肌苷對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的肺保護作用及機制探討

許弄玉，鐘江姍，李多

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是以肺內(nèi)過度炎癥反應(yīng)和肺泡/毛細血管屏障破壞引起的肺水腫為特征的肺疾病，在危重癥患者中具有較高的發(fā)病率和病死率［1］。其發(fā)病機制復(fù)雜，關(guān)聯(lián)多條炎癥信號通路，其中核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是最常參與其中的信號通路［2］。因此，抑制NF-κB通路被認為是減弱脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的ALI 產(chǎn)生炎性因子的重要機制之一［3］。多聚ADP 核糖聚合酶［poly（ADP）-ribosepolymerase，PARP］是一種DNA 修復(fù)酶，參與細胞分裂、染色體重塑、調(diào)控細胞凋亡等重要程序［4］。目前主流觀點認為PARP-1與NF-κB之間的相互作用在免疫應(yīng)答的過程中扮演著重要角色［5］。通過抑制PARP-1 可減少炎性細胞因子的產(chǎn)生，減輕氧化和亞硝化應(yīng)激，減少線粒體自由基生成和細胞壞死，緩解包括肺［6］、胰腺、腸黏膜［7］在內(nèi)的多種臟器損傷。肌苷是由腺苷脫氨酶分解腺苷而形成的另一種內(nèi)源性嘌呤，目前已在神經(jīng)病變、心血管疾病等多個領(lǐng)域表現(xiàn)出潛在的藥理價值［8-9］。同時，大量研究證實肌苷具有強大的免疫調(diào)節(jié)功能，其在膿毒癥、缺血再灌注和炎癥損傷的動物模型中均表現(xiàn)出良好的保護作用［10-13］。本研究旨在探討肌苷在LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 中對PARP-1 以及Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）4/髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）/NF-κB 細胞信號通路的作用，為臨床開展肌苷治療ALI提供早期理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 20只8周齡SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-17。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.1.2 藥物及試劑 LPS及肌苷均購自北京索萊寶科技有限公司；PARP-1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子（TNF）-α 以及白細胞介素（IL）-1β 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自科鹿（武漢）生物科技有限責(zé)任公司；TLR4 兔源單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；MYD88、NF-κB p65 及磷酸化（p-）NF-κB p65 兔源單克隆抗體均購自美國CST 公司；GAPDH 兔源單克隆抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自ASPEN公司。

1.1.3 儀器 酶標儀（DR-200Bs，Diatek 公司），冷凍離心機（TGL-16，湖南湘儀實驗室儀器），恒溫培養(yǎng)箱（GNP9160，上海精宏實驗設(shè)備有限公司），電泳儀（DYY-6C）、脫色搖床（WD-9405A）購自北京市六一儀器廠，水浴鍋（HH-W-600，金壇市江南儀器廠），掃描儀（LiDE110，Canon）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 采用隨機數(shù)字表法將SD大鼠分為4 組：空白（NC）組、模型（LPS）組、肌苷低劑量干預(yù)（INL）組、肌苷高劑量干預(yù)（IN-H）組，每組5 只。各組大鼠腹腔注射4%水合氯醛（0.08 mL/kg）充分麻醉后，對LPS 組、IN-L組及IN-H組大鼠氣管內(nèi)滴注LPS（5 mg/kg）制備ALI模型；在相同條件下，NC 組大鼠氣管內(nèi)滴注等體積生理鹽水。在建模完成后1、6、12 h 通過腹腔注射的方法分別給予IN-L 和IN-H 組100 和200 mg/kg 肌苷。LPS 組及NC 組在相同時點給予等體積的生理鹽水。建模完成后24 h進行后續(xù)實驗。

1.2.2 動脈血氧分壓（PaO2）測定 清理大鼠腹部毛發(fā)，剪開皮膚，暴露腹腔，推開腸管后在脊柱前方可見到淡粉色的腹主動脈，用棉簽將表面筋膜組織剝離干凈，使用肝素化的注射器抽取大鼠腹主動脈血約0.2 mL，進行PaO2檢測。

