• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    過表達(dá)miR-664a-5p激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠骨重建

    2023-10-16 00:42:52趙敏孫紅剛蹇潔賀前松
    中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志 2023年9期
    關(guān)鍵詞:茜素成骨骨細(xì)胞

    趙敏 孫紅剛 蹇潔 賀前松

    八一骨科醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川 成都 610000

    骨質(zhì)疏松(OP)是一種慢性系統(tǒng)性骨病,以老年人和絕經(jīng)后婦女居多,主要表現(xiàn)為骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞和骨量下降[1]。當(dāng)骨重建失衡時(shí),骨形成少于骨吸收,進(jìn)而引發(fā)OP[2]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞,同時(shí)具有較低的免疫排斥性[3]。研究表明ADSCs在OP中扮演重要角色[4],如ADSCs能夠促進(jìn)OP裸鼠骨再生[5],修復(fù)OP大鼠脛骨缺損[6]、顱骨缺損等[7]。然而其成骨機(jī)制尚不清楚。miRNA是一種約為20 nt的非編碼RNA,能夠參與細(xì)胞增殖、遷移及成骨細(xì)胞分化等過程。一些研究表明miR-664的異常表達(dá)與細(xì)胞分化有關(guān)。如miR-664-5p通過靶向血清應(yīng)答因子和Wnt1促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖并抑制成肌細(xì)胞分化[8]。miR-664a-5p促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)元分化[9]。miR-664a-5p促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨分化[10]。絕經(jīng)后婦女骨組織miRNA表達(dá)譜顯示,miR-664a-5p表達(dá)顯著下調(diào)[11],這表明miR-664a-5p可能參與ADSCs對(duì)OP的成骨分化。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞成骨分化、OP發(fā)病和進(jìn)展中起重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)柚皮苷通過激活Wnt/β-catenin通路,促進(jìn)ADSCs成骨分化[13]。胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞通過激活Wnt/β-catenin通路,促進(jìn)OP骨折大鼠成骨[14]。然而ADSCs是否通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路促進(jìn)OP骨重建研究較少。

    本研究通過觀察過表達(dá)miR-664a-5p的ADSCs對(duì)OP大鼠骨重建的作用及對(duì)Wnt/β-catenin通路的影響,以期為OP骨重建提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    40只8周齡體質(zhì)量為200~220 g的SPF級(jí)雌性SD大鼠,購(gòu)買于四川大學(xué)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)[SCXK(川)2018-026]。于室溫23~25 ℃、標(biāo)準(zhǔn)濕度55 %~60 %、光照/黑夜各12 h環(huán)境中飼養(yǎng),飲水飲食正常,1周后實(shí)驗(yàn)。本研究通過八一骨科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20210312),實(shí)驗(yàn)過程遵循3R原則。

    1.2 主要試劑和儀器

    胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司);CD34、CD45、CD90、CD105抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);茜素紅、油紅O、堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、ALP、骨鈣素(OCN)抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。蛋白電泳儀、熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司);熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);Micro-CT顯微掃描儀(德國(guó)Siemens公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1ADSCs的培養(yǎng)與鑒定:ADSCs的分離和培養(yǎng):取大鼠腹部脂肪組織,經(jīng)胰酶消化、100目濾網(wǎng)過濾后收集細(xì)胞。用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),每隔48 h換液一次,取第3代ADSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。ADSCs成骨分化:取第3代ADSCs,用成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化,3周后進(jìn)行ALP染色和茜素紅染色,顯微鏡下觀察成骨染色效果。ADSCs成脂分化:取第3代ADSCs,用成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化,待脂滴變得足夠大、圓時(shí)進(jìn)行油紅O染色,顯微鏡下觀察成脂染色效果。ADSCs表面標(biāo)志物的鑒定:取第3代ADSCs,分別加入FITC標(biāo)記的CD34、CD45、CD90及CD105,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞相應(yīng)抗原的表達(dá)。

    1.3.2慢病毒感染ADSCs:將過表達(dá)miR-664a-5p及陰性對(duì)照的慢病毒加入8 μg/mL polybrene感染ADSCs(記作miR-664a-5p-ADSCs組和ADSCs組)。感染24 h后更換無病毒培養(yǎng)基。用嘌呤霉素篩選陽(yáng)性細(xì)胞。

