著基于循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）的MRD檢測的液體活檢的臨床應用，能更好地判斷疾病預后、評估治療效果及警示復發(fā)風險。 現(xiàn)除了應用于肺癌的疾病監(jiān)測以外，ctDNA已被證明可以識別結直腸癌、乳腺癌、黑色素瘤等實體腫瘤術后高復發(fā)風險的病人［8-11］。目前血漿來源的ctDNA已被正式批準用于NSCLC病人臨床的樣本檢測［12］。這也有望解決如何更好地識別有復發(fā)風險的和可以從輔助治療中受益的病人，從而避免對已成功治愈的病人進行過度治療等一系列問題。在此背景之下，本文從ctDNA與MRD的概述、ctDNA對于術后NSCLC病人預后和復發(fā)分析及其監(jiān)測策略、ctDNA在NSCLC病人圍手術期輔助治療的應用進行綜述。

1 ctDNA與MRD的概述

1.1 ctDNA與MRD ctDNA即腫瘤循環(huán)DNA，是血液中腫瘤衍生的片段化DNA，ctDNA存在于血漿或血清中，其直接來自腫瘤或循環(huán)腫瘤細胞，主要由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成［13］。1948年，Mandel和Métais［14］報道了健康個體血液中循環(huán)無細胞DNA （ circulating cell-free DNA，cfDNA）的存在。但直到1994年在癌癥病人的血液中檢測到突變的RAS基因片段，cfDNA的臨床潛力才得到了認可［15］。cfDNA指的是血流或其他體液中被包裹的（來自循環(huán)小泡的）和未被包裹的游離DNA；而來源于腫瘤細胞的cfDNA部分即為ctDNA［16］。ctDNA中常包含突變、缺失、插入、重排、拷貝數(shù)異常以及甲基化等相關基因突變信息［17］。

微小殘留病灶（ minimal residual disease，MRD）通常稱為分子殘留病灶或微小殘留病灶。目前可以用于腫瘤檢測的分子標記物有很多，如循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell， CTC）、 ctDNA、非編碼RNA（miRNA、lncRNA、piRNA等）、外泌體和循環(huán)蛋白標志物（CA125、CEA）等。但ctDNA作為MRD的指標最常見［18］。在2021年第18屆中國肺癌高峰論壇上對肺癌MRD達成了專家共識：肺癌MRD指的是治療后，包括正電子發(fā)射體層顯像/CT（positron emission tomography/CT， PET/CT）在內的傳統(tǒng)影像學或實驗室方法不能發(fā)現(xiàn)，但通過液體活檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤來源分子異常，代表著肺癌的持續(xù)存在和臨床進展可能。肺癌分子殘留病灶：在外周血可穩(wěn)定檢測出豐度≥0.02%的ctDNA，包括肺癌驅動基因或其他的Ⅰ類/Ⅱ類基因變異［19］。也就是說此類病人在根治性治療存在MRD，有較高復發(fā)及轉移的風險。

