壯骨止痛方通過RANKL/RANK信號(hào)通路抑制骨吸收的機(jī)制研究

蔡昕瑤 陳瑤 陳詩淇 郁潔 雷曉明

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,湖南 長沙 410208

2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿與康復(fù)學(xué)院,湖南 長沙 410208

3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院血管生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410208

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種骨代謝障礙的慢性疾病,以骨量流失,骨組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)被打亂,骨單位遭到破壞,骨脆性增加甚至并發(fā)骨折為主要特征[1]。女性絕經(jīng)后雌激素水平下降,成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)介導(dǎo)的骨形成活動(dòng)和破骨細(xì)胞 (osteoclast, OC)介導(dǎo)的骨吸收活動(dòng)平衡被打破,出現(xiàn)腰背疼痛,骨量下降,骨質(zhì)流失等骨質(zhì)疏松癥的表現(xiàn)[2]。各種酶、炎癥、內(nèi)分泌以及機(jī)械刺激信號(hào)調(diào)控著破骨細(xì)胞活動(dòng),促使溶骨作用增強(qiáng),骨吸收活動(dòng)呈現(xiàn)高活躍狀態(tài)[3]。研究表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)的發(fā)病與骨重建活動(dòng)中骨轉(zhuǎn)換率升高密切相關(guān),而核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)-核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)調(diào)控破骨因子使其在溶骨效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]。成骨細(xì)胞所表達(dá)的RANKL與其受體RANK相結(jié)合,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的成熟分化[5]。RANKL/RANK信號(hào)失調(diào)將導(dǎo)致破骨活動(dòng)增強(qiáng),影響骨代謝[5]。因此阻斷RANKL/RANK信號(hào)通路抑制破骨因子過度活躍,改善骨耦聯(lián)代謝失衡是防治PMOP的重要舉措。

中醫(yī)認(rèn)為PMOP病機(jī)主要為腎虛,壯骨止痛方由7味補(bǔ)腎中藥構(gòu)成,課題組前期實(shí)驗(yàn)研究及醫(yī)院治療中的使用過程證實(shí)壯骨止痛方具有促進(jìn)成骨分化、促進(jìn)骨形成、增加骨密度的療效,對(duì)于防治PMOP具有顯著作用[6]。但壯骨止痛方通過調(diào)控破骨細(xì)胞活動(dòng)發(fā)揮抗PMOP的具體機(jī)制尚不明確,因此本研究的目的是研究壯骨止痛方對(duì)去勢大鼠骨組織破骨因子血清水平和蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)一步探索壯骨止痛方調(diào)控CTSK、RANK、TRAP等破骨因子干預(yù)PMOP的部分具體療效機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物:SPF級(jí)3月齡體質(zhì)量220～280 g雌性SD大鼠40只,授權(quán)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心向湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購買,放置在湖南中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng),飼養(yǎng)中心許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0009,動(dòng)物批號(hào):SCXK(湘)2019-0004,采用普通飼料喂養(yǎng),飼料由動(dòng)物中心統(tǒng)一購置,環(huán)境溫度18～24 ℃,濕度40 %～60 %,模擬12 h晝/夜循環(huán)照明,分籠飼養(yǎng)。保持籠舍潔凈,及時(shí)換新潔凈墊料,大鼠可以在籠舍內(nèi)自由活動(dòng)、攝取食物、飲水。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作流程符合動(dòng)物倫理的要求,獲動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理編號(hào):LL202205250。

1.1.2主要儀器:珀金埃爾默股份有限公司Quantum GX型小動(dòng)物顯微CT(美國);Rayto,RT-6100型多功能酶標(biāo)儀;盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(中國 上海);賽默飛世爾科技有限公司HM325型石蠟切片機(jī);麥克奧迪電氣股份有限公司BA410E 型顯微鏡。

1.1.3主要藥品及試劑:壯骨止痛方由枸杞子、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、女貞子、懷牛膝、補(bǔ)骨脂、狗脊7味中藥構(gòu)成,上述所有中藥在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房購買;拜耳醫(yī)藥保健有限公司規(guī)格為1 mg/片 戊酸雌二醇,批號(hào):J20171038;戊巴比妥鈉,批號(hào):20200422產(chǎn)自美國默克公司;青霉素鈉,批號(hào):F9102109由華北制藥股份有限公司生產(chǎn);RANKL ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):20221101-30267A)E2ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):202201101-30432A)。EDTA慢速脫鈣液 (Servicebio);兔抗大鼠抗體RANK (Immunoway YT5881);兔抗大鼠抗體TRAP (愛博泰克A0962);兔抗大鼠抗體CTSK(愛博泰克A5871);電鏡固定液(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào):G1102)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型建立:40只SD大鼠按照完全隨機(jī)原則,分為ZGZTF組、EV組、OVX組、SHAM組,每組10只。各組均采用國內(nèi)外常用造模方法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型[7],SHAM組摘除同等體積脂肪?，F(xiàn)配2 %戊巴比妥鈉溶液,按照0.4 mL/100 g對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射。將麻醉好的大鼠固定于鼠板,摘除雙側(cè)卵巢后進(jìn)行縫合,碘伏消毒傷口防治大鼠互相撕咬,造模后3 d為防術(shù)后感染從大鼠后腿注射4萬U青霉素。