1.2.3 PARP-1、iNOS 及炎性因子的含量測定 抽取大鼠腹主動脈血5 mL；剪開大鼠胸部，暴露氣管及雙側(cè)肺葉，結(jié)扎右側(cè)肺葉，并切開氣管，插入氣管給藥管，將給藥管固定后，經(jīng)氣道緩慢注射約3 mL生理鹽水進入左側(cè)肺葉，反復(fù)抽注5次后收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）。將取得的血清及BALF樣本于3 000 r/min 離心10 min，收集上清液。剔除實驗過程中死亡的大鼠，使用ELISA 試劑盒檢測PARP-1、iNOS、TNF-α和IL-1β含量。每組重復(fù)3次。

1.2.4 肺濕/干質(zhì)量比測定 剪下右肺上葉組織，漂洗后吸盡表面水分，稱質(zhì)量得肺濕質(zhì)量（W）；隨后將其烘干至徹底脫水，再次稱取的質(zhì)量即為肺干質(zhì)量（D），計算該樣本的濕/干質(zhì)量比（W/D）。

1.2.5 肺組織形態(tài)及病理學(xué)觀察 剪取大鼠右肺中葉肺組織，沖洗干凈后觀察肺組織形態(tài)，固定，包埋，切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡（×200）下隨機讀取5個視野進行評分，病理評分標準參考文獻［14］，取各視野評分平均值作為每個樣本的肺損傷病理學(xué)評分。

1.2.6 肺組織中蛋白表達檢測 排除實驗過程中死亡的大鼠，每組取3 個右肺下葉標本進行TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的檢測。將標本漂洗干凈后制成勻漿液，反復(fù)吹打后離心，取上清液測定蛋白總濃度，根據(jù)樣品濃度確定上樣量，保證每個樣品總蛋白上樣量相同。按濃縮膠80 V、分離膠120 V 進行恒壓電泳、300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜室溫封閉1 h，除去封閉液后加入一抗4 ℃過夜?；厥找豢梗礈旌蠹尤攵?，室溫孵育30 min。滴加增強型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?，隨后在暗室中曝光，根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。將膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊則采用LSD-t檢驗，方差不齊則采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 NC 組大鼠一般情況良好，正常飲水進食，呼吸平穩(wěn)（50～70次/min），可正?；顒樱瑹o脫發(fā)、毛發(fā)暗淡、精神萎靡等表現(xiàn)。LPS組活動明顯減少，表現(xiàn)出反應(yīng)遲鈍、食欲不振、呼吸急促（100～120次/min）、毛發(fā)暗淡。IN-L組則較LPS組活動、進食、對刺激反應(yīng)等均有好轉(zhuǎn)，呼吸頻率有所下降（80～100 次/min）。IN-H 組的呼吸頻率與IN-L 組相比又略有下降（60～90次/min）。

2.2 大鼠肺臟大體變化 NC 組肺臟外形飽滿，呈淺粉色，包膜完整，彈性可，未見充血、水腫、淤斑等。LPS 組肺臟體積稍縮小，表面充血，呈暗紅色，包膜下可見大片淤斑及片狀出血。IN-L 組肺臟體積較LPS 組稍有增大，表面仍充血，顏色深紅，薄膜下淤斑及出血灶有所減少。IN-H組體積接近正常肺臟，顏色淺紅，淤斑、充血、水腫明顯減少。見圖1。

