亞低溫治療對豬心臟驟停體外心肺復(fù)蘇后免疫功能及神經(jīng)功能的影響

王晉祥，續(xù)國武，王太蘭，王樂，靳衡，柴艷芬△

心臟驟停（cardiac arrest，CA）是患者死亡的重要原因之一。最新研究顯示，我國每年因CA死亡人數(shù)高達(dá)103 萬例，而院外心臟驟停（out of hospital cardiac arrest,OHCA）出院存活率及神經(jīng)功能良好的比例僅為1.3%和1%［1］。體外心肺復(fù)蘇（ECPR）與傳統(tǒng)心肺復(fù)蘇（CPR）相比有著更高的成功率，如能在CA 后30 min 內(nèi)實(shí)施ECPR，患者存活率可提高至40%［2］。 目標(biāo)體溫管理（target temperature management，TTM）已被證實(shí)是改善CA 患者生存率及神經(jīng)功能預(yù)后的重要干預(yù)措施［3］。目前關(guān)于亞低溫治療（MHT）對ECPR后神經(jīng)功能影響的基礎(chǔ)性研究較少，而對免疫功能是否存在抑制作用尚存在諸多爭議。本研究通過探討MHT 對豬心臟驟停體外心肺復(fù)蘇后免疫功能及神經(jīng)功能的影響，旨在為CA患者ECPR后的MHT提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 健康實(shí)驗(yàn)巴馬香豬18只，由天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（津）2020-0005，體質(zhì)量35～45 kg。實(shí)驗(yàn)前禁食24 h，不禁水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)（Sham）組、常溫治療（NT）組和MHT組，每組6只。NT組和MHT組經(jīng)右心室誘顫建立CA模型，隨后采取ECPR與體溫管理；Sham組僅進(jìn)行常規(guī)麻醉、氣管插管與CA模型置管。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 實(shí)驗(yàn)ECMO 系統(tǒng)，包括：滾壓式血泵、WEL-1000Wplus 熱交換水箱（天津匯康公司）；膜式氧合器、配套管路及15 F 股動脈插管、17 F 股靜脈插管（德國Maquet公司）；心電監(jiān)護(hù)儀、大動物呼吸麻醉一體機(jī)、纖維支氣管鏡、除顫儀、心肺復(fù)蘇機(jī)、手術(shù)床、吊塔吊燈、控溫毯（邁瑞醫(yī)療）；便攜式超聲儀（Philips）；高頻電刀及電凝設(shè)備（北京索吉瑞）；外科手術(shù)器械。

1.2 方法

1.2.1 麻醉及術(shù)前準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)豬稱體質(zhì)量后給予戊巴比妥鈉30 mg/kg肌內(nèi)注射，誘導(dǎo)麻醉成功后丙泊酚4～6 mg/（kg·h）持續(xù)泵入維持麻醉。經(jīng)纖維支氣管鏡輔助下氣管插管，呼吸機(jī)輔助機(jī)械通氣（潮氣量10 mL/kg，頻率15次/min，吸入氧濃度40%）；同時輔以1%～3%異氟烷持續(xù)吸入麻醉。床旁超聲引導(dǎo)下一側(cè)股動脈置入4 F動脈測壓導(dǎo)管進(jìn)行脈搏指數(shù)連續(xù)心輸出量監(jiān)測（PICCO）實(shí)時監(jiān)測有創(chuàng)血壓及血溫變化。乳酸鈉林格、5%葡萄糖氯化鈉注射液10～15 mL/（kg·h）交替持續(xù)靜脈補(bǔ)液。

1.2.2 體外膜肺氧合（ECMO）安裝與預(yù)充 ECMO管路采用無菌生理鹽水預(yù)充。預(yù)充完畢后調(diào)整為待機(jī)狀態(tài)。ECMO導(dǎo)管置入：床旁超聲引導(dǎo)下行股動靜脈穿刺置管，動脈插管置管深度10～15 cm，靜脈插管置管深度30～45 cm（以導(dǎo)管尖端達(dá)右心房為準(zhǔn)）。確認(rèn)插管位置后用管道鉗夾閉，靜脈注射1 mg/kg肝素鈉預(yù)抗凝，妥善縫合固定。