1.2 基于ctDNA 的MRD檢測的主要方法及其優(yōu)缺點 大多數(shù)的cfDNA來自于正常細胞，而腫瘤病人外周血中的ctDNA占比較小。如何對微量的ctDNA進行準確的檢測與定量，是基于ctDNA進行MRD檢測必須要解決的難題［20-22］。目前基因測序有靶向和非靶向兩個主要方向。其中靶向檢測基于候選基因的策略，需要腫瘤基因組的預定義序列信息，可以檢測已知的驅動基因突變（EGFR、KRAS、BRAF）［23］。另外，還能檢測到腫瘤進展前幾周血液中出現(xiàn)的預定義耐藥克?。═790M），并在治療過程中動態(tài)監(jiān)測其變化［24］。最早的靶向檢測方法是基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的分析，如二代的突變擴增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system， ARMS）、實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， qPCR）和三代的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR， DdPCR）。 雖然基于PCR的方法檢測具有理想的靈敏度和高特異性（0.01%～0.001%），但受限于僅能檢測單一的已知突變［25］。因而當前基于PCR的測定方法僅能靶向預定基因中的一到三個變異位點，不能跨多個基因進行多重檢測，也不能檢測類似基因融合等復雜的基因組突變。而基于二代測序面板（next generation sequencing panel， NGS-panel）高通量測序的靶向檢測方法能很好地解決這一問題［26］。NGS包括安全測序系統(tǒng)（Safe-SeqS）、癌癥個體化深度測序（CAPPSeq）和標記擴增深度測序（TAmSeq）等。其可以同時檢測多種類型的突變，包括拷貝數(shù)變異（CNVs）、單核苷酸變異（SNVs）、插入/缺失或基因融合。NGS的廣泛使用使得血漿中ctDNA的更廣泛突變基因分析及檢測實體腫瘤中的MRD成為可能［27-29］。然而，當所分析的基因組區(qū)域（覆蓋范圍）越大，在基因組特定區(qū)域獲得的平均讀數(shù)（深度）就越低，這是一個需要考慮的重要問題。因為深度越低，就越難以可靠地確定突變基因［30］?？紤]到覆蓋基因組的深度和數(shù)量之間的權衡，加上ctDNA的比例和數(shù)量非常低，使用靶向預定基因的熱點或外顯子的引物/探針組行檢測似乎是最合理的方法。Paweletz等［31］設計了一種基于雜交捕獲的測序方法，使用單引物擴增進行標本檢測以減少假陽性?；跀U增子的NGS通過特定基因的外顯子的PCR擴增來增加想要檢測的預定基因序列。并且該方法還適用于對低ctDNA含量的基因分型檢測［32］。

非靶向檢測也是基于NGS技術的檢測方法，旨在通過全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）或全基因組測序（whole exome sequencing，WGS）提供突變和拷貝數(shù)變異的外顯子組或全基因組分析。此方法不需要原發(fā)性腫瘤基因組的預定義基因組區(qū)域，能識別腫瘤治療期間發(fā)生的新基因突變。非靶向檢測的主要優(yōu)點是能夠同時研究多種癌癥特異性變異。目前的檢測方法在識別復發(fā)方面的靈敏度和特異性分別為82%～100%和70%～100%［33］。WES檢測范圍包括人類已知較多基因的編碼區(qū)序列，盡管可檢測序列占整個基因組的比例很小，但卻包含了多數(shù)的基因變異［34］。另外，WES可以同時檢測預期的致癌驅動因子或耐藥機制，并具有發(fā)現(xiàn)和探索新的耐藥分子機制的能力。但缺點是大多數(shù)臨床相關的基因融合發(fā)生在非編碼區(qū)，WES無法檢測到這一類基因突變。相較之下，WGS檢測范圍更為全面，是對整個基因組進行檢測，除了能檢測編碼區(qū)，還能檢測到非編碼區(qū)以及調控區(qū)的結構變異。但WGS的全面性檢測為其應用帶來了顯而易見的挑戰(zhàn)。因為對整個基因組檢測，會檢測到很多內含子和基因間區(qū)域內變異，而此區(qū)域內變異的功能在很大程度上是未知的，因此這些被檢測的未知數(shù)據的分析解讀是一個難題。其次，在保證檢測數(shù)據深度和質量的條件下，WGS的檢測成本會顯著高于WES的檢測成本。