1.2.2藥品制備:將所有中藥放入煎藥灌中浸泡1 h,武火煮沸后改文火繼續(xù)煎煮1 h,將煎煮所得藥液倒出,加入與第一次煎煮同等體積蒸餾水繼續(xù)煎煮1 h,將兩次所得藥液攪拌混合,所得混合液按照生藥含量6.6 g/kg 濃縮,待中藥藥液冷卻后放入冰箱冷藏。

1.2.3給藥方法:手術(shù)1周后給予藥物灌胃,1次/d,連續(xù)給藥12周。ZGZTF組灌胃6.6 g/kg生藥量的中藥藥液,EV組灌胃劑量體表面積換算公式按照絕經(jīng)后女性體重水平來確定(成人劑量×60 kg×0.018/0.2 kg),余下各組灌胃相應(yīng)體積的蒸餾水。

1.2.4Mirco-CT檢測股骨骨微結(jié)構(gòu)和骨密度:每組隨機(jī)選取3個(gè)樣本,剔除右側(cè)股骨表面多余結(jié)締組織后應(yīng)用顯微CT從生長版最高點(diǎn)以下1 mm位置往下數(shù)50層的骨小梁進(jìn)行平掃。掃描模式為:掃描電壓90 kV,掃描電流為88 μA,360 °旋轉(zhuǎn)掃描,掃描持續(xù)14 min,分辨模式為90 u,掃描結(jié)果采用Analyze12.0分析。

1.2.5HE檢測骨組織病理形態(tài):取左側(cè)脛骨,置于4 %多聚甲醛中浸泡1周,在EDTA脫鈣液中浸泡2個(gè)月,每4～6天更換脫鈣液。經(jīng)脫水、包埋、切片、封片、染色后用顯微鏡觀察骨小梁結(jié)構(gòu)。

1.2.6掃描電鏡檢測骨組織骨小梁超微結(jié)構(gòu):將大鼠左側(cè)脛骨的肌肉組織剔除,保留完整脛骨組織和骨膜,用濃度為 0.1 %的磷酸緩沖液對(duì)脛骨進(jìn)行清洗,采用2.5 %戊二醛溶液固定,隨后用叔丁醇梯度脫水,置于-10 ℃冰凍,干燥。導(dǎo)電膠固定標(biāo)本后將金屬材料噴涂于骨組織表面,使用掃描電子顯微鏡觀察孔隙內(nèi)骨組織及纖維組織生長情況。

1.2.7ELISA檢測血清E2、RANKL水平:終末取材時(shí),按照0.4 mL/100 g的劑量給各組大鼠注射2 %戊巴比妥鈉麻醉,注射方式為腹腔注射,腹主動(dòng)脈采血,靜置2 h,3 000 r/min離心15 min后分離血清,采用雙抗夾心技術(shù)對(duì)大鼠血清中E2、RANKL水平進(jìn)行測定,用酶標(biāo)儀測定各組在450 nm波長時(shí)的吸光值,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.8免疫組化檢測RANK、TRAP、CTSK蛋白表達(dá):取左側(cè)脛骨,置于4 %多聚甲醛中浸泡1周,在EDTA脫鈣液中浸泡2個(gè)月,每4～6天更換脫鈣液。經(jīng)過脫水、透明、切片后,滴加一抗進(jìn)行孵育,室溫過夜。PBS清洗3次,滴加二抗,室溫中靜置1 h,顯色后終止反應(yīng),顯微鏡下觀察切片視野,采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析處理軟件對(duì)RANK、TRAP、CTSK蛋白的IOD進(jìn)行比較分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 壯骨止痛方對(duì)大鼠骨微結(jié)構(gòu)和骨密度的影響

與SHAM組相比,OVX組股骨骨密度值顯著下降,骨質(zhì)流失嚴(yán)重,差異具有顯著性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OVX組相比,給藥后ZGZTF組股骨骨密度增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組大鼠骨組織骨密度差異