1.2.3 建立CA模型 床旁超聲引導(dǎo)下經(jīng)頸內(nèi)靜脈將雙極起搏電極送入右心室，當(dāng)電極置入深度18～22 cm 時，心電監(jiān)護(hù)儀提示出現(xiàn)室性期前收縮或室性心動過速，提示電極位置抵達(dá)右心室心內(nèi)膜。開始予以電流刺激（9 V直流電），持續(xù)3～5 s，參照評估標(biāo)準(zhǔn)［4］（出現(xiàn)室顫心律，收縮壓下降至25 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa）確認(rèn)成功誘導(dǎo)室顫致CA 后停止機(jī)械通氣，觀察5～10 min，期間不予任何干預(yù)，隨后啟動ECPR搶救流程。

1.2.4 實(shí)施ECPR 持續(xù)胸外按壓，頻率120 次/min，按壓深度3～4 cm；立即恢復(fù)機(jī)械通氣（吸入氧濃度100%，余參數(shù)同前）；實(shí)施非同步直流電擊除顫（雙向200 J），間斷給予腎上腺素、胺碘酮直至心搏恢復(fù)，重新建立循環(huán)。同時將股動脈、股靜脈插管分別連接預(yù)充好的ECMO 管路，ECMO 流量調(diào)整為20～40 mL/（kg·min），氧流量調(diào)整為1.0～1.5 mL/min。維持平均動脈壓＞65 mmHg，整個過程持續(xù)補(bǔ)液并監(jiān)測電解質(zhì)及酸堿平衡。

1.2.5 TTM 各組動物均處在恒定室溫25 ℃下進(jìn)行；MHT組通過ECMO 變溫水箱將目標(biāo)溫度保持32～36 ℃；NT 組通過ECMO 變溫水箱將目標(biāo)溫度保持37 ℃；Sham 組采用控溫毯將目標(biāo)體溫保持37 ℃；MHT 組治療24 h 后通過變溫水箱以0.5 ℃/h 速度復(fù)溫2～10 h，然后對各組進(jìn)行神經(jīng)功能缺損（NDS）評分，最后按倫理規(guī)定處死動物。

1.2.6 標(biāo)本收集與指標(biāo)檢測 采集各組動物靜脈血10 mL，3 000 r/min 離心15 min，分別取血清和血漿待檢。采用放射免疫分析法測定IgM、IgA、IgG含量。采用流式細(xì)胞儀測定T細(xì)胞亞群CD4、CD8、CD4/CD8水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和S100B 蛋白表達(dá)水平。試劑盒購自北京沃萊士生物科技有限公司，標(biāo)本儲存和實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。計數(shù)資料比較采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)參數(shù)對比 各組動物實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量、中心體溫、血流動力學(xué)參數(shù)（心率和平均動脈壓）、呼吸頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。其中NT 組和MHT 組均成功經(jīng)右心室誘顫制作CA 模型，并全部成功實(shí)施ECPR，復(fù)蘇成功率100%。

Tab.1 Comparison of basic parameters before experiment between the three groups表1 各組實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)參數(shù)比較（n=6，）

Tab.1 Comparison of basic parameters before experiment between the three groups表1 各組實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)參數(shù)比較（n=6，）

均P＞0.05。

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2.2 各組神經(jīng)功能評價指標(biāo)比較 與Sham 組相比，NT 組與MHT 組NDS 評分升高，NSE 和S100B 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與NT 組相比，MHT 組NDS 評分降低，NSE 和S100B 蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of nerve function indexes between the three groups表2 各組神經(jīng)功能評價指標(biāo)比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of nerve function indexes between the three groups表2 各組神經(jīng)功能評價指標(biāo)比較（n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Sham組比較，b與NT組比較，P＜0.05。

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2.3 各組免疫功能指標(biāo)對比 Sham 組、NT 組和MHT 組IgM、IgA、IgG 及T 細(xì)胞亞群CD4、CD8、CD4/CD8水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of immune function indexes between the three groups表3 各組免疫功能評價指標(biāo)比較 （n=6，）

Tab.3 Comparison of immune function indexes between the three groups表3 各組免疫功能評價指標(biāo)比較 （n=6，）

