肌苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的肺保護(hù)作用及機(jī)制探討

許弄玉，鐘江姍，李多

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是以肺內(nèi)過度炎癥反應(yīng)和肺泡/毛細(xì)血管屏障破壞引起的肺水腫為特征的肺疾病，在危重癥患者中具有較高的發(fā)病率和病死率［1］。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，關(guān)聯(lián)多條炎癥信號(hào)通路，其中核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路是最常參與其中的信號(hào)通路［2］。因此，抑制NF-κB通路被認(rèn)為是減弱脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的ALI 產(chǎn)生炎性因子的重要機(jī)制之一［3］。多聚ADP 核糖聚合酶［poly（ADP）-ribosepolymerase，PARP］是一種DNA 修復(fù)酶，參與細(xì)胞分裂、染色體重塑、調(diào)控細(xì)胞凋亡等重要程序［4］。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為PARP-1與NF-κB之間的相互作用在免疫應(yīng)答的過程中扮演著重要角色［5］。通過抑制PARP-1 可減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕氧化和亞硝化應(yīng)激，減少線粒體自由基生成和細(xì)胞壞死，緩解包括肺［6］、胰腺、腸黏膜［7］在內(nèi)的多種臟器損傷。肌苷是由腺苷脫氨酶分解腺苷而形成的另一種內(nèi)源性嘌呤，目前已在神經(jīng)病變、心血管疾病等多個(gè)領(lǐng)域表現(xiàn)出潛在的藥理價(jià)值［8-9］。同時(shí)，大量研究證實(shí)肌苷具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，其在膿毒癥、缺血再灌注和炎癥損傷的動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用［10-13］。本研究旨在探討肌苷在LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 中對(duì)PARP-1 以及Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）4/髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）/NF-κB 細(xì)胞信號(hào)通路的作用，為臨床開展肌苷治療ALI提供早期理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2018-17。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物及試劑 LPS及肌苷均購自北京索萊寶科技有限公司；PARP-1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子（TNF）-α 以及白細(xì)胞介素（IL）-1β 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購自科鹿（武漢）生物科技有限責(zé)任公司；TLR4 兔源單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；MYD88、NF-κB p65 及磷酸化（p-）NF-κB p65 兔源單克隆抗體均購自美國CST 公司；GAPDH 兔源單克隆抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自ASPEN公司。

1.1.3 儀器 酶標(biāo)儀（DR-200Bs，Diatek 公司），冷凍離心機(jī)（TGL-16，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器），恒溫培養(yǎng)箱（GNP9160，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），電泳儀（DYY-6C）、脫色搖床（WD-9405A）購自北京市六一儀器廠，水浴鍋（HH-W-600，金壇市江南儀器廠），掃描儀（LiDE110，Canon）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為4 組：空白（NC）組、模型（LPS）組、肌苷低劑量干預(yù)（INL）組、肌苷高劑量干預(yù)（IN-H）組，每組5 只。各組大鼠腹腔注射4%水合氯醛（0.08 mL/kg）充分麻醉后，對(duì)LPS 組、IN-L組及IN-H組大鼠氣管內(nèi)滴注LPS（5 mg/kg）制備ALI模型；在相同條件下，NC 組大鼠氣管內(nèi)滴注等體積生理鹽水。在建模完成后1、6、12 h 通過腹腔注射的方法分別給予IN-L 和IN-H 組100 和200 mg/kg 肌苷。LPS 組及NC 組在相同時(shí)點(diǎn)給予等體積的生理鹽水。建模完成后24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）測(cè)定 清理大鼠腹部毛發(fā)，剪開皮膚，暴露腹腔，推開腸管后在脊柱前方可見到淡粉色的腹主動(dòng)脈，用棉簽將表面筋膜組織剝離干凈，使用肝素化的注射器抽取大鼠腹主動(dòng)脈血約0.2 mL，進(jìn)行PaO2檢測(cè)。