Fig.1 Macroscopic observation of rat lung tissue圖1 大鼠肺組織肉眼觀察

2.3 大鼠肺損傷病理學(xué)評分、PaO2、W/D 比較 HE染色結(jié)果顯示，LPS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯被破壞，肺泡間隔顯著增厚，肺泡可見大面積水腫、充血，伴有炎性細胞的廣泛浸潤，大鼠肺損傷病理學(xué)評分較NC 組升高（P＜0.05）；而IN-L 組及IN-H 組中肺組織結(jié)構(gòu)較LPS 組明顯清晰，浸潤的紅細胞及炎性細胞減少，肺泡間隔縮小，病理評分下降，且IN-H組病理學(xué)評分較IN-L 組下降更明顯（均P＜0.05），見圖2、表1。與NC組相比，LPS組大鼠PaO2大幅下降，出現(xiàn)嚴重的低氧血癥，而不同劑量的肌苷可顯著改善大鼠低氧血癥，其中IN-H 組較IN-L 組的改善作用更加明顯（P＜0.05），見表1。LPS組肺W/D較NC組明顯升高，IN-L 組W/D 較LPS 組下降，IN-H 組較IN-L組下降（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of lung injury pathological scores,lung W/D,and PaO2 of rats between the four groups表1 4組大鼠肺損傷病理學(xué)評分、動脈血PaO2、肺W/D比較（n=4，）

Tab.1 Comparison of lung injury pathological scores,lung W/D,and PaO2 of rats between the four groups表1 4組大鼠肺損傷病理學(xué)評分、動脈血PaO2、肺W/D比較（n=4，）

＊＊P＜0.01；a與NC 組比較，b與LPS 組比較，c與IN-L 組比較，P＜0.05；表2、3同；1 mmHg=0.133 kPa。

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Fig.2 HE staining of lung tissue of rats(×200)圖2 各組大鼠肺組織HE染色（×200）

2.4 肌苷對PARP-1、iNOS 及炎性因子的影響 與NC 組相比，LPS 組血清及BALF 中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β含量均升高（P＜0.05）。與LPS組相比，IN-L 組和IN-H 組血清及BALF 中PARP-1、iNOS、TNF-α 以及IL-1β 含量均出現(xiàn)降低，且IN-H組下降程度更加明顯（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of concentrations of PARP-1,iNOS,TNF-α and IL-1β in serum and BALF between the four groups of rats表2 各組大鼠血清和BALF中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β濃度比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of concentrations of PARP-1,iNOS,TNF-α and IL-1β in serum and BALF between the four groups of rats表2 各組大鼠血清和BALF中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β濃度比較（n=3，）

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2.5 肌苷對肺組織TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表達的影響 在LPS 組中TLR4、MYD88、p-NF-κB p65 蛋白的表達較NC 組上調(diào)（P＜0.05），IN-L 組TLR4、MYD88、p-NF-κB p65 蛋白表達較LPS 組降低，IN-H 組較IN-L 組蛋白表達進一步降低（P＜0.05）；而4 組NF-κB p65 蛋白表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3、表3。

Tab.3 Comparison of the protein levels of TLR4,MYD88,NF-κB p65 and p-NF-κB p65 between the four groups of rats表3 各組大鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of the protein levels of TLR4,MYD88,NF-κB p65 and p-NF-κB p65 between the four groups of rats表3 各組大鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平比較（n=3，）

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3 討論

3.1 LPS 誘導(dǎo)ALI 大鼠模型的建立 ALI 是一種病死率極高的異質(zhì)性肺疾病，目前的標準療法，如機械通氣、俯臥位和給藥神經(jīng)肌肉阻斷劑的治療效果仍存在一定的限制性［15］。因此，探索治療ALI 的新藥物，總結(jié)其藥理作用并揭示其潛在的機制具有重要意義。盡管目前ALI已經(jīng)不再被用作描述人類疾病的術(shù)語，但它仍然適用于動物模型［16］。在本研究中氣道灌注LPS后大鼠的各項指標均可證實ALI模型構(gòu)建成功。在使用不同劑量的肌苷干預(yù)后，大鼠肺組織病理損傷程度減輕，炎性指標下降，提示肌苷可改善LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI。

3.2 肌苷通過調(diào)節(jié)TLR4/NF- κB 通路改善ALI TLR4/MYD88/NF-κB 信號通路與內(nèi)臟敏感性、腫瘤、功能性腸病等多種疾病相關(guān)，在炎癥反應(yīng)過程中扮演重要角色［17］。TLR4 是TLR 跨膜蛋白家族成員之一，除TLR3 以外的所有TLRs 均可通過MYD88介導(dǎo)激活NF-κB以及產(chǎn)生炎性細胞因子［18］。IL-1β 是IL-1 家族的重要成員之一，可誘導(dǎo)釋放多種促炎介質(zhì)，從而放大最初的炎癥反應(yīng)［19］。TNF-α同樣是ALI 中的關(guān)鍵炎性介質(zhì)，可以刺激產(chǎn)生IL-1β，協(xié)同增強IL-1β的作用［20］。在LPS刺激下，激活的TLR4 提高MYD88 銜接蛋白募集，加速NF-κB 核易位，促使TNF-α、IL-1β 等炎性細胞因子釋放入血；同時，這些炎性因子也反過來加強NF-κB通路，加重肺組織損傷［21］。