2 ctDNA對于術后NSCLC病人預后和復發(fā)分析及其檢測策略

2.1 圍術期ctDNA陽性與更差的DFS、OS及高復發(fā)風險有關 NSCLC病人圍手術期ctDNA陽性，與更差的預后及腫瘤復發(fā)有關。Yue等［35］在回顧性研究中發(fā)現(xiàn)術前ctDNA陽性病人的無復發(fā)生存率（relapse free survival，RFS）低于ctDNA陰性的病人（P=0.030）；術后ctDNA陽性的病人復發(fā)風險較高（P=0.010）；其中術后3個月ctDNA陽性的病人RFS顯著性降低（P＜0.01）。Li等［36］的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)術前檢測ctDNA陽性的病人，與較低的RFS（P=0.022）和OS（P=0.026）有關；同樣，術后ctDNA陽性也與較短的RFS（P=0.012）有關。而術后連續(xù)性監(jiān)測ctDNA陽性的病人RFS（P＜0.01）及OS（P=0.010）較陰性病人顯著降低。也就是說術前及術后ctDNA陽性的病人具有更差的RFS。但有人認為術前及術后的ctDNA陽性對病情的評估價值不同。Ohara等［37］認為術前ctDNA陽性與疾病預后相關，但不是復發(fā)的簡單預測因子；而術后的病人ctDNA術后復發(fā)風險高。可能是因為術前ctDNA陽性與腫瘤大小相關［38］，并且與淋巴結受累相關［39］。也就是說術前ctDNA陽性病人疾病分期比陰性病人更晚，從而預后更差。而術后ctDNA陽性表明存在MRD可能，與腫瘤的復發(fā)相關［40］。相反的是，Isaksson等［41］研究報道認為術前ctDNA陽性也是病人復發(fā)的預測因子。導致以上研究結果差異的原因尚不明確。但可以肯定的是，無論術前ctDNA陽性是否是腫瘤復發(fā)的預測因子，其陽性一定與更差的預后相關。而術后ctDNA陽性說明存在MRD，腫瘤的復發(fā)與轉移的風險高，也會導致預后不佳。換而言之，圍術期ctDNA陽性與病人較差的預后相關。

2.2 術后什么時候開始檢測ctDNA MRD是對根治性手術或治療后的病情進行評估，因此術后ctDNA的檢測對判斷是否存在MRD至關重要。然而，在NSCLC術后病人中，血漿中清除ctDNA的機制尚不清楚。而手術如何影響ctDNA的釋放和清除也不明確，也不能確定檢測陽性是因為術后MRD的存在還是由于ctDNA尚未完全消失（因為檢測時間可能在ctDNA半衰期內）［42］。因此關于ctDNA在臨床實際應用中的術后監(jiān)測和合適的時間，尚未建立統(tǒng)一標準［26］。Ohara等［37］證實根治性腫瘤切除術后ctDNA水平迅速下降。Gale等［44］的研究結果認為對殘留疾病的分析在術后1～3 d檢測陽性與疾病復發(fā)無關，ctDNA檢測應該推遲在術后3 d之后。與此相同的是，Chen等［39］在前瞻性研究（NCT02965391）發(fā)現(xiàn)術后第1天ctDNA陽性病人與陰性病人的RFS及OS差異無統(tǒng)計學意義，陽性病人與陰性病人的RFS差異無統(tǒng)計學意義。而術后第3天及術后1個月ctDNA陽性病人與陰性病人的RFS及OS差異有統(tǒng)計學意義。因此他們的研究結果表明R0切除術后3 d作為基線檢測較為合理。同時這些研究表明，可以通過術后3 d可檢測到的ctDNA情況對NSCLC術后病人復發(fā)風險進行準確的分層，并對生存預后進行預測。除此以外，術后ctDNA分析將有助于制定術后隨訪計劃和確定術后輔助治療的適應證；但是仍需要更多的隊列前瞻性研究來驗證使用其預測復發(fā)的可行性和經濟效益。

2.3 ctDNA與影像學的關系 影像學中，CT掃描能比X線更早地檢測到NSCLC病人術后的疾病進展，但兩組病人的總體生存率差異無統(tǒng)計學意義［44］。這提示影像學對腫瘤復發(fā)及轉移的診斷監(jiān)測很難在時間上進一步提前。Abbosh等［45］報道了82%的病人在臨床復發(fā)時或之前檢測到ctDNA。說明基于ctDNA檢測具有廣泛的應用條件及重要的價值。很多研究證明基于ctDNA可以較影像學更早地發(fā)現(xiàn)腫瘤的復發(fā)與轉移；盡管提前的中位數(shù)時間不一致，但能肯定ctDNA在術后隨訪中的有用性［35-37，40］。值得注意的是，盡管ctDNA術后動態(tài)隨訪的價值優(yōu)于CT掃描。但無法取代影像學檢查；仍需根據具體情況與影像學聯(lián)合應用。如果病人沒有出現(xiàn)腫瘤相關癥狀復發(fā)且ctDNA陰性，可以單行ctDNA檢測，而不需要影像學檢查。若病人出現(xiàn)了新的腫瘤相關癥狀，不管是否存在ctDNA陽性，都應該進行CT掃描，因為可能由于ctDNA假陰性而忽略掉腫瘤復發(fā)。如果CT證實了疾病的進展，提示應該調整治療方案或盡早采取干預措施。然而，最具挑戰(zhàn)性且仍未解決的情況是如何處理臨床穩(wěn)定的病人檢測到ctDNA或ctDNA由陰性轉為陽性。一項關于單純ctDNA陽性病人的試驗（APPLE-EORTC）正在開展，未來有望給出答案［46］。