1.2.3 PARP-1、iNOS 及炎性因子的含量測(cè)定 抽取大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL；剪開大鼠胸部，暴露氣管及雙側(cè)肺葉，結(jié)扎右側(cè)肺葉，并切開氣管，插入氣管給藥管，將給藥管固定后，經(jīng)氣道緩慢注射約3 mL生理鹽水進(jìn)入左側(cè)肺葉，反復(fù)抽注5次后收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）。將取得的血清及BALF樣本于3 000 r/min 離心10 min，收集上清液。剔除實(shí)驗(yàn)過程中死亡的大鼠，使用ELISA 試劑盒檢測(cè)PARP-1、iNOS、TNF-α和IL-1β含量。每組重復(fù)3次。

1.2.4 肺濕/干質(zhì)量比測(cè)定 剪下右肺上葉組織，漂洗后吸盡表面水分，稱質(zhì)量得肺濕質(zhì)量（W）；隨后將其烘干至徹底脫水，再次稱取的質(zhì)量即為肺干質(zhì)量（D），計(jì)算該樣本的濕/干質(zhì)量比（W/D）。

1.2.5 肺組織形態(tài)及病理學(xué)觀察 剪取大鼠右肺中葉肺組織，沖洗干凈后觀察肺組織形態(tài)，固定，包埋，切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡（×200）下隨機(jī)讀取5個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分，病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)［14］，取各視野評(píng)分平均值作為每個(gè)樣本的肺損傷病理學(xué)評(píng)分。

1.2.6 肺組織中蛋白表達(dá)檢測(cè) 排除實(shí)驗(yàn)過程中死亡的大鼠，每組取3 個(gè)右肺下葉標(biāo)本進(jìn)行TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的檢測(cè)。將標(biāo)本漂洗干凈后制成勻漿液，反復(fù)吹打后離心，取上清液測(cè)定蛋白總濃度，根據(jù)樣品濃度確定上樣量，保證每個(gè)樣品總蛋白上樣量相同。按濃縮膠80 V、分離膠120 V 進(jìn)行恒壓電泳、300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜室溫封閉1 h，除去封閉液后加入一抗4 ℃過夜。回收一抗，洗滌后加入二抗，室溫孵育30 min。滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)龋S后在暗室中曝光，根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較方差齊則采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊則采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 NC 組大鼠一般情況良好，正常飲水進(jìn)食，呼吸平穩(wěn)（50～70次/min），可正?；顒?dòng)，無脫發(fā)、毛發(fā)暗淡、精神萎靡等表現(xiàn)。LPS組活動(dòng)明顯減少，表現(xiàn)出反應(yīng)遲鈍、食欲不振、呼吸急促（100～120次/min）、毛發(fā)暗淡。IN-L組則較LPS組活動(dòng)、進(jìn)食、對(duì)刺激反應(yīng)等均有好轉(zhuǎn)，呼吸頻率有所下降（80～100 次/min）。IN-H 組的呼吸頻率與IN-L 組相比又略有下降（60～90次/min）。

2.2 大鼠肺臟大體變化 NC 組肺臟外形飽滿，呈淺粉色，包膜完整，彈性可，未見充血、水腫、淤斑等。LPS 組肺臟體積稍縮小，表面充血，呈暗紅色，包膜下可見大片淤斑及片狀出血。IN-L 組肺臟體積較LPS 組稍有增大，表面仍充血，顏色深紅，薄膜下淤斑及出血灶有所減少。IN-H組體積接近正常肺臟，顏色淺紅，淤斑、充血、水腫明顯減少。見圖1。

Fig.1 Macroscopic observation of rat lung tissue圖1 大鼠肺組織肉眼觀察

2.3 大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分、PaO2、W/D 比較 HE染色結(jié)果顯示，LPS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯被破壞，肺泡間隔顯著增厚，肺泡可見大面積水腫、充血，伴有炎性細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)，大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分較NC 組升高（P＜0.05）；而IN-L 組及IN-H 組中肺組織結(jié)構(gòu)較LPS 組明顯清晰，浸潤(rùn)的紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞減少，肺泡間隔縮小，病理評(píng)分下降，且IN-H組病理學(xué)評(píng)分較IN-L 組下降更明顯（均P＜0.05），見圖2、表1。與NC組相比，LPS組大鼠PaO2大幅下降，出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥，而不同劑量的肌苷可顯著改善大鼠低氧血癥，其中IN-H 組較IN-L 組的改善作用更加明顯（P＜0.05），見表1。LPS組肺W/D較NC組明顯升高，IN-L 組W/D 較LPS 組下降，IN-H 組較IN-L組下降（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of lung injury pathological scores,lung W/D,and PaO2 of rats between the four groups表1 4組大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分、動(dòng)脈血PaO2、肺W/D比較（n=4，）

