五味子甲素對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠SDF-1/CXCR4信號(hào)通路的影響

樸海旺 金寶城 趙勝軍

承德市中心醫(yī)院骨二科,河北 承德 067000

骨是一種由有機(jī)基質(zhì)礦化而不斷形成的再生組織,成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞參與骨平衡的構(gòu)建[1-2]。而破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞形成和功能的不平衡導(dǎo)致了許多骨疾病,如骨質(zhì)疏松癥[3]。骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病,可引起骨折[4]。五味子為臨床常用中藥,具有補(bǔ)腎養(yǎng)肺、生津止咳、保肝護(hù)肝、有助睡眠等功效[5]。五味子甲素是五味子的果實(shí)提取物,研究表明,五味子甲素能抑制Toll樣受體4/核因子κB通路,降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥因子水平及腸道黏膜通透性,保護(hù)大鼠結(jié)腸組織[6]。五味子甲素同時(shí)也具備良好的抗腫瘤活性,能對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起到抑制作用,且五味子甲素能增強(qiáng)化療敏感性,在協(xié)同抗癌藥物治療方面能增強(qiáng)抗癌藥物的藥效[7]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)/CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)通路與成骨分化有著密切的聯(lián)系,有研究表明,SDF-1/CXCR4通路能夠通過介導(dǎo)Janus激酶2/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路的激活,參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化過程[8]。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)五味子具有抗骨質(zhì)疏松的效果,但這一效果是否是五味子甲素在發(fā)揮作用尚未可知。故本研究擬探討五味子甲素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的作用效果,并分析SDF-1/CXCR4通路在這一過程中的作用,以期為治療骨質(zhì)疏松癥的新藥研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物:SPF級(jí)別雌性SD大鼠,8～10周齡,體重242～268 g,購自江蘇珂瑪麒生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2021-0014,所有大鼠均飼養(yǎng)于室溫為20～25 ℃,相對(duì)濕度為50 %～70 %的飼養(yǎng)房中,自由取食、飲水,自動(dòng)光照/黑暗交替(12 h/12 h)。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),審批號(hào):基礎(chǔ)LS2022(043)。

1.1.2藥物與試劑:五味子甲素(批號(hào)MR39852,原料藥,純度≥98.8 %)、SDF-1/CXCR4通路抑制劑(AMD3100)(批號(hào)MF90184)購自湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)有限公司;阿侖膦酸鈉片(批號(hào)20210905)購自海南全星制藥有限公司;Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX-Ⅰ)、骨鈣素(OC)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、HE染色試劑盒、BCA試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)分別為C23884、C39202、C20458、C59274、C10358)均購自青島中仁澳蘭生物工程有限公司;Trizol試劑、PCR試劑盒、蛋白裂解液、ECL發(fā)光液(批號(hào)分別為HAS0241、HAS3732、HAS1829、HAS5824)均購自深圳海思安生物技術(shù)有限公司;兔源SDF-1、CXCR4、GAPDH一抗、羊抗兔二抗(批號(hào)分別為SR00710、SR00529、SR10539、SR27481)均購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器:雙能X射線骨密度儀(型號(hào)Dexa Pro-II)、酶標(biāo)儀(型號(hào)Synergy2)、顯微鏡(型號(hào)moticBA210)、熒光定量PCR儀(型號(hào)m2000rt)均購自上海然哲儀器設(shè)備有限公司;離心機(jī)(型號(hào)TD-4W)、凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)CBIO-UV6)均購自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1建模、分組及給藥:采用去卵巢法構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥大鼠模型[9]:SD大鼠禁食不禁水12 h后,戊巴比妥鈉麻醉,固定于手術(shù)臺(tái)上,下腹部備皮,沿下腹部正中線切口,打開腹腔,結(jié)扎雙側(cè)卵巢動(dòng)脈,切除雙側(cè)卵巢組織及周圍少許脂肪組織,逐層縫合,消毒,抗生素預(yù)防感染。另取12只大鼠作為假手術(shù)組,手術(shù)過程中僅暴露卵巢不切除。手術(shù)12周后,采用雙能X射線骨密度儀分別測(cè)定造模及假手術(shù)組大鼠左、右股骨骨密度(BMD),以造模大鼠左、右股骨BMD值低于假手術(shù)組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義視為造模成功[10]。取造模成功的60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)表法分為模型組、五味子甲素低(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)劑量組[11]、阿侖膦酸鈉(1 mg/kg)組[12]、五味子甲素高劑量+AMD3100(40 mg/kg+5 mg/kg)組[13],每組12只。