    1.3.3CCK-8法檢測(cè)ADSCs增殖:將ADSCs接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h。將原培養(yǎng)基更換成含有10 % CCK-8溶液的新鮮培養(yǎng)基。并置于37 ℃下孵育1 h。檢測(cè)樣品在450 nm處的吸光度。

    1.3.4Transwell法檢測(cè)ADSCs遷移:Transwell小室上室加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的各組ADSCs,下室加入含有10 %胎牛血清的培養(yǎng)基,并置于37 ℃下孵育24 h。經(jīng)甲醛固定,結(jié)晶紫染色后,顯微鏡下對(duì)穿膜細(xì)胞進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)。

    1.3.5ALP染色和茜素紅染色法檢測(cè)ADSCs成骨能力:取各組ADSCs,利用ALP染色和茜素紅染色檢測(cè)ADSCs成骨能力,方法同1.3.1。

    1.3.6OP大鼠模型制作與分組:40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、卵巢摘除組(OVX)、ADSCs組和miR-664a-5p-ADSCs組,每組各10只。腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,仰臥位固定大鼠、備皮消毒。自恥骨2~3 cm縱向切開皮膚,分離筋膜,切除卵巢(桑葚狀紅色組織),縫合筋膜和皮膚組織。Sham組僅切除卵巢周圍脂肪組織。3個(gè)月后,ADSCs組和miR-664a-5p-ADSCs組分別尾靜脈注射感染pHRi-miR-NC的ADSCs和感染pHRi-miR-664a-5p的ADSCs;Sham組和OVX組注射等量生理鹽水。注射1個(gè)月后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)過程中未有大鼠死亡。

    1.3.7micro-CT掃描和重建:造模4個(gè)月后處死大鼠,取股骨置于4%多聚甲醛中固定,避光保存。micro-CT對(duì)股骨進(jìn)行掃描和重建,比較骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)和骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)等指標(biāo)。

    1.3.8HE染色觀察新骨形成:將股骨置于EDTA脫鈣液中脫鈣,每隔2 d更換一次脫鈣液,當(dāng)探針能輕易刺破骨骼時(shí)表示脫鈣完成。流水沖洗、脫水包埋,制作石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟、乙醇梯度脫水、HE染色、透明封片,顯微鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)。

    1.3.9TRAP染色觀察破骨細(xì)胞形成:石蠟切片經(jīng)脫蠟、乙醇梯度脫水、TRAP染色、蘇木精染細(xì)胞核、乙醇梯度脫水,透明封片,顯微鏡下觀察破骨細(xì)胞染色情況并計(jì)數(shù)。

    1.3.10免疫組化染色檢測(cè)Runx2、ALP、OCN水平:石蠟切片經(jīng)脫蠟、脫水、高溫抗原修復(fù)、血清封閉、加入Runx2、ALP、OCN一抗(1∶400)4 ℃孵育過夜,二抗37 ℃孵育1 h,滴加DAB顯色液、蘇木精復(fù)染、脫水、透明封片,顯微鏡下觀察染色情況并計(jì)算陽(yáng)性面積百分比。

    1.3.11RT-qPCR檢測(cè)miR-664a-5p、Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA水平:采用Trizol試劑從股骨組織中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR Green法進(jìn)行擴(kuò)增,GAPDH作內(nèi)參。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性60 s,95 ℃ 10 s,60 ℃ 50 s,共40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCT公式計(jì)算miR-664a-5p、Runx2、ALP、OCN mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

    1.3.12Western blot檢測(cè)Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin水平:取各組股骨組織,提取并測(cè)定蛋白濃度,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜后,脫脂奶粉中封閉2 h,分別加入Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin一抗(1∶2 000)4 ℃過夜,加入二抗(1∶5 000)4 ℃孵育2 h,ECL顯色劑顯色,凝膠成像儀拍照,分析各組蛋白相對(duì)GAPDH的表達(dá)量。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較用單因素方差分析(ANOVA),兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ADSCs的形態(tài)觀察和鑒定

    P3代ADSCs呈長(zhǎng)梭形,形態(tài)趨于一致。ALP染色可見藍(lán)紫色染色結(jié)節(jié);茜素紅染色可見橙紅色鈣化結(jié)節(jié);油紅O染色可見紅色融合變大的脂滴。ADSCs表面標(biāo)志物CD90和CD105呈陽(yáng)性表達(dá),造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34和CD45呈陰性表達(dá)。見圖1。

