小檗堿調(diào)節(jié)AMPK/NF-κB信號(hào)通路對(duì)自身免疫性前列腺炎大鼠Th17/Treg平衡的影響

繆瑞宇，王碧，龍宗敏

前列腺炎是成年男性泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的炎癥性疾病，而自身免疫性前列腺炎（experimental autoimmune prostatitis，EAP）是由于自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的慢性前列腺疾病，主要臨床表現(xiàn)為排尿異常、盆腔區(qū)疼痛或不適等癥狀［1］。EAP 影響因素眾多，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確［2］。輔助性T 細(xì)胞17（T helper 17，Th17）/調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的動(dòng)態(tài)平衡是維持免疫穩(wěn)定的重要機(jī)制，與炎癥、腫瘤及自身免疫疾病密切相關(guān)。研究顯示，Th17/Treg失衡參與自身免疫性前列腺炎的發(fā)病，是治療自身免疫性前列腺炎的重要靶點(diǎn)［3］。小檗堿，也稱為黃連素，是從中藥黃連中提取出的一種生物堿，具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用，在高血壓、糖尿病、心律失常等多種疾病的治療中發(fā)揮重要作用［4］。有研究表明，小檗堿可通過(guò)多靶點(diǎn)代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)改善非細(xì)菌性前列腺炎［5］。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monphate activated protein kinas，AMPK）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是與炎癥相關(guān)的重要信號(hào)通路，在骨關(guān)節(jié)炎、哮喘等多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［6］。有研究表明，小檗堿通過(guò)AMPK/NF-κB 途徑調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有顯著的治療效果［7］。此外，AMPK 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡的重要通路之一［8］。但小檗堿調(diào)節(jié)AMPK/NF-κB信號(hào)通路對(duì)EAP 大鼠的影響尚不完全清楚。因此，本研究旨在探討小檗堿調(diào)節(jié)AMPK/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)EAP大鼠Th17/Treg平衡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量210～250 g，購(gòu)自導(dǎo)科醫(yī)藥技術(shù)（廣東）有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2022-0060。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2021-0004。喂養(yǎng)環(huán)境：12 h 光/暗循環(huán)、溫度22～26 ℃、濕度55%～65%，自由攝食和進(jìn)水。本實(shí)驗(yàn)獲得遵義醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（IACUC號(hào)：202103008）。于實(shí)驗(yàn)前1周對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器 完全弗氏佐劑（貨號(hào)：F5881）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；百白破疫苗（貨號(hào)：210415）購(gòu)自昆明市五華區(qū)衛(wèi)生防疫站；小檗堿（純度：HPLC≥98%，貨號(hào)：B21379）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；AMPK 抑制劑compound C（貨號(hào)：UE171260）購(gòu)自香港吉斯恩貝國(guó)際貿(mào)易有限公司；通用SP 免疫組織化學(xué)試劑盒（貨號(hào)：SP0041）、大鼠白細(xì)胞介素（IL）-17 的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（貨號(hào)：SEKR-0007）、大鼠IL-10 的ELISA 試劑盒（貨號(hào)：SEKR-0006）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔源抗大鼠一抗視黃酸相關(guān)核孤兒受體γt（RORγt，貨號(hào)：ab219501）、叉頭蛋白3（forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3，貨號(hào)：ab215206）、AMPK（貨號(hào)：ab32047）、p-AMPK（貨號(hào)：ab133448）、NF-κB p65（貨號(hào)：ab19870）、p-NFκB p65（貨號(hào)：ab76302）、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα，貨號(hào)：ab32518）、甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，貨號(hào)：ab8245）以及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（貨號(hào)：ab288151）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。DSX100 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；Synergy H4 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek 公司）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton-Dickinson公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 EAP 大鼠模型的構(gòu)建及分組給藥 采用大鼠盆腔區(qū)域及雙側(cè)肩胛皮下多點(diǎn)注射完全弗式佐劑與前列腺組織混合懸液的方法［9］構(gòu)建EAP大鼠模型：取SD大鼠，使用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，頸椎脫臼處死，取前列腺組織進(jìn)行冰浴下研磨，制成懸液，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）稀釋為60 g/L的大鼠前列腺蛋白提純液，與弗式完全佐劑以1∶1比例充分混合研磨，使其形成油包水狀態(tài)，于大鼠盆腔區(qū)域皮下和雙側(cè)肩胛皮下多點(diǎn)注射，同時(shí)腹腔注射百白破疫苗，分別在第0、7、14、28天進(jìn)行4次注射。采用Von-Frey測(cè)痛纖維按照不同重量依次刺激大鼠的骨盆區(qū)域，如果大鼠出現(xiàn)腹部急劇收縮，跳躍，立即舔或刮擦細(xì)絲刺激的區(qū)域等表現(xiàn)，提示EAP大鼠模型構(gòu)建成功。