注:與SHAM組相比,#P<0.05。

2.2 壯骨止痛方對(duì)大鼠骨組織病理形態(tài)改變的影響

顯微鏡下,SHAM組脛骨骨小梁排列整齊,連續(xù)性好,鏡下可見大量骨細(xì)胞。與SHAM組比較,箭頭所指處可明顯看到OVX組脛骨骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂,連續(xù)性中斷,骨髓腔變寬,骨小梁間隔變大,結(jié)構(gòu)嚴(yán)重缺失,鏡下可見骨髓腔內(nèi)有大量脂肪空泡。與OVX組相比,ZGZTF組脛骨骨組織形態(tài)有不同程度的改善,骨小梁增多,連續(xù)性稍恢復(fù),骨髓腔減小,脂肪空泡減少。

2.3 壯骨止痛方對(duì)大鼠骨小梁超微結(jié)構(gòu)的影響

SHAM組大鼠脛骨骨小梁數(shù)目較多,骨小梁表面膠原纖維排列緊密,骨小梁壁厚且均勻,形態(tài)大小對(duì)稱,連接性好,形成立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OVX組大鼠脛骨骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞,骨小梁數(shù)目減少,間距增大,骨小梁變細(xì)且厚薄不均。小梁表面骨膠原纖維排列紊亂,粗細(xì)不均。與OVX組相比,ZGZTF組脛骨骨小梁數(shù)目增多,立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有所改善,但與SHAM組比較骨小梁數(shù)目仍然較少,間距仍然較大。

圖3 各組大鼠骨組織骨小梁病理形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果(100×)

圖4 各組大鼠骨組織電鏡掃描圖(100×)

2.4 壯骨止痛方對(duì)大鼠血清E2、RANKL水平的影響

與SHAM組相比,OVX組血清中E2顯著下降,RANKL水平顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與OVX相比,ZGZTF組血清中E2水平升高,RANKL水平降低(P<0.05)。ZGZTF組血清E2和RANKL表達(dá)水平與SHAM組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ZGZTF組和EV組血清中E2、RANKL水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 壯骨止痛方對(duì)去勢大鼠血清E2、RANKL影響的比較

注:與SHAM組比較,#P<0.01;與OVX組比較,&P<0.01。

2.5 壯骨止痛方對(duì)大鼠脛骨RANK、TRAP、CTSK蛋白表達(dá)的影響

與SHAM組比較,OVX組脛骨骨組織中RANK、TRAP、CTSK蛋白表達(dá)顯著上升,表達(dá)較高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與OVX組相比,ZGZTF組脛骨骨組織中RANK、TRAP、CTSK蛋白表達(dá)明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ZGZTF組和EV組陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6、圖7。

注:與SHAM組比較,#P<0.05;與OVX組比較,&P<0.05。

3 討論

中國作為人口老齡化大國,OP的高發(fā)病率和高骨折率對(duì)社會(huì)造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān),導(dǎo)致了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8]。研究表明我國OP的總患病率為6.6 %～19.3 %[9],第七次全國人口普查數(shù)據(jù)顯示我國50歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率為19.2 %,其中女性為 32.1 %[10]。中醫(yī)學(xué)無OP病名,根據(jù)臨床表現(xiàn)認(rèn)為其屬于“骨痿、骨痹”范疇,腎主骨生髓,在骨生長發(fā)育中起重要作用[11],傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為OP主要發(fā)病病機(jī)是腎精不足骨髓失于濡養(yǎng)[12]。

壯骨止痛方是莫新民教授創(chuàng)制的經(jīng)驗(yàn)方,于2005年獲得國家新藥證書,該方由7味補(bǔ)肝益腎中藥構(gòu)成,方中補(bǔ)骨脂歸腎脾兩經(jīng),有溫腎陽補(bǔ)脾陽之功效,是為君藥。臣以淫羊藿益筋骨補(bǔ)命門,使筋骨自堅(jiān)時(shí)亦可助君藥補(bǔ)腎[13]。補(bǔ)骨脂和淫羊藿配伍歸入肝經(jīng)、腎經(jīng),發(fā)揮壯骨補(bǔ)腎強(qiáng)腰膝的作用,治療腎陽不足肝腎虧損[14]。牛膝和骨碎補(bǔ)逐瘀通經(jīng)、通經(jīng)活絡(luò),使補(bǔ)中寓通,補(bǔ)而不滯,枸杞女貞補(bǔ)肝腎陰精,陰中求陽,諸藥配伍陰陽肝腎并補(bǔ),治療PMOP[15]。補(bǔ)骨脂發(fā)揮雌激素樣作用逆轉(zhuǎn)骨組織Leptin啟動(dòng)子高甲基化,從而抑制破骨基因的表達(dá)[16]。淫羊藿的主要化學(xué)成分之一是黃酮類化合物,在治療PMOP中它可以發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞活動(dòng),促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的作用[17]。研究表明骨碎補(bǔ)可能通過作用于氧分壓感傳信號(hào)通路上關(guān)鍵靶點(diǎn)HIF1ɑ抑制破骨細(xì)胞活動(dòng)[18]。李曉曦等[19]研究發(fā)現(xiàn)女貞子與淫羊藿的配伍組合可以上調(diào)TGF-β1/Smad信號(hào)通路骨保護(hù)性相關(guān)蛋白起到抗OP的作用。