    注:A:P3代ADSCs形態(tài);B:ALP染色;C:茜素紅染色;D:油紅O染色;E:流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    2.2 miR-664a-5p促進(jìn)ADSCs增殖、遷移和成骨能力

    pHRi-miR-664a-5p感染ADSCs后,ADSCs中miR-664a-5p表達(dá)升高(P<0.05)。CCK-8實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、ALP染色和茜素紅染色結(jié)果顯示,與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組ADSCs增殖、遷移和成骨能力明顯提高(P<0.05)。見圖2。

    注:A:RT-qPCR法檢測(cè)miR-664a-5p表達(dá);B:CCK-8法;C:Transwell法;D:ALP染色;E:茜素紅染色;與ADSCs組比較,*P<0.05。

    2.3 miR-664a-5p-ADSCs對(duì)OP大鼠骨重建的作用

    RT-qPCR結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組miR-664a-5p水平明顯降低(P<0.05);與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組miR-664a-5p水平明顯升高(P<0.05);與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組miR-664a-5p水平明顯升高(P<0.05)。micro-CT結(jié)果和骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)顯示,與Sham組相比,OVX組骨密度明顯降低,橫斷面可見明顯骨髓空腔,Tb.Th、Tb.N和BV/TV明顯減小,Tb.Sp明顯增大(P<0.05);與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組骨密度明顯升高,骨髓空腔減小,Tb.Th、Tb.N和BV/TV明顯增大,Tb.Sp明顯減小(P<0.05);與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組骨密度升高,骨髓空腔減小,Tb.Th、Tb.N和BV/TV明顯增大,Tb.Sp明顯減小(P<0.05)。HE染色和TRAP染色結(jié)果顯示,Sham組骨小梁完整,破骨細(xì)胞較少;OVX組骨小梁稀疏且變薄,破骨細(xì)胞較多,說明OVX組大鼠OP嚴(yán)重。與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組骨小梁增加且增厚,破骨細(xì)胞較少。見圖3。

    注:A:RT-qPCR法檢測(cè)miR-664a-5p表達(dá);B:micro-CT;C:骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測(cè);D:HE染色(200×);E:TRAP染色(200×);與Sham組比較,*P<0.05;與OVX組比較,#P<0.05;與ADSCs組比較,△P<0.05。

    2.4 miR-664a-5p-ADSCs對(duì)OP大鼠成骨相關(guān)基因Runx2、ALP及OCN表達(dá)的影響

    免疫組化染色、RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組Runx2、ALP及OCN mRNA和蛋白水平明顯降低(P<0.05);與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組Runx2、ALP及OCN mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05);與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組Runx2、ALP及OCN mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖4。

    2.5 miR-664a-5p-ADSCs對(duì)OP大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

    RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明顯降低(P<0.05);與OVX組相比,ADSCs組、miR-664a-5p-ADSCs組Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05);與ADSCs組相比,miR-664a-5p-ADSCs組Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖5。

    注:A:RT-qPCR法檢測(cè)Wnt、β-catenin mRNA表達(dá);B:Western blot檢測(cè)Wnt、β-catenin表達(dá);與Sham組相比,*P<0.05;與OVX組比較,#P<0.05;與ADSCs組比較,△P<0.05。

