肺炎支原體社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素對單核細(xì)胞亞群的影響

張岑，王志華，楊磊

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的重要病原體之一，可引起氣管、支氣管炎，10%～40% 的支原體感染患者最終會發(fā)展為肺炎［1-2］。 目前MP 肺炎（Mycoplasma pneumoniaepneumonia，MPP）致病機(jī)制尚不明確，肺炎支原體社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征（community-acquired respiratory distress syndrome，CARDS）毒素是MP 已知唯一分泌的外毒素，除具有ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性與胞質(zhì)空泡化特性外，還能調(diào)控NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎癥小體活性［3］。CARDS毒素在MP侵入及致病過程中發(fā)揮重要作用，與感染的病程長短及呼吸道炎癥反應(yīng)、疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)［4］。單核細(xì)胞是構(gòu)成天然免疫的重要組成部分，其數(shù)量及不同亞型比例的變化與機(jī)體炎癥或其他疾病狀態(tài)密切相關(guān)。根據(jù)小鼠淋巴細(xì)胞抗原6C（lynphocyte antigen 6C，Ly6C）是否表達(dá)分為2 個(gè)單核細(xì)胞群體，即Ly6C+炎性單核細(xì)胞和Ly6C-循環(huán)性單核細(xì)胞，Ly6C+單核細(xì)胞具有促炎和抗菌功能［5］。本課題組既往研究表明，MPP 患者外周血CD16+單核細(xì)胞比例明顯升高［6］。但目前肺炎支原體CARDS毒素對單核細(xì)胞亞群影響的相關(guān)研究較少。本研究通過肺炎支原體CARDS毒素誘導(dǎo)小鼠模型，觀察小鼠外周血單核細(xì)胞亞群Ly6C+、Ly6C-水平，探討CARDS毒素誘導(dǎo)肺損傷的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 32 只6～8 周齡SPF 級C57BL/6 野生型小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量16～18 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。均于SPF 級動物房中飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，給足水分和飼料，喂養(yǎng)1～2 d。本研究通過天津市南開醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部倫理委員會審批，符合動物實(shí)驗(yàn)倫理要求，批準(zhǔn)編號：NKYY-DWLL-2021-103。

1.2 主要試劑與儀器 白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；Trizol試劑和cDNA合成試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；抗小鼠CD11b-FITC、Ly6C-APC和Ly6G-PE流式抗體購自美國Biolegend公司；CARDS過表達(dá)pET28α載體購自漢恒生物科技（上海）有限公司；PCR 擴(kuò)增儀、7500 實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 重組CARDS 毒素制備 按照文獻(xiàn)［7］的方法制備重組CARDS 毒素。將CARDS 毒素基因克隆入pET28α 載體，經(jīng)8次點(diǎn)突變獲得pET28α-CARDS 毒素重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳螯合親和層析技術(shù)純化出變性CARDS 毒素蛋白，利用尿素梯度復(fù)性法和擴(kuò)大體積透析法對蛋白復(fù)性后進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只小鼠分為模型組和正常對照組，每組16 只。模型組小鼠用異氟烷麻醉后，氣管注射40 μL 含有50 μg CARDS 毒素的PBS，誘導(dǎo)小鼠支原體肺炎［8］；正常對照組接種同等劑量的PBS。接種后觀察小鼠的呼吸、進(jìn)食、體質(zhì)量、活動情況。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞亞群變化 造模后24 h，2組各取5只小鼠進(jìn)行麻醉，腹主動脈采血加入EDTA抗凝管中，取新鮮血100 μL，加入0.25 μg抗小鼠的CD11b-FITC、Ly6CAPC 和Ly6G-PE 流式抗體混勻，室溫避光孵育15 min；加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后避光靜置10 min，加入1 mL PBS 清洗1 遍，離心后用100 μL 的PBS 重新懸浮細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀檢測外周血單核細(xì)胞亞群比例變化。

1.6 肺組織病理觀察 2 組各取5 只小鼠，取血后安樂死處死。用5 mL PBS 經(jīng)肺動脈沖洗肺循環(huán)后取肺。在無菌環(huán)境下取出新鮮的小鼠肺組織，使用生理鹽水沖洗表面血污，濾紙擦干表面水分，取1 個(gè)肺葉用10%多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，進(jìn)行肺組織損傷評分［9］，剩余肺組織放入液氮中凍存。

1.7 Real-time PCR 檢測肺組織中IL-1β、IL-18 水平 2 組各取3 只小鼠。Trizol 法提取小鼠肺組織RNA，按照試劑盒說明書，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取反轉(zhuǎn)錄后cDNA作為模板，使用SYBR Green Master 進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)體系為cDNA 和上游下引物各1 μL、PCR Mix10 μL和無酶水7 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法計(jì)算。引物序列見表1。

Tab.1 The primer sequence of PCR表1 PCR引物序列

1.8 ELISA檢測血清中IL-1β和IL-18水平 造模24 h后，2組各取3 只小鼠，采集其外周血，離心后回收上清液，按照ELISA試劑盒說明檢測各組外周血中IL-1β和IL-18水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠外周血單核細(xì)胞亞群比較 模型組較正常對照組的小鼠單核細(xì)胞CD11b+Ly6G-Ly6C+比例升高（47.30±5.54vs. 36.87±3.38，n=5，t=3.591，P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Proportion of CD11b+Ly6G-Ly6C+monocyte subsets in peripheral blood of mice圖1 小鼠外周血CD11b+Ly6G-Ly6C+單核細(xì)胞亞群的比例