分組完成后,五味子甲素低、高劑量大鼠分別給予20 mg/kg、40 mg/kg五味子甲素灌胃給藥[11](將五味子甲素和生理鹽水混溶成濃度分別為2 mg/mL、4 mg/mL的混懸液,灌胃體積10 mL/kg);阿侖膦酸鈉組大鼠給予1 mg/kg阿侖膦酸鈉灌胃給藥[12](將阿侖膦酸鈉片和生理鹽水混溶成濃度為0.1 mg/mL的混懸液,灌胃體積10 mL/kg);五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠給予40 mg/kg五味子甲素灌胃,然后腹腔注射5 mg/kg的AMD3100[13];假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。各組給藥每天1次,連續(xù)12周。

1.2.2大鼠左、右股骨BMD的測(cè)定:給藥結(jié)束后,戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采用雙能X射線骨密度儀分別測(cè)定各組大鼠左、右股骨BMD。

1.2.3大鼠血清中CTX-Ⅰ、OC水平的測(cè)定:BMD檢測(cè)完成后,處死大鼠,心臟取血3 mL,分離大鼠雙側(cè)股骨組織,并分為兩部分,一部分用4 %多聚甲醛固定,另一部分置于-80 ℃冰箱中保存。將收集的血液樣品置于離心機(jī)中,4 ℃下5 800 r/min離心17 min,取上清,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作方法及步驟,檢測(cè)上清液中CTX-Ⅰ、OC水平。

1.2.4大鼠股骨組織病理學(xué)變化:取1.2.3中固定于4 %多聚甲醛的大鼠股骨組織,脫鈣,石蠟包埋,切片(5 μm),HE染色,顯微鏡下觀察大鼠股骨組織病理學(xué)變化。

1.2.5大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4信使RNA(mRNA)水平的測(cè)定:取1.2.3中凍存大鼠股骨組織,加入液氮充分研磨,Trizol試劑提取股骨組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平,內(nèi)參為GAPDH。引物由廈門侖昌碩生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成,引物序列見表1。反應(yīng)體系參照PCR試劑盒進(jìn)行配置,SDF-1、CXCR4 mRNA水平使用2-△△Ct法計(jì)算。

表1 引物序列

1.2.6大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平的測(cè)定:取1.2.3中凍存大鼠股骨組織,加入液氮充分研磨,蛋白裂解液裂解,4 ℃下9 000 r/min離心14 min,BCA試劑盒定量總蛋白,取20 μg總蛋白,電泳分離后轉(zhuǎn)膜,室溫下脫脂牛奶(5 %)封閉1 h,然后與稀釋好的兔源SDF-1(1∶530)、CXCR4(1∶820)、GAPDH(1∶950)一抗在4 ℃下過夜,加入羊抗兔二抗(1∶2 400),室溫孵育1 h,ECL試劑顯影,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算SDF-1、CXCR4蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 五味子甲素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠左、右股骨BMD的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠左、右股骨BMD顯著降低(P<0.05);與模型組相比,五味子甲素低、高劑量組大鼠左、右股骨BMD依次升高(P<0.05);與五味子甲素高劑量組相比,阿侖膦酸鈉組大鼠左、右股骨BMD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠左、右股骨BMD顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠左、右股骨BMD的比較

2.2 五味子甲素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,五味子甲素低、高劑量組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平依次升高(P<0.05);與五味子甲素高劑量組相比,阿侖膦酸鈉組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中OC、CTX-Ⅰ水平的比較

2.3 五味子甲素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織病理學(xué)變化的影響

假手術(shù)組大鼠股骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)正常,排列規(guī)則;模型組大鼠股骨組織骨小梁稀疏斷裂,數(shù)量減少,排列紊亂;五味子甲素低、高劑量組大鼠股骨組織上述病理學(xué)變化程度依次減輕;阿侖膦酸鈉組與五味子甲素高劑量組大鼠股骨組織病理學(xué)變化無顯著差異;與五味子甲素高劑量組相比,五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠股骨組織病理損傷加重。見圖1。

圖1 各組大鼠股骨組織病理變化圖(HE染色,200×)

2.4 五味子甲素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,五味子甲素低、高劑量組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平依次升高(P<0.05);與五味子甲素高劑量組相比,阿侖膦酸鈉組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA水平的比較

2.5 五味子甲素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,五味子甲素低、高劑量組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平依次升高(P<0.05);與五味子甲素高劑量組相比,阿侖膦酸鈉組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),五味子甲素高劑量+AMD3100組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表5。