采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的75只EAP大鼠分為模型組、小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、抑制劑組，每組15 只，另選15 只正常大鼠，同時(shí)同部位注射等量的生理鹽水作為對(duì)照組。小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組［10］、陽(yáng)性對(duì)照組［11］分別灌胃25 mg/kg、50 mg/kg 小檗堿和40 mg/kg 陽(yáng)性藥物塞來(lái)昔布溶液，抑制劑組［12］灌胃50 mg/kg小檗堿及0.2 mg/kg AMPK抑制劑compound C，對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，每天給藥1次，持續(xù)4周。

1.3.2 標(biāo)本采集 末次給藥結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，其中一半血液靜置后以3 000×g離心10 min 得血清，置于-80 ℃保存；麻醉大鼠后脫頸椎處死，取出前列腺組織，修剪脂肪及包膜，每組取5只大鼠的前列腺組織儲(chǔ)存于-80 ℃，每組取10只大鼠的前列腺組織固定于4%多聚甲醛中。

1.3.3 HE 染色觀察各組大鼠前列腺情況 每組取5 只固定在4%多聚甲醛24 h后的大鼠前列腺組織，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度4 μm）。HE染色后，于光學(xué)顯微鏡下觀察前列腺組織變化。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠前列腺組織中RORγt、Foxp3 的表達(dá) 每組取5 只固定在4%多聚甲醛的大鼠前列腺組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片（厚度4 μm），將切片經(jīng)二甲苯脫蠟及乙醇水化后，置于微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)10 min，山羊血清封閉30 min 后，加入RORγt、Foxp3 抗體（稀釋比例1∶100）在4 ℃下孵育過(guò)夜，次日加入適量生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，DAB顯色，漂洗后蘇木精復(fù)染，脫水后中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察RORγt、Foxp3陽(yáng)性表達(dá)情況并拍照記錄。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)棕黃/褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)讀取5 個(gè)不重復(fù)視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算蛋白陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度（integrated optical density，IOD）值對(duì)RORγt、Foxp3陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行量化。

1.3.5 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中IL-17、IL-10水平 取各組大鼠血清，按照IL-17、IL-10 的ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)大鼠血清中IL-17、IL-10水平。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠外周血中Th17/Treg 細(xì)胞比值 取各組大鼠外周靜脈血，加入紅細(xì)胞裂解液，冰浴后離心，收集細(xì)胞沉淀，PBS 洗滌后重懸并計(jì)數(shù)，取約含有1×106個(gè)細(xì)胞的懸浮液，加入大鼠PE-TGF-β、FITC-IL-17 單克隆抗體，避光孵育20 min，離心，洗滌，加入預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，混勻后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、Treg 細(xì)胞百分比，并計(jì)算比值。

1.3.7 Western blot 檢測(cè)前列腺組織AMPK、NF-κB p65 及其磷酸化蛋白的表達(dá) 取-80 ℃保存的前列腺組織（100 mg），用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，將總蛋白（30 μg）通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，將膜與一抗AMPK（1∶1 000）、p-AMPK（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、p-NF-κB p65（1∶500）、IκBα（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）于4 ℃下孵育過(guò)夜，然后將膜暴露于HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000）中1 h。加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡。以GAPDH 為內(nèi)參，使用Image LabTM軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠前列腺情況比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠前列腺組織部分腺腔結(jié)構(gòu)萎縮、損毀，間質(zhì)水腫，纖維組織增生明顯，腺泡上皮變扁平，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠前列腺組織腔內(nèi)有粉色分泌物，腺上皮細(xì)胞輕度增生，排列整齊，間質(zhì)炎性細(xì)胞少量分布，炎癥明顯消退；與小檗堿高劑量組比較，抑制劑組大鼠前列腺組織腺上皮細(xì)胞明顯增生，間質(zhì)炎性細(xì)胞分布較多，見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠前列腺組織中RORγt、Foxp3 表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠前列腺組織中RORγt 表達(dá)水平升高，F(xiàn)oxp3 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，小檗堿低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠前列腺組織中RORγt表達(dá)水平降低，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與小檗堿高劑量組比較，抑制劑組大鼠前列腺組織中RORγt 表達(dá)水平升高，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表1，圖2、3。