3 ctDNA在NSCLC病人圍手術期輔助治療的應用

對于可切除的非小細胞肺癌（NSCLC）病人，根治性手術是美國國家綜合癌癥網絡（NCCN）指南推薦的標準治療。然而，相當大比例的病人最終在切除后出現(xiàn)復發(fā)并死亡［4］。一些研究表明將在可切除手術病人行新輔助或輔助放化療、免疫治療等治療統(tǒng)稱為圍手術期治療，并發(fā)現(xiàn)其可以改善臨床結果，使OS提高5%［47］。因此，即使是早期NSCLC，以手術為主的綜合治療的根治性治療方法才有益提高病人的長期生存。

Yue等［35］在回顧性研究中分析了ⅠB～ⅢA期行NAT+手術治療的NSCLC病人；其中NAT包括免疫治療+化療、雙重免疫治療以及單純化療。主要病理緩解（major pathological response，MPR）率免疫+化療組為58.33%，雙免組為25.00%，化療組為16.67%。NAT期間的ctDNA動態(tài)與MPR高度一致，顯示出100%的靈敏度和83.33%的特異度，總體準確率為91.67%。說明術前ctDNA動態(tài)變化可預測接受新輔助免疫治療和/或化療的非小細胞肺癌病人的治療療效。

關于術后輔助化療（adjuvant chemotherapy，ACT），有薈萃分析表明其對早期NSCLC病人完全切除后的5年生存率、總生存率和無瘤生存率的益處微乎其微［48］。相反，NSCLC病人在ACT治療后通常會出現(xiàn)幾種Ⅲ級和Ⅳ級的毒副作用，如中性粒細胞減少、貧血、乏力、惡心、嘔吐和與治療相關的死亡［49］。而通過ctDNA檢測能識別合適的病人進行輔助化療，以減少過度治療帶來的無效毒性。Kuang等［50］對于術后ctDNA陽性的病人研究中，與化療后ctDNA轉為陰性的病人相比，化療后ctDNA陽性病人的RFS較差（HR=8.68，P=0.022）?；熀骳tDNA陰性與化療后ctDNA陽性病人相比遠期療效更好（HR=4.76，P=0.047）。同樣的，Qiu等［51］的研究中證明在接受ACT治療的病人中，ACT術后ctDNA陽性與較差的RFS顯著相關（P＜0.05），而術后ctDNA陽性的非ACT病人均在一年內復發(fā)。同時在根據是否接受ACT治療或術后是否有可檢測到的ctDNA對所有Ⅱ～Ⅲ期臨床高危病人進行分層中，ctDNA陽性病人的復發(fā)風險顯著高于陰性組（無論是否行ACT治療）。相比之下，接受ACT治療的ctDNA陽性病人的RFS高于未接受ACT治療的ctDNA陽性病人（P＜0.05）。另外，一項大規(guī)模前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)基于ctDNA的MRD狀態(tài)比包括TNM分期在內的所有研究的臨床病理變量更能預測復發(fā)；與未接受輔助治療的病人相比，輔助治療能改善MRD陽性病人的RFS（HR=0.3，P=0.008）；但沒有改善MRD陰性病人的RFS（HR=3.1，P＜0.001）［52］。說明ctDNA狀態(tài)因能準確識別適合輔助治療的病人以及評估術后輔助化療的療效，從而指導術后輔助治療。也就是說ctDNA陽性病人應該積極行術后化療，而ctDNA陰性病人則不應行化療等輔助治療。然而，Abbosh等［53］報道了3例在術后30 d內檢測到ctDNA并接受輔助化療的病人在化療后ctDNA水平增加，并且均在1年內出現(xiàn)疾病復發(fā)。這也提示隨訪期間的ctDNA檢測對識別疾病復發(fā)具有較高的敏感性，同時保持適度的特異性。換句話說，ctDNA動態(tài)檢測可能會告訴我們術后輔助治療中耐藥性的問題。正如免疫抑制劑治療的應用中，ctDNA對于識別正在接受第一代和第二代TKI治療的病人中EGFR外顯子p.T790M的耐藥點突變至關重要［54］。若ctDNA結果為p.T790M陽性的病人應進行第三代TKIs治療（如osimertinib），而ctDNA結果為該突變陰性的病人應進行組織活檢，以排除假陰性結果的發(fā)生［55］。當然，ctDNA對于ACT治療的耐藥性仍需進一步研究。綜上，術前ctDNA動態(tài)監(jiān)測預測新輔助治療的效果；而術后ctDNA狀態(tài)可以對是否需要行術后輔助治療的病人進行區(qū)分并評估療效。即ctDNA陽性病人更有可能從ACT等輔助治療中受益，而陰性病人復發(fā)率低。提示對于ctDNA陽性的病人應該行術后輔助治療，ctDNA陰性病人似乎只需隨訪檢測，無需輔助治療。另外，ctDNA有望能通過對耐藥性的檢測指導術后輔助治療的用藥。