Tab.1 Comparison of lung injury pathological scores,lung W/D,and PaO2 of rats between the four groups表1 4組大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分、動(dòng)脈血PaO2、肺W/D比較（n=4，）

＊＊P＜0.01；a與NC 組比較，b與LPS 組比較，c與IN-L 組比較，P＜0.05；表2、3同；1 mmHg=0.133 kPa。

?

Fig.2 HE staining of lung tissue of rats(×200)圖2 各組大鼠肺組織HE染色（×200）

2.4 肌苷對(duì)PARP-1、iNOS 及炎性因子的影響 與NC 組相比，LPS 組血清及BALF 中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β含量均升高（P＜0.05）。與LPS組相比，IN-L 組和IN-H 組血清及BALF 中PARP-1、iNOS、TNF-α 以及IL-1β 含量均出現(xiàn)降低，且IN-H組下降程度更加明顯（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of concentrations of PARP-1,iNOS,TNF-α and IL-1β in serum and BALF between the four groups of rats表2 各組大鼠血清和BALF中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β濃度比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of concentrations of PARP-1,iNOS,TNF-α and IL-1β in serum and BALF between the four groups of rats表2 各組大鼠血清和BALF中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β濃度比較（n=3，）

?

2.5 肌苷對(duì)肺組織TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 在LPS 組中TLR4、MYD88、p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)較NC 組上調(diào)（P＜0.05），IN-L 組TLR4、MYD88、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)較LPS 組降低，IN-H 組較IN-L 組蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低（P＜0.05）；而4 組NF-κB p65 蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3、表3。

Tab.3 Comparison of the protein levels of TLR4,MYD88,NF-κB p65 and p-NF-κB p65 between the four groups of rats表3 各組大鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of the protein levels of TLR4,MYD88,NF-κB p65 and p-NF-κB p65 between the four groups of rats表3 各組大鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較（n=3，）

?

3 討論

3.1 LPS 誘導(dǎo)ALI 大鼠模型的建立 ALI 是一種病死率極高的異質(zhì)性肺疾病，目前的標(biāo)準(zhǔn)療法，如機(jī)械通氣、俯臥位和給藥神經(jīng)肌肉阻斷劑的治療效果仍存在一定的限制性［15］。因此，探索治療ALI 的新藥物，總結(jié)其藥理作用并揭示其潛在的機(jī)制具有重要意義。盡管目前ALI已經(jīng)不再被用作描述人類疾病的術(shù)語，但它仍然適用于動(dòng)物模型［16］。在本研究中氣道灌注LPS后大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)均可證實(shí)ALI模型構(gòu)建成功。在使用不同劑量的肌苷干預(yù)后，大鼠肺組織病理損傷程度減輕，炎性指標(biāo)下降，提示肌苷可改善LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI。

3.2 肌苷通過調(diào)節(jié)TLR4/NF- κB 通路改善ALI TLR4/MYD88/NF-κB 信號(hào)通路與內(nèi)臟敏感性、腫瘤、功能性腸病等多種疾病相關(guān)，在炎癥反應(yīng)過程中扮演重要角色［17］。TLR4 是TLR 跨膜蛋白家族成員之一，除TLR3 以外的所有TLRs 均可通過MYD88介導(dǎo)激活NF-κB以及產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子［18］。IL-1β 是IL-1 家族的重要成員之一，可誘導(dǎo)釋放多種促炎介質(zhì)，從而放大最初的炎癥反應(yīng)［19］。TNF-α同樣是ALI 中的關(guān)鍵炎性介質(zhì)，可以刺激產(chǎn)生IL-1β，協(xié)同增強(qiáng)IL-1β的作用［20］。在LPS刺激下，激活的TLR4 提高M(jìn)YD88 銜接蛋白募集，加速NF-κB 核易位，促使TNF-α、IL-1β 等炎性細(xì)胞因子釋放入血；同時(shí)，這些炎性因子也反過來加強(qiáng)NF-κB通路，加重肺組織損傷［21］。