Tab.1 Comparison of positive expression levels of RORγt and Foxp3 in rat prostate tissue between the six groups表1 各組大鼠前列腺中RORγt、Foxp3陽(yáng)性表達(dá)水平比較（n=5，IOD，）

Tab.1 Comparison of positive expression levels of RORγt and Foxp3 in rat prostate tissue between the six groups表1 各組大鼠前列腺中RORγt、Foxp3陽(yáng)性表達(dá)水平比較（n=5，IOD，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與小檗堿低劑量組比較，d與小檗堿高劑量組比較，P＜0.05。

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Fig.2 Expression of RORγt in prostate of rats detected by immunohistochemistry satining in each group(×200)圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組大鼠前列腺中RORγt的表達(dá)（×200）

Fig.3 Expression of Foxp3 in prostate of rats detected by immunohistochemistry satining in each group(×200)圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組大鼠前列腺中Foxp3的表達(dá)（×200）

2.3 各組大鼠血清IL-17、IL-10水平比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中IL-17 水平升高，IL-10水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，小檗堿低、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清IL-17 水平降低，IL-10水平升高（P＜0.05）；與小檗堿高劑量組比較，抑制劑組大鼠血清IL-17水平升高，IL-10水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of IL-17 and IL-10 between the six groups表2 各組大鼠血清中IL-17、IL-10水平比較（n=15，ng/L，）

Tab.2 Comparison of serum levels of IL-17 and IL-10 between the six groups表2 各組大鼠血清中IL-17、IL-10水平比較（n=15，ng/L，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與小檗堿低劑量組比較，d與小檗堿高劑量組比較，P＜0.05。

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2.4 各組大鼠外周血Th17/Treg 平衡比較 與對(duì)照組（2.91±0.17）比較，模型組（12.65±1.04）外周血Th17/Treg 比值明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，小檗堿低（8.43±0.48）、高劑量組（3.36±0.36）和陽(yáng)性對(duì)照組（3.13±0.29）外周血Th17/Treg 比值明顯降低（P＜0.05）；與小檗堿高劑量組比較，抑制劑組（6.54±0.35）Th17/Treg 比值顯著升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=804.963，P＜0.05），見(jiàn)圖4。

Fig.4 Th17/Treg balance in peripheral blood of rats in each group圖4 各組大鼠外周血Th17/Treg平衡情況

2.5 各組大鼠前列腺組織中AMPK/NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比較，模型組大鼠前列腺組織中p-AMPK/AMPK、IκBα表達(dá)水平降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，小檗堿低劑量組、小檗堿高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠前列腺組織中p-AMPK/AMPK、IκBα表達(dá)水平升高，p-NF-κB p65/NF-κB p65 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與小檗堿高劑量組比較，抑制劑組大鼠前列腺組織中p-AMPK/AMPK、IκBα 表達(dá)水平降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65 表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表3。

Tab.3 Comparison of expressions of AMPK/NF-κB pathway related proteins in prostate tissue of rats between the six groups表3 各組大鼠前列腺組織中AMPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=5，）

Tab.3 Comparison of expressions of AMPK/NF-κB pathway related proteins in prostate tissue of rats between the six groups表3 各組大鼠前列腺組織中AMPK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與模型組比較，c與小檗堿低劑量組比較，d與小檗堿高劑量組比較，P＜0.05。

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Fig.5 Expression of AMPK/NF-κB pathway related proteins in rat prostate tissue detected by Western blot analysis圖5 Western blot檢測(cè)大鼠前列腺組織中AMPK/NF-кB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