本研究中采用手術(shù)去卵巢方法構(gòu)建PMOP的病理模型,骨質(zhì)流失和骨小梁結(jié)構(gòu)的改變均證實(shí)PMOP病理模型構(gòu)建成功[20]。給予壯骨止痛方干預(yù)之后,去勢大鼠骨微結(jié)構(gòu)改善,表明壯骨止痛方可以抑制破骨細(xì)胞關(guān)鍵因子從而調(diào)控骨代謝。

破骨細(xì)胞主要受到細(xì)胞因子RANKL的調(diào)節(jié),RANKL對(duì)于維持骨穩(wěn)態(tài)具有關(guān)鍵作用,在骨質(zhì)疏松病理性骨吸收中發(fā)揮核心作用[21]。調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和功能一直是防治PMOP的熱門話題。RANKL和RANK結(jié)合后募集TRAF-6激活下游MAPK和NF-κB信號(hào)通路,活化NFATc1,NFATc1等轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)破骨基因表達(dá)[22]。而MAPK信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控組織蛋白酶K吸收骨基質(zhì)降解骨,促進(jìn)骨吸收[23]。MAPK信號(hào)通路上調(diào)后可激活NF-κB信號(hào)通路影響骨吸收,此外細(xì)胞因子及誘導(dǎo)物刺激NF-κB后可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥介質(zhì)的表達(dá),從而調(diào)控骨吸收活動(dòng)[24]。另外RANKL和RANK結(jié)合還會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分泌CTSK和基質(zhì)金屬蛋白酶及TRAP等破骨特異性因子[25]。

CTSK是破骨細(xì)胞中溶骨性最強(qiáng)的關(guān)鍵酶,其變異或過表達(dá)是會(huì)增加PMOP的發(fā)病率及骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[26],因此抑制CTSK的表達(dá)在一定程度上可以起到骨保護(hù)的作用。TRAP是酸性磷酸酶同功酶中的第5型,作為特異性標(biāo)志酶,在一定程度上可以檢驗(yàn)破骨細(xì)胞分化成熟與否,可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞對(duì)骨基質(zhì)的吸收[24]。TRAP可以通過水解破骨細(xì)胞的磷酸醋酶起到破壞細(xì)胞基質(zhì)的作用[27],TRAP的表達(dá)異常會(huì)影響骨重建平衡。研究表明淫羊藿可以抑制CTSK降解骨質(zhì)的活性[28],而補(bǔ)骨脂可以競爭性結(jié)合CTSK的活性位點(diǎn)降低CTSK于膠原端肽區(qū)相互作用[29]。補(bǔ)骨脂亦可發(fā)揮雌激素樣作用,抑制TRAP降解骨基質(zhì)固體鈣磷化合物,抑制骨陷窩形成從而降低破骨細(xì)胞溶骨活性[30]。

本研究探明壯骨止痛方對(duì)破骨細(xì)胞活動(dòng)影響的部分機(jī)制,RANKL/RANK信號(hào)通路在破骨細(xì)胞及骨吸收活動(dòng)中起激動(dòng)作用,激活RANKL/RANK通路后,CTSK、TRAP作為下游重要因子可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化增殖。而壯骨止痛方可以抑制RANKL/RANK激活下游MAPK、NF-κB信號(hào)通路的作用,減少RANKL/RANK通路上破骨因子蛋白陽性表達(dá),使骨重建失衡得到一定程度的恢復(fù),起到治療PMOP的作用。但本研究具有一定的局限性,僅進(jìn)行了體內(nèi)研究,壯骨止痛方調(diào)控PMOP破骨活動(dòng)具體機(jī)制復(fù)雜,未來研究中將結(jié)合體外實(shí)驗(yàn),深入驗(yàn)證壯骨止痛方的作用機(jī)制。