    3 討論

    OP患者全身骨量減少,容易發(fā)生骨折。ADSCs具有快速繁殖和成骨分化的潛力,在治療OP方面比BMSCs更有優(yōu)勢(shì)。OVX動(dòng)物模型中,ADSCs成骨能力不受雌激素缺乏的影響,且成骨能力和健康動(dòng)物相似,同時(shí)能夠促進(jìn)造血干細(xì)胞匯集到骨髓,為自體移植提供了可能[15]。研究表明OP大鼠近端和遠(yuǎn)端移植自體ADSCs均能增強(qiáng)骨密度,改善骨微細(xì)結(jié)構(gòu),促進(jìn)骨再生[16-17]。尾靜脈注射ADSCs能夠抑制破骨細(xì)胞活性,增加骨密度,改善骨質(zhì)病理結(jié)構(gòu);同時(shí)ADSCs還能分泌多種骨細(xì)胞激活因子,防止骨量流失[18-19]。另外研究發(fā)現(xiàn)OP患者ADSCs也能進(jìn)行成骨分化[20]。有學(xué)者分別從年輕和老年絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)患者體內(nèi)獲取ADSCs,發(fā)現(xiàn)ADSCs均可發(fā)生增殖和成骨分化,且將PMOP患者ADSCs放入條件培養(yǎng)液后,其成骨潛能顯著提高[21-22]。另有研究者在臨床上也通過自體移植ADSCs來修復(fù)患者的顱骨缺損[23-24]和上頜骨缺損[25]。由此可見人源ADSCs具有一定的成骨潛能,可考慮作為移植的細(xì)胞來源。研究發(fā)現(xiàn)miR-664a-5p能夠促進(jìn)BMSCs的成骨分化[26],且miR-664a-5p在絕經(jīng)后婦女骨組織中表達(dá)顯著下調(diào)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-664a-5p能夠提高ADSCs的增殖、遷移和成骨分化能力,從而為ADSCs的歸巢和成骨分化提供了更大的可能。將miR-664a-5p-ADSCs經(jīng)尾靜脈注入去卵巢OP大鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)OP大鼠骨組織miR-664a-5p水平較低,而miR-664a-5p-ADSCs顯著促進(jìn)新骨形成,且成骨情況優(yōu)于單純ADSCs組,與Sham組較接近。推測(cè)miR-664a-5p可能是影響OP發(fā)病的因素,且miR-664a-5p修飾的ADSCs能夠增強(qiáng)miR-664a-5p表達(dá),使移植后的ADSCs在宿主中存活更久,并分泌對(duì)OP有利的特定蛋白,起到治療miR-664a-5p的目的。

    Runx2是骨形成和骨重塑的重要轉(zhuǎn)錄因子;ALP、OCN是成骨分化早期標(biāo)志物,直接反映成骨細(xì)胞的活性和功能情況,在骨折患者體內(nèi)表達(dá)異常升高。成骨細(xì)胞活性及其成骨分化能力是骨再生的必要條件。研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后OP患者中成骨標(biāo)志物ALP、OCN的表達(dá)顯著降低,通過上調(diào)成骨相關(guān)基因和Runx2的表達(dá)能夠緩解OP進(jìn)展[27-28]。在OP兔右下頜骨牽張成骨過程中,Runx2修飾的ADSCs治療促進(jìn)了OP性下頜骨牽張成骨期間的新骨形成,并補(bǔ)償了OP對(duì)新骨形成的不利影響[29]。本研究在基因和蛋白水平發(fā)現(xiàn),miR-664a-5p-ADSCs組相比ADSCs組和OVX組,更能提高OP大鼠體內(nèi)Runx2、ALP、OCN的表達(dá),同時(shí)抑制破骨細(xì)胞活性,促進(jìn)新骨生成。

    Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與成骨細(xì)胞增殖和分化,在OP的發(fā)病和進(jìn)展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)OP小鼠Wnt、β-catenin表達(dá)下調(diào),褪黑素通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs成骨分化和延緩OVX小鼠骨量丟失[30]。同樣巴戟天也通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)體內(nèi)、體外MSCs的成骨分化能力[31]。本研究發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠Wnt、β-catenin表達(dá)下調(diào),miR-664a-5p-ADSCs組相比ADSCs組明顯提高Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平。說明過表達(dá)miR-664a-5p的ADSCs通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)OP大鼠骨重建。

    綜上所述,過表達(dá)miR-664a-5p的ADSCs通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)OP大鼠骨重建。ADSCs在改善OP方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