EAP 是自身免疫性疾病，CD4+T 細(xì)胞可誘發(fā)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，影響自身反應(yīng)性T細(xì)胞，進(jìn)而誘發(fā)自身免疫炎癥反應(yīng)［13］。Th17 細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞受自身限制而分化的輔助性T 細(xì)胞，Treg 細(xì)胞是CD4+T 分化產(chǎn)生的具有免疫抑制作用的細(xì)胞，Th17 和Treg 細(xì)胞的平衡在疾病狀態(tài)時(shí)被打破［14］。本研究采用盆腔區(qū)域及雙側(cè)肩胛皮下多點(diǎn)注射完全弗式佐劑與前列腺組織混合懸液構(gòu)建EAP 大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型大鼠前列腺組織部分腺腔結(jié)構(gòu)萎縮、損毀，間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，外周血Th17/Treg 比值明顯升高，提示EAP 模型構(gòu)建成功。RORγt是參與Th17細(xì)胞分化過(guò)的重要啟動(dòng)因子，其對(duì)產(chǎn)生IL-17具有直接啟動(dòng)作用［15］；而Foxp3是Treg細(xì)胞標(biāo)志物，其可通過(guò)轉(zhuǎn)錄效應(yīng)促進(jìn)基因突變從而參與自身免疫反應(yīng)［16］。有文獻(xiàn)報(bào)道，恢復(fù)Th17/Treg的平衡可減緩自身免疫性前列腺炎的進(jìn)展［3］。本研究中模型大鼠前列腺組織RORγt 表達(dá)和血清IL-17水平升高，前列腺組織Foxp3表達(dá)和血清IL-10水平降低，提示EAP模型大鼠存在Th17/Treg失衡現(xiàn)象。

小檗堿是黃連的主要活性成分，在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用［17］。研究表明，小檗堿通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的ERK1/2 活化來(lái)抑制棕櫚酸或脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［18］；小檗堿對(duì)結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎大鼠的牙槽骨丟失和炎癥亦有明顯的抑制作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿處理后EAP 大鼠前列腺組織腺上皮細(xì)胞排列整齊，炎癥明顯消退，可降低RORγt 和IL-17 表達(dá)以及外周血Th17/Treg 比值，同時(shí)升高Foxp3 和IL-10 表達(dá)水平，提示小檗堿可促進(jìn)EAP大鼠的Th17/Treg平衡。

AMPK 是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，NFκB與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答密切相關(guān)，AMPK/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)骨關(guān)節(jié)炎［20］、佐劑性關(guān)節(jié)炎［21］、肝脂肪變性［22］等多種疾病具有重要調(diào)控作用。有研究表明，小檗堿可通過(guò)激活A(yù)MPK，抑制NF-κB的磷酸化活化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎表型M2 型極化，并誘導(dǎo)Th17/Treg細(xì)胞平衡，對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠發(fā)揮保護(hù)作用［7］。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠前列腺組織中p-NF-κB p65/NF-κB p65 表達(dá)水平升高，p-AMPK/AMPK、IκBα 表達(dá)水平降低，提示AMPK/NFκB 通路可能參與調(diào)節(jié)EAP 大鼠的Th17/Treg 平衡。給予小檗堿干預(yù)后，大鼠前列腺組織中p-NF-κB p65/NF-κB p65 表達(dá)水平降低，p-AMPK/AMPK、IκBα 表達(dá)水平升高，推測(cè)小檗堿可能通過(guò)激活A(yù)MPK 促進(jìn)EAP 大鼠Th17/Treg 趨于平衡。為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究利用AMPK 抑制劑compound C 進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與小檗堿高劑量組比較，抑制劑組大鼠前列腺組織中腺上皮細(xì)胞明顯增生，間質(zhì)炎性細(xì)胞分布較多，血清IL-17水平、外周血Th17/Treg比值、前列腺組織RORγt 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 表達(dá)水平明顯升高，血清IL-10 水平、前列腺組織Foxp3、p-AMPK/AMPK 和IκBα 表達(dá)水平降低，提示抑制AMPK 活化可減弱小檗堿對(duì)EAP 大鼠Th17/Treg 平衡的促進(jìn)作用，證實(shí)小檗堿可通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/NF-κB通路促進(jìn)EAP大鼠Th17/Treg平衡。

綜上所述，小檗堿可通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)EAP大鼠Th17/Treg平衡。然而，小檗堿調(diào)控EAP 大鼠前列腺組織Th17/Treg 平衡涉及的通路較多，有待后續(xù)進(jìn)一步深入探究。