2.2 小鼠肺組織病理學(xué)變化 HE染色可見正常對照組小鼠肺組織形態(tài)正常，未見肺泡壁增厚和炎性細(xì)胞的浸潤。模型組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)融合、塌陷、數(shù)目減少，毛細(xì)血管充血或出血，肺間質(zhì)水腫，肺組織周圍存在大量炎性細(xì)胞浸潤，見圖2。模型組肺組織損傷評分（9.00±0.71）高于正常對照組（3.00±0.71，n=5，t=13.416，P＜0.01）。

Fig.2 Pathological findings of lung tissue(HE staining,×200)圖2 肺組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE染色，×200）

2.3 肺炎支原體CARDS 毒素對肺組織和血清中IL-1β 和IL-18 表達(dá)的影響 模型組小鼠肺組織和血清IL-1β 和IL-18 表達(dá)水平較正常對照組增高（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β and IL-18 in lung tissue and serum between two groups表2 2組肺組織和血清IL-1β、IL-18表達(dá)水平比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β and IL-18 in lung tissue and serum between two groups表2 2組肺組織和血清IL-1β、IL-18表達(dá)水平比較（n=3，）

＊＊P＜0.01。

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3 討論

MPP 在所有人群中普遍易感，其中對老年人及免疫力低下人群危害更為嚴(yán)重。目前重癥及難治性MPP病例明顯增多［10］，部分患者甚至出現(xiàn)胸腔積液、肺壞死等嚴(yán)重并發(fā)癥，并易遺留閉塞性細(xì)支氣管炎、肺不張以及支氣管擴(kuò)張等后遺癥，造成肺部反復(fù)感染，甚至最終需要肺葉切除［11］。MPP 的致病機(jī)制尚不完全清楚，通常認(rèn)為過度的免疫炎癥反應(yīng)參與MP感染的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示，CARDS毒素可能能夠解釋MP感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)［12］。

CARDS 毒素與許多氣道反應(yīng)性疾病及肺外并發(fā)癥直接相關(guān)，但其致病機(jī)制尚未明確。研究顯示，Toll樣受體在評估MP感染的發(fā)病、病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，其中的Toll 樣蛋白受體2（Toll protein receptor 2，TLR2）可以明顯增加炎性因子的合成釋放以及加重炎癥反應(yīng)［13］。在MP誘導(dǎo)的小鼠肺炎模型中，CARDS 毒素通過TLR2 依賴性方式誘導(dǎo)肺組織中中性粒細(xì)胞的浸潤、炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生［7］。CARDS 毒素作為MP 的毒力因子，參與MP 的增殖、結(jié)合及持續(xù)的炎癥反應(yīng)。在暴露于CARDS毒素的狒狒動物模型中，CARDS毒素可以引起嚴(yán)重的肺組織炎癥和氣道功能障礙［14］。難治性MPP的肺泡灌洗液中CARDS毒素明顯升高，CARDS毒素聯(lián)合腫瘤壞死因子-α 可較好地預(yù)測難治性MPP 的預(yù)后［15］。此外，CARDS 毒素與MP 感染后哮喘未控制和難治性哮喘有關(guān)［16］。在動物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，CARDS 毒素能引起哮喘樣的氣道組織病理改變，在氣道炎癥中起著重要作用［17］。本研究采用氣管滴注CARDS 毒素誘導(dǎo)小鼠急性肺炎，通過HE 染色發(fā)現(xiàn)肺組織發(fā)生明顯的病理損傷，說明CARDS毒素在肺組織炎癥中發(fā)揮重要作用。

單核細(xì)胞亞群能夠吞噬入侵體內(nèi)的異物和病原微生物，釋放多種細(xì)胞因子，并參與抗原提呈、免疫調(diào)節(jié)等過程，在固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。在MPP急性感染時(shí)單核細(xì)胞異常激活，并與MPP病情的嚴(yán)重程度及并發(fā)癥、預(yù)后密切相關(guān)。人單核細(xì)胞根據(jù)其表面分子CD14和CD16表達(dá)水平可分為經(jīng)典型（CD14+CD16-）、中間型（CD14brightCD16+）和非經(jīng)典型（CDdimCD16+）［18］。而小鼠的單核細(xì)胞主要分為2 個(gè)亞群，即CD11b+Ly6C+炎癥型單核細(xì)胞和CD11b+Ly6C-）循環(huán)型單核細(xì)胞，基于表面標(biāo)記表達(dá)與基因表達(dá)陣列，小鼠Ly6C+與人CD14+CD16-（經(jīng)典型）相似，而小鼠Ly6C-單核細(xì)胞與人CD16+單核細(xì)胞相似［19］。單核細(xì)胞和CARDS毒素體外共培養(yǎng)后，CARDS 毒素通過TLR4 依賴性方式促進(jìn)CD16+單核細(xì)胞IL-23p19 mRNA 的表達(dá)［20］。本研究結(jié)果顯示，肺炎支原體CARDS 毒素誘導(dǎo)的小鼠MPP 模型中的Ly6C+單核細(xì)胞比例、炎性因子IL-1β、IL-18 水平明顯升高，且肺組織呈持續(xù)性的炎癥反應(yīng)，表明Ly6C+單核細(xì)胞可能參與MP感染的發(fā)生發(fā)展過程，為以單核細(xì)胞調(diào)控為靶點(diǎn)的相關(guān)治療及干預(yù)研究提供一定的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，CARDS 毒素誘導(dǎo)的小鼠中Ly6C+單核細(xì)胞占比升高可能與MPP的發(fā)病密切相關(guān)，單核細(xì)胞亞群分化及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮重要作。本研究為以單核細(xì)胞系統(tǒng)為靶點(diǎn)早期診治MPP提供了新的研究方向及理論視角。