    猜你喜歡
    茜素成骨骨細(xì)胞
    機(jī)械應(yīng)力下骨細(xì)胞行為變化的研究進(jìn)展
    茜素紅“開關(guān)式”熒光探針測(cè)定水中微量銅
    經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與牙周膜干細(xì)胞成骨分化
    調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能的相關(guān)信號(hào)分子的研究進(jìn)展
    醌茜素抑制PI3K通路的磷酸化對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞凋亡和自噬的影響
    骨細(xì)胞在正畸牙移動(dòng)骨重塑中作用的研究進(jìn)展
    糖尿病大鼠Nfic與成骨相關(guān)基因表達(dá)的研究
    芬頓法氧化降解水中茜素紅的研究*
    廣州化工(2016年8期)2016-09-02 00:48:12
    液晶/聚氨酯復(fù)合基底影響rBMSCs成骨分化的研究
    30例Ⅰ型成骨不全患者股骨干骨折術(shù)后康復(fù)護(hù)理
    老司机深夜福利视频在线观看 | 婷婷色综合大香蕉| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 七月丁香在线播放| 久久久久久久久免费视频了| 欧美精品亚洲一区二区| 国产一级毛片在线| 国产精品国产av在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 九草在线视频观看| 午夜日本视频在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 综合色丁香网| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲成人一二三区av| av在线app专区| kizo精华| 亚洲第一区二区三区不卡| 青草久久国产| svipshipincom国产片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美成人午夜精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 制服丝袜香蕉在线| 操美女的视频在线观看| 在线观看国产h片| 一本久久精品| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲国产看品久久| 免费观看人在逋| 久久精品亚洲av国产电影网| 色综合欧美亚洲国产小说| 一二三四中文在线观看免费高清| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产成人系列免费观看| 国产毛片在线视频| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲国产av新网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 最近最新中文字幕免费大全7| 999精品在线视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 人妻一区二区av| 男女无遮挡免费网站观看| 无遮挡黄片免费观看| 久久天堂一区二区三区四区| 制服丝袜香蕉在线| 看非洲黑人一级黄片| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲三区欧美一区| 丝袜喷水一区| 老司机影院毛片| av在线观看视频网站免费| 99热网站在线观看| av卡一久久| 韩国av在线不卡| 日日啪夜夜爽| 深夜精品福利| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产高清国产精品国产三级| 老司机在亚洲福利影院| 丝袜喷水一区| 亚洲人成77777在线视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品久久久久成人av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美激情 高清一区二区三区| 香蕉丝袜av| 观看av在线不卡| 一级毛片电影观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久精品国产亚洲av涩爱| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 成人三级做爰电影| 一级黄片播放器| 熟女av电影| 男人操女人黄网站| 一级毛片我不卡| 在线 av 中文字幕| 久热这里只有精品99| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产日韩欧美视频二区| 不卡视频在线观看欧美| 成人国产av品久久久| 国产成人精品在线电影| 91aial.com中文字幕在线观看| 色吧在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 一个人免费看片子| 亚洲成人av在线免费| 成人毛片60女人毛片免费| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| www日本在线高清视频| 嫩草影视91久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 丰满乱子伦码专区| 日韩免费高清中文字幕av| 美女视频免费永久观看网站| 99国产精品免费福利视频| 国产精品 国内视频| 成人国产av品久久久| 日韩免费高清中文字幕av| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久精品国产亚洲av涩爱| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲av福利一区| 亚洲国产最新在线播放| 97在线人人人人妻| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 少妇的丰满在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲精品美女久久av网站| 18在线观看网站| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品国产av成人精品| 99热全是精品| 深夜精品福利| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久国产一区二区| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品一区蜜桃| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 一区二区av电影网| 国产成人av激情在线播放| 超碰成人久久| 亚洲第一av免费看| av.在线天堂| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产av国产精品国产| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 99re6热这里在线精品视频| 1024视频免费在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久网色| 欧美变态另类bdsm刘玥| 天天操日日干夜夜撸| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| av国产久精品久网站免费入址| 99久久人妻综合| 午夜福利免费观看在线| 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品久久久久成人av| 久久久精品区二区三区| 中文字幕制服av| 天堂俺去俺来也www色官网| 妹子高潮喷水视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 性色av一级| 韩国高清视频一区二区三区| 一区二区三区激情视频| 中文字幕制服av| 在线观看人妻少妇| 精品一区二区三卡| 搡老岳熟女国产| 久久av网站| 精品少妇黑人巨大在线播放| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲av男天堂| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜影院在线不卡| 欧美精品一区二区大全| 久久ye,这里只有精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| 两个人免费观看高清视频| 男的添女的下面高潮视频| 国产男女内射视频| 欧美成人午夜精品| 亚洲人成77777在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 