總的來說，基于ctDNA的MRD動態(tài)檢測，能很好地反映NSCLC病人的預后。術前及術后ctDNA陽性的病人顯然與更差的DFS、OS有關，并且復發(fā)率更高。術后對ctDNA的連續(xù)性檢測不僅能識別更多的復發(fā)病人，還能比影像學更早地發(fā)現(xiàn)腫瘤復發(fā)，給及時調整治療方案提供了寶貴的時間。當然，圍手術期各時間段的ctDNA陽性意義不盡相同；目前看來，術前及術后3 d的ctDNA陽性具有評估預后價值。另外，MRD除了通過對ctDNA檢測陽性與否來評估術后輔助治療的療效以及維持治療的用藥時間，還有望通過耐藥性的基因分析指導輔助治療用藥，從而對NSCLC術后病人輔助治療進行精準的指導，為提高病人的存活率和改善預后作出貢獻。然而，缺乏多中心、前瞻性、多數(shù)據的隨機對照研究來對以上結論進行論證是MRD應用于臨床存在的一個挑戰(zhàn)。而另一個主要挑戰(zhàn)在于ctDNA檢測方法學上。一方面，ctDNA的檢測技術仍需不斷完善，以解決當前存在的靈敏度受限和病人覆蓋率不足的問題。另一方面，現(xiàn)各類方法學在MRD中的優(yōu)劣對比還需進一步探索和細分，例如腫瘤基因變異數(shù)量可能影響MRD監(jiān)控效能，而驅動變異與非驅動變異的腫瘤，在腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）和整體腫瘤基因變異方面均有極大的差異，攜帶驅動變異的病人整體腫瘤基因變異一般遠遠少于并不攜帶驅動變異的病人，對于這兩類人的MRD檢測技術如何選擇需進一步論證。盡管在提高檢測準確性方面存在挑戰(zhàn)，但現(xiàn)在肺癌的分類和治療越來越依賴于分子和基因檢測，而通過獲取腫瘤組織的方式不具有可重復性。并且隨著以ctDNA為主的MRD的檢測技術不斷研究和完善，MRD結果的精確、高效得到保障，并結合其安全、易重復性特點，基于ctDNA的MRD檢測在肺癌治療中有巨大潛力，將來在臨床上有廣泛的應用前景。