在本研究中，LPS誘導(dǎo)后在大鼠血清和BALF中TNF-α 及IL-1β 含量顯著增加，肺組織中TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白表達增加，而分別給予不同劑量肌苷干預(yù)后，上述變化均被抑制。Guo 等［13］研究證實肌苷可以通過減少肝細胞中TLR4、MYD88、NF-κB mRNA 等的表達改善LPS 誘導(dǎo)的急性肝損傷，這與本研究得出的結(jié)論相符。通過調(diào)節(jié)TLR4/MYD88/NF-κB 信號通路，肌苷抑制了NF-κB的活化入核，減少TNF-α、IL-1β 炎性介質(zhì)的釋放，從而減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI，上述改變在IN-H 組中較IN-L組更為明顯，因此在一定范圍內(nèi)更高劑量的肌苷可能起到更好的肺保護作用。

3.3 肌苷對ALI中PARP-1的影響 多聚ADP核糖基化修飾是一種重要的翻譯后蛋白質(zhì)修飾，參與DNA 修復(fù)和復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細胞死亡等生理過程，PARP 家族在此過程中發(fā)揮主要的作用［22］。其中PARP-1是最典型的PARP家族成員，在人體中發(fā)揮著家族90%以上的功能［4］。目前關(guān)于PARP-1 對NF-κB 的調(diào)節(jié)機制主要存在2 種猜測：（1）酶途徑。激活的PARP-1可催化NF-κB p65的RelA亞基的糖基化，從而誘導(dǎo)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)和促炎基因表達增加。（2）非酶途徑。PARP-1 可以作為對接分子，直接與NF-κB的p65和p50亞基結(jié)合［5］?；罨腘F-κB 可轉(zhuǎn)錄調(diào)控iNOS 的基因表達，iNOS 表達的增加可直接導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增強，產(chǎn)生的NO彌散入細胞可抑制線粒體呼吸鏈，影響能量代謝，進一步加劇組織損傷［23］。

Virág 等［24］研究首次證實肌苷可劑量依賴性地抑制過氧亞硝酸鹽處理的巨噬細胞中PARP-1的激活，推測這是因為肌苷與PARP-1 的底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸擁有部分相似的結(jié)構(gòu)，因此在理論上可能具備抑制PARP-1的效果。本實驗中給予不同劑量的肌苷后，大鼠血清以及BALF 中PARP-1 下降，p65 磷酸化及NF-κB p65 的核易位受到抑制，iNOS 含量也出現(xiàn)下降，各項肺損傷指標均有所改善，提示肌苷可以通過對PARP-1 的抑制下調(diào)NFκB在肺組織中的表達，從而起到肺保護的作用。

3.4 局限性 目前臨床上ALI的標準治療手段仍是機械通氣，但考慮到使用機械通氣可能存在加重機械性肺損傷的風(fēng)險，同時可供參考的文獻較少，在相關(guān)參數(shù)的選擇上難度較高，因此在本研究中并未聯(lián)合機械通氣進行治療。在后續(xù)的研究中，可以嘗試在機械通氣的基礎(chǔ)上使用肌苷對ALI 進行干預(yù)，為肌苷治療ALI提供更加有力的實驗結(jié)論。

綜上所述，肌苷對LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 具有一定的保護作用。其機制可能與下調(diào)TLR4/MYD88/NF-κB信號通路，抑制PARP-1活性，減少NF-κB核易位相關(guān)。這有望為ALI的臨床藥物治療提供更多的參考，但其具體機制以及適用性仍需進一步研究。