99久久人妻综合| a级毛片在线看网站| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| av网站免费在线观看视频| 久久青草综合色| 少妇精品久久久久久久| 观看av在线不卡| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久女婷五月综合色啪小说| 成人影院久久| 丝袜喷水一区| 亚洲欧洲国产日韩| 啦啦啦啦在线视频资源| 天天添夜夜摸| 国产成人免费观看mmmm| 国产99久久九九免费精品| 亚洲伊人久久精品综合| 99九九在线精品视频| 国产色婷婷99| 交换朋友夫妻互换小说| 成人影院久久| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲,欧美,日韩| 日韩大码丰满熟妇| 男女国产视频网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲天堂av无毛| 欧美乱码精品一区二区三区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人漫画全彩无遮挡| 国产一级毛片在线| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩免费高清中文字幕av| kizo精华| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久久久久久国产电影| 欧美精品一区二区免费开放| 下体分泌物呈黄色| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品久久久av美女十八| 视频区图区小说| 日韩 亚洲 欧美在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产黄色免费在线视频| 99久国产av精品国产电影| 亚洲国产日韩一区二区| 国产高清国产精品国产三级| videos熟女内射| 一区二区三区精品91| 国产在视频线精品| 久久久久久久久久久免费av| 看免费av毛片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 色综合欧美亚洲国产小说| 中文字幕制服av| 1024视频免费在线观看| av女优亚洲男人天堂| 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久久国产欧美日韩av| 成人国产麻豆网| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产高清不卡午夜福利| 免费观看性生交大片5| avwww免费| 极品人妻少妇av视频| 亚洲精品在线美女| 视频在线观看一区二区三区| 在线 av 中文字幕| av.在线天堂| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美在线黄色| 最近最新中文字幕免费大全7| 欧美成人精品欧美一级黄| 色精品久久人妻99蜜桃| 高清欧美精品videossex| 精品少妇黑人巨大在线播放| 两个人看的免费小视频| 亚洲第一av免费看| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 91国产中文字幕| www日本在线高清视频| 色94色欧美一区二区| 国产精品女同一区二区软件| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 男女午夜视频在线观看| 少妇人妻 视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜福利影视在线免费观看| videosex国产| 黄色怎么调成土黄色| 赤兔流量卡办理| 精品久久蜜臀av无| 欧美av亚洲av综合av国产av | 少妇精品久久久久久久| 精品一区二区三区四区五区乱码 | av在线老鸭窝| 成人国产av品久久久| 欧美日韩福利视频一区二区| 秋霞在线观看毛片| 亚洲精品视频女| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 岛国毛片在线播放| 久久青草综合色| 1024香蕉在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 国产不卡av网站在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 日韩电影二区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 丁香六月天网| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲精品在线美女| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一二三四中文在线观看免费高清| 妹子高潮喷水视频| 最近手机中文字幕大全| 精品一区二区三卡| 51午夜福利影视在线观看| www.熟女人妻精品国产| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 最新的欧美精品一区二区| 黄色怎么调成土黄色| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲七黄色美女视频| 久久久精品94久久精品| 激情视频va一区二区三区| 伦理电影大哥的女人| 中文字幕色久视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 一级片'在线观看视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| netflix在线观看网站| 久久鲁丝午夜福利片| 精品第一国产精品| 在线精品无人区一区二区三| 久久精品久久精品一区二区三区| www.av在线官网国产| 国产一区二区 视频在线| 国产又色又爽无遮挡免| 国产视频首页在线观看| 黄片小视频在线播放| 搡老乐熟女国产| 午夜免费观看性视频| 亚洲av福利一区| 欧美av亚洲av综合av国产av | 国产不卡av网站在线观看| 夫妻午夜视频| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品久久久人人做人人爽| av网站在线播放免费| 国产免费又黄又爽又色| av网站在线播放免费| 欧美在线黄色| 多毛熟女@视频| 美女午夜性视频免费| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| av在线老鸭窝| 一边亲一边摸免费视频| 日韩一区二区视频免费看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产免费又黄又爽又色| 国产精品 欧美亚洲| 一区二区日韩欧美中文字幕| 丰满乱子伦码专区| 亚洲第一青青草原| 久久青草综合色| 看免费成人av毛片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久99热这里只频精品6学生| 国产探花极品一区二区| 久久97久久精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 赤兔流量卡办理| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 制服丝袜香蕉在线| 久久久久精品性色| 18在线观看网站| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产精品国产三级专区第一集| 99热全是精品| av免费观看日本| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产极品粉嫩免费观看在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品视频人人做人人爽| 久久久精品94久久精品| 国产毛片在线视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲天堂av无毛| 妹子高潮喷水视频| 亚洲天堂av无毛| 三上悠亚av全集在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 最近最新中文字幕免费大全7| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 狂野欧美激情性xxxx| 天天影视国产精品| 久久久精品94久久精品| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 女性生殖器流出的白浆| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲成人av在线免费| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品免费视频内射| 