均P＞0.05。

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3 討論

3.1 TTM 可使心肺復(fù)蘇后患者獲得更好的神經(jīng)功能預(yù)后 CA是全球重大公共衛(wèi)生問題，并隨著新型冠狀病毒肺炎大流行愈發(fā)突出［5］。2020年國際復(fù)蘇聯(lián)絡(luò)委員會對全球16 個OHCA 中心的數(shù)據(jù)分析顯示，接受復(fù)蘇的患者30 d 存活率為3.1%～20.4%，僅2.8%～18.2%有良好的神經(jīng)功能預(yù)后［6］。有文獻(xiàn)報道，我國北京、上海等城市的OHCA患者出院時神經(jīng)功能良好的患者比例更低［7］。因此提高心肺復(fù)蘇成功率和改善復(fù)蘇后神經(jīng)功能成為CA 患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。Bartos 等［8］發(fā)現(xiàn)ECPR 患者死亡或神經(jīng)功能不良的風(fēng)險顯著降低，而且啟動越早獲益越大。2021 年歐洲復(fù)蘇委員會（ERC）指南推薦對于CA 出現(xiàn)自主循環(huán)恢復(fù)（ROSC）但未恢復(fù)意識的患者，應(yīng)盡快將目標(biāo)體溫控制在32～34 ℃［9］，且MHT 持續(xù)時間至少24 h，復(fù)溫速度應(yīng)由TTM 設(shè)備進(jìn)行控制（0.25～0.50 ℃/h），可獲得更好的長期神經(jīng)功能［10］。

3.2 MHT 可改善CA 復(fù)蘇后神經(jīng)功能 CA 復(fù)蘇后腦損傷是由神經(jīng)系統(tǒng)突發(fā)缺血和復(fù)蘇后再灌注引起，這些損傷可能在CA 初期、復(fù)蘇過程中和復(fù)蘇后依次發(fā)生，而TTM 對腦損傷有明確的神經(jīng)保護(hù)作用［11］。目前國內(nèi)外學(xué)者將NSE和S100B蛋白作為評價CA 患者復(fù)蘇后腦損傷的特異性標(biāo)志物［12］。本研究發(fā)現(xiàn)與Sham 組相比，NT 組與MHT 組NSE 和S100B蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明動物CA復(fù)蘇后腦部出現(xiàn)顯著缺血再灌注損傷；MHT 組與NT 組相比NSE 和S100B蛋白表達(dá)水平下降，表明MHT 可顯著減輕CA 復(fù)蘇后腦損傷。Cui 等［13］證實(shí)TTM 可顯著改善CA 豬的神經(jīng)功能，其可能機(jī)制為MHT 可抑制大腦小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與極化，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞合成及分泌炎性因子，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MHT 可有效降低豬CA 經(jīng)ECPR 后炎性因子的表達(dá)水平［14］。本研究同時對比各組NDS評分，結(jié)果顯示MHT 組與NT 組評分顯著高于Sham組，而MHT組NDS評分顯著低于NT組，進(jìn)一步表明MHT可減輕CA后腦損傷，并顯著改善CA復(fù)蘇后的神經(jīng)功能。需要指出的是，本研究采用的神經(jīng)功能指標(biāo)只能評估神經(jīng)功能的部分水平，并不能反映全部神經(jīng)功能的狀態(tài)，因此全面評估MHT 對CA 復(fù)蘇后神經(jīng)功能的影響仍需更加深入的研究。

3.3 MHT對CA復(fù)蘇后免疫功能無顯著影響 目前關(guān)于MHT對CA復(fù)蘇后免疫功能影響的研究尚不明確。陳富明等［15］研究發(fā)現(xiàn)MHT 可改善心肺復(fù)蘇成功患者的肺功能，且對免疫功能無影響。本研究中，各組IgM、IgA、IgG及T細(xì)胞亞群CD4、CD8、CD4/CD8水平無明顯差異，這一結(jié)果與陳富明等發(fā)現(xiàn)相一致，表明早期給予一定時間MHT及正確復(fù)溫處理對CA經(jīng)ECPR 后免疫功能無明顯影響。值得提出的是，CD4 和CD8 并不能反映全部免疫功能狀態(tài)，因此不同溫度、不同時間窗及治療時長可能對機(jī)體免疫功能產(chǎn)生不同的影響，這一領(lǐng)域仍需繼續(xù)深入研究。

綜上所述，MHT可改善豬心臟驟停體外心肺復(fù)蘇后神經(jīng)功能，降低腦損傷標(biāo)志物NSE 和S100B 蛋白表達(dá)，且對免疫功能無顯著影響，本研究可為臨床MHT提供一定的理論依據(jù)。