注:A:假手術(shù)組;B:模型組;C:五味子甲素低劑量組;D:五味子甲素高劑量組;E:阿侖膦酸鈉組;F:五味子甲素高劑量+AMD3100組。

表5 各組大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4蛋白水平的比較

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的特點(diǎn)是骨強(qiáng)度低,骨折風(fēng)險(xiǎn)高,骨折的發(fā)生也能導(dǎo)致嚴(yán)重臨床后果,包括疼痛、殘疾、喪失獨(dú)立性甚至死亡[14]。通常情況下,骨質(zhì)疏松癥通過測(cè)量BMD進(jìn)行診斷,某些情況下,也可以通過脆性骨折或獨(dú)立于BMD的高骨折概率來診斷[15]。但骨質(zhì)疏松癥的治療較為復(fù)雜,通常情況下需要健康的生活方式和良好的營養(yǎng),預(yù)防跌倒,以及避免暴露于骨骼毒素和藥物治療[16]。CTX-Ⅰ是骨吸收過程中的產(chǎn)物,血液中CTX-Ⅰ的水平能反映骨吸收過程,同時(shí)也能反映骨細(xì)胞的活動(dòng)情況。OC是一種非膠原蛋白,其水平變化能反映骨代謝的變化[17]。在骨質(zhì)疏松癥中,CTX-Ⅰ和OC水平的下降代表了骨代謝的失衡[18]。本研究通過去卵巢法構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥大鼠模型,結(jié)果顯示造模成功的大鼠左、右股骨BMD、血清中OC、CTX-Ⅰ水平顯著降低,病理學(xué)結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠股骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)正常,排列規(guī)則;模型組大鼠股骨組織骨小梁稀疏斷裂,數(shù)量減少,排列紊亂。表明骨質(zhì)疏松癥大鼠模型構(gòu)建成功,股骨組織發(fā)生病變。

五味子甲素是五味子的主要活性成分,有抗炎、抗癌、抗病毒等作用[19]。耿峰等[20]研究表明,五味子甲素能顯著降低腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平,改善大鼠腸上皮黏膜屏障功能。五味子的藥效廣泛,具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,維持骨平衡等作用,同時(shí)對(duì)于調(diào)控破骨細(xì)胞和保護(hù)軟骨組織方面均具有一定效果[21]。既往有研究顯示,五味子提取物可以改善骨質(zhì)疏松大鼠的骨強(qiáng)度和骨代謝,其機(jī)制是抑制破骨細(xì)胞骨吸收和增加成骨細(xì)胞分化的活性[22]。本研究使用五味子甲素處理骨質(zhì)疏松癥大鼠以探究五味子甲素在骨質(zhì)疏松癥中的作用,結(jié)果顯示,五味子甲素處理后的骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織病變程度減輕,大鼠左、右股骨BMD、血清中OC、CTX-Ⅰ水平升高,且五味子甲素劑量越高,改善效果越好。表明五味子甲素能抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠BMD的下降,改善大鼠骨質(zhì)疏松,結(jié)合姜南希等[21]的研究,猜測(cè)這可能與五味子甲素能維持骨平衡有關(guān)。

SDF-1/CXCR4信號(hào)通路參與多種器官病理生理過程,還與細(xì)胞分化等過程密切相關(guān)[23]。石新慧等[24]研究表明,瑞芬太尼能通過抑制SDF-1/CXCR4信號(hào)通路,減輕氣腹大鼠腎損傷。Wang等[25]報(bào)道,柚皮素可促進(jìn)SDF-1/CXCR4信號(hào)通路活化,從而增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。SDF-1/CXCR4通路在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用,鄂遠(yuǎn)等[26]研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)腎活血湯能通過激活SDF-1/CXCR4通路,加速骨質(zhì)疏松骨折大鼠的骨折愈合,促進(jìn)骨形成。本研究發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白水平顯著低于健康大鼠;經(jīng)五味子甲素處理后,骨質(zhì)疏松癥大鼠股骨組織中SDF-1、CXCR4 mRNA和蛋白水平顯著升高,且呈現(xiàn)劑量依賴性。在高劑量五味子甲素的基礎(chǔ)上給予AMD3100干預(yù)后發(fā)現(xiàn),AMD3100可逆轉(zhuǎn)高劑量五味子甲素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠上述指標(biāo)的改善效果。結(jié)合Wang等[25]和鄂遠(yuǎn)等[26]研究結(jié)果,本研究認(rèn)為五味子甲素對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的治療作用,其機(jī)制可能與激活SDF-1/CXCR4信號(hào)通路有關(guān),SDF-1/CXCR4通路表達(dá)增強(qiáng)會(huì)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,改善骨質(zhì)疏松癥狀。

綜上所述,五味子甲素能抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠BMD的下降,減輕大鼠股骨組織病變,改善大鼠骨質(zhì)疏松,這一機(jī)制可能通過激活SDF-1/CXCR4信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。但本研究僅探究了五味子甲素通過SDF-1/CXCR4信號(hào)通路對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的保護(hù)作用,五味子甲素能否通過其他通路發(fā)揮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的治療作用,有待深入研究。