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    肌苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的肺保護(hù)作用及機(jī)制探討

    2023-10-15 17:23:04許弄玉鐘江姍李多
    天津醫(yī)藥 2023年10期

    許弄玉,鐘江姍,李多

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是以肺內(nèi)過度炎癥反應(yīng)和肺泡/毛細(xì)血管屏障破壞引起的肺水腫為特征的肺疾病,在危重癥患者中具有較高的發(fā)病率和病死率[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,關(guān)聯(lián)多條炎癥信號(hào)通路,其中核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)通路是最常參與其中的信號(hào)通路[2]。因此,抑制NF-κB通路被認(rèn)為是減弱脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的ALI 產(chǎn)生炎性因子的重要機(jī)制之一[3]。多聚ADP 核糖聚合酶[poly(ADP)-ribosepolymerase,PARP]是一種DNA 修復(fù)酶,參與細(xì)胞分裂、染色體重塑、調(diào)控細(xì)胞凋亡等重要程序[4]。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為PARP-1與NF-κB之間的相互作用在免疫應(yīng)答的過程中扮演著重要角色[5]。通過抑制PARP-1 可減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,減輕氧化和亞硝化應(yīng)激,減少線粒體自由基生成和細(xì)胞壞死,緩解包括肺[6]、胰腺、腸黏膜[7]在內(nèi)的多種臟器損傷。肌苷是由腺苷脫氨酶分解腺苷而形成的另一種內(nèi)源性嘌呤,目前已在神經(jīng)病變、心血管疾病等多個(gè)領(lǐng)域表現(xiàn)出潛在的藥理價(jià)值[8-9]。同時(shí),大量研究證實(shí)肌苷具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能,其在膿毒癥、缺血再灌注和炎癥損傷的動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用[10-13]。本研究旨在探討肌苷在LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 中對(duì)PARP-1 以及Toll 樣受體(toll-like receptor,TLR)4/髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88,MYD88)/NF-κB 細(xì)胞信號(hào)通路的作用,為臨床開展肌苷治療ALI提供早期理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20只8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,購自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2018-17。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.1.2 藥物及試劑 LPS及肌苷均購自北京索萊寶科技有限公司;PARP-1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、腫瘤壞死因子(TNF)-α 以及白細(xì)胞介素(IL)-1β 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購自科鹿(武漢)生物科技有限責(zé)任公司;TLR4 兔源單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;MYD88、NF-κB p65 及磷酸化(p-)NF-κB p65 兔源單克隆抗體均購自美國CST 公司;GAPDH 兔源單克隆抗體購自英國Abcam公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自ASPEN公司。

    1.1.3 儀器 酶標(biāo)儀(DR-200Bs,Diatek 公司),冷凍離心機(jī)(TGL-16,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器),恒溫培養(yǎng)箱(GNP9160,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),電泳儀(DYY-6C)、脫色搖床(WD-9405A)購自北京市六一儀器廠,水浴鍋(HH-W-600,金壇市江南儀器廠),掃描儀(LiDE110,Canon)。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為4 組:空白(NC)組、模型(LPS)組、肌苷低劑量干預(yù)(INL)組、肌苷高劑量干預(yù)(IN-H)組,每組5 只。各組大鼠腹腔注射4%水合氯醛(0.08 mL/kg)充分麻醉后,對(duì)LPS 組、IN-L組及IN-H組大鼠氣管內(nèi)滴注LPS(5 mg/kg)制備ALI模型;在相同條件下,NC 組大鼠氣管內(nèi)滴注等體積生理鹽水。在建模完成后1、6、12 h 通過腹腔注射的方法分別給予IN-L 和IN-H 組100 和200 mg/kg 肌苷。LPS 組及NC 組在相同時(shí)點(diǎn)給予等體積的生理鹽水。建模完成后24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)測(cè)定 清理大鼠腹部毛發(fā),剪開皮膚,暴露腹腔,推開腸管后在脊柱前方可見到淡粉色的腹主動(dòng)脈,用棉簽將表面筋膜組織剝離干凈,使用肝素化的注射器抽取大鼠腹主動(dòng)脈血約0.2 mL,進(jìn)行PaO2檢測(cè)。

    1.2.3 PARP-1、iNOS 及炎性因子的含量測(cè)定 抽取大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL;剪開大鼠胸部,暴露氣管及雙側(cè)肺葉,結(jié)扎右側(cè)肺葉,并切開氣管,插入氣管給藥管,將給藥管固定后,經(jīng)氣道緩慢注射約3 mL生理鹽水進(jìn)入左側(cè)肺葉,反復(fù)抽注5次后收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)。將取得的血清及BALF樣本于3 000 r/min 離心10 min,收集上清液。剔除實(shí)驗(yàn)過程中死亡的大鼠,使用ELISA 試劑盒檢測(cè)PARP-1、iNOS、TNF-α和IL-1β含量。每組重復(fù)3次。

    1.2.4 肺濕/干質(zhì)量比測(cè)定 剪下右肺上葉組織,漂洗后吸盡表面水分,稱質(zhì)量得肺濕質(zhì)量(W);隨后將其烘干至徹底脫水,再次稱取的質(zhì)量即為肺干質(zhì)量(D),計(jì)算該樣本的濕/干質(zhì)量比(W/D)。

    1.2.5 肺組織形態(tài)及病理學(xué)觀察 剪取大鼠右肺中葉肺組織,沖洗干凈后觀察肺組織形態(tài),固定,包埋,切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。在光學(xué)顯微鏡(×200)下隨機(jī)讀取5個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分,病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[14],取各視野評(píng)分平均值作為每個(gè)樣本的肺損傷病理學(xué)評(píng)分。

    1.2.6 肺組織中蛋白表達(dá)檢測(cè) 排除實(shí)驗(yàn)過程中死亡的大鼠,每組取3 個(gè)右肺下葉標(biāo)本進(jìn)行TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的檢測(cè)。將標(biāo)本漂洗干凈后制成勻漿液,反復(fù)吹打后離心,取上清液測(cè)定蛋白總濃度,根據(jù)樣品濃度確定上樣量,保證每個(gè)樣品總蛋白上樣量相同。按濃縮膠80 V、分離膠120 V 進(jìn)行恒壓電泳、300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜室溫封閉1 h,除去封閉液后加入一抗4 ℃過夜。回收一抗,洗滌后加入二抗,室溫孵育30 min。滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)龋S后在暗室中曝光,根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件,顯影、定影。將膠片進(jìn)行掃描存檔,AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度(OD)值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較方差齊則采用LSD-t檢驗(yàn),方差不齊則采用Dunnett’s T3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠一般情況 NC 組大鼠一般情況良好,正常飲水進(jìn)食,呼吸平穩(wěn)(50~70次/min),可正?;顒?dòng),無脫發(fā)、毛發(fā)暗淡、精神萎靡等表現(xiàn)。LPS組活動(dòng)明顯減少,表現(xiàn)出反應(yīng)遲鈍、食欲不振、呼吸急促(100~120次/min)、毛發(fā)暗淡。IN-L組則較LPS組活動(dòng)、進(jìn)食、對(duì)刺激反應(yīng)等均有好轉(zhuǎn),呼吸頻率有所下降(80~100 次/min)。IN-H 組的呼吸頻率與IN-L 組相比又略有