国产一区二区三区av在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日日撸夜夜添| 午夜福利乱码中文字幕| 青春草亚洲视频在线观看| 国产毛片在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 老司机影院成人| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 亚洲精品一区蜜桃| 成人三级做爰电影| 熟女av电影| av在线播放精品| 国产高清不卡午夜福利| 美女国产高潮福利片在线看| 又大又爽又粗| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成人国语在线视频| 另类亚洲欧美激情| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲国产日韩一区二区| 国产在视频线精品| 久久免费观看电影| 黄色 视频免费看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 十八禁高潮呻吟视频| 精品久久蜜臀av无| 国产又色又爽无遮挡免| 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费高清在线观看日韩| 9热在线视频观看99| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲专区中文字幕在线 | 国产不卡av网站在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲成色77777| 婷婷色综合www| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲欧美激情在线| 午夜老司机福利片| 搡老岳熟女国产| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产精品无大码| 久久久久久久国产电影| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产av码专区亚洲av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 婷婷色麻豆天堂久久| 18禁动态无遮挡网站| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久狼人影院| 国产成人av激情在线播放| 中文天堂在线官网| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产一区二区三区av在线| 亚洲精品一区蜜桃| 多毛熟女@视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 中文天堂在线官网| 飞空精品影院首页| 色吧在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 欧美在线黄色| 各种免费的搞黄视频| 自线自在国产av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美成人午夜精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 无限看片的www在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 搡老乐熟女国产| 妹子高潮喷水视频| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜91福利影院| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 免费av中文字幕在线| 天天影视国产精品| 中国三级夫妇交换| 三上悠亚av全集在线观看| 国产一区二区三区av在线| 韩国av在线不卡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 久久精品久久久久久久性| 天天操日日干夜夜撸| 老司机影院成人| 香蕉丝袜av| 9191精品国产免费久久| 国产av码专区亚洲av| 亚洲一区中文字幕在线| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费黄色在线免费观看| 黄片无遮挡物在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 美女大奶头黄色视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩大码丰满熟妇| 少妇人妻精品综合一区二区| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲国产最新在线播放| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲欧美清纯卡通| 满18在线观看网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲天堂av无毛| 熟妇人妻不卡中文字幕| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线观看www视频免费| 最黄视频免费看| videos熟女内射| 夫妻午夜视频| 国产成人一区二区在线| 精品一区在线观看国产| 亚洲国产精品999| 久久97久久精品| 18禁国产床啪视频网站| 久久ye,这里只有精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| av国产精品久久久久影院| 国产av精品麻豆| 中文字幕精品免费在线观看视频| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久热爱精品视频在线9| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 性色av一级| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 晚上一个人看的免费电影| 十八禁人妻一区二区| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜av观看不卡| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 最近中文字幕2019免费版| 美女国产高潮福利片在线看| 叶爱在线成人免费视频播放| 日韩免费高清中文字幕av| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 午夜日本视频在线| 妹子高潮喷水视频| av福利片在线| 97在线人人人人妻| 亚洲av成人精品一二三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲欧洲日产国产| 久久av网站| 亚洲国产最新在线播放| 午夜福利网站1000一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 嫩草影视91久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 成年动漫av网址| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 国产毛片在线视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 看十八女毛片水多多多| 午夜福利影视在线免费观看| 国产成人精品无人区| 曰老女人黄片| 亚洲人成电影观看| 国产精品久久久久久久久免| 色婷婷av一区二区三区视频| 无遮挡黄片免费观看| 国产男女内射视频| 国产又色又爽无遮挡免| 国产成人av激情在线播放| 久久久国产精品麻豆| 一本久久精品| 永久免费av网站大全| 亚洲五月色婷婷综合| 两性夫妻黄色片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产精品 欧美亚洲| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品国产国语对白av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| www日本在线高清视频| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品在线美女| 精品一区二区免费观看| 一区福利在线观看| 午夜免费鲁丝| 色网站视频免费| 国产精品99久久99久久久不卡 | 黄色视频在线播放观看不卡| 国产一区二区三区av在线| 韩国精品一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| kizo精华| svipshipincom国产片| 看免费成人av毛片|