在本研究中，LPS誘導(dǎo)后在大鼠血清和BALF中TNF-α 及IL-1β 含量顯著增加，肺組織中TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)增加，而分別給予不同劑量肌苷干預(yù)后，上述變化均被抑制。Guo 等［13］研究證實(shí)肌苷可以通過減少肝細(xì)胞中TLR4、MYD88、NF-κB mRNA 等的表達(dá)改善LPS 誘導(dǎo)的急性肝損傷，這與本研究得出的結(jié)論相符。通過調(diào)節(jié)TLR4/MYD88/NF-κB 信號(hào)通路，肌苷抑制了NF-κB的活化入核，減少TNF-α、IL-1β 炎性介質(zhì)的釋放，從而減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI，上述改變?cè)贗N-H 組中較IN-L組更為明顯，因此在一定范圍內(nèi)更高劑量的肌苷可能起到更好的肺保護(hù)作用。

3.3 肌苷對(duì)ALI中PARP-1的影響 多聚ADP核糖基化修飾是一種重要的翻譯后蛋白質(zhì)修飾，參與DNA 修復(fù)和復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞死亡等生理過程，PARP 家族在此過程中發(fā)揮主要的作用［22］。其中PARP-1是最典型的PARP家族成員，在人體中發(fā)揮著家族90%以上的功能［4］。目前關(guān)于PARP-1 對(duì)NF-κB 的調(diào)節(jié)機(jī)制主要存在2 種猜測(cè)：（1）酶途徑。激活的PARP-1可催化NF-κB p65的RelA亞基的糖基化，從而誘導(dǎo)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)和促炎基因表達(dá)增加。（2）非酶途徑。PARP-1 可以作為對(duì)接分子，直接與NF-κB的p65和p50亞基結(jié)合［5］?；罨腘F-κB 可轉(zhuǎn)錄調(diào)控iNOS 的基因表達(dá)，iNOS 表達(dá)的增加可直接導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增強(qiáng)，產(chǎn)生的NO彌散入細(xì)胞可抑制線粒體呼吸鏈，影響能量代謝，進(jìn)一步加劇組織損傷［23］。

Virág 等［24］研究首次證實(shí)肌苷可劑量依賴性地抑制過氧亞硝酸鹽處理的巨噬細(xì)胞中PARP-1的激活，推測(cè)這是因?yàn)榧≤张cPARP-1 的底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸擁有部分相似的結(jié)構(gòu)，因此在理論上可能具備抑制PARP-1的效果。本實(shí)驗(yàn)中給予不同劑量的肌苷后，大鼠血清以及BALF 中PARP-1 下降，p65 磷酸化及NF-κB p65 的核易位受到抑制，iNOS 含量也出現(xiàn)下降，各項(xiàng)肺損傷指標(biāo)均有所改善，提示肌苷可以通過對(duì)PARP-1 的抑制下調(diào)NFκB在肺組織中的表達(dá)，從而起到肺保護(hù)的作用。

3.4 局限性 目前臨床上ALI的標(biāo)準(zhǔn)治療手段仍是機(jī)械通氣，但考慮到使用機(jī)械通氣可能存在加重機(jī)械性肺損傷的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)可供參考的文獻(xiàn)較少，在相關(guān)參數(shù)的選擇上難度較高，因此在本研究中并未聯(lián)合機(jī)械通氣進(jìn)行治療。在后續(xù)的研究中，可以嘗試在機(jī)械通氣的基礎(chǔ)上使用肌苷對(duì)ALI 進(jìn)行干預(yù)，為肌苷治療ALI提供更加有力的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

綜上所述，肌苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 具有一定的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與下調(diào)TLR4/MYD88/NF-κB信號(hào)通路，抑制PARP-1活性，減少NF-κB核易位相關(guān)。這有望為ALI的臨床藥物治療提供更多的參考，但其具體機(jī)制以及適用性仍需進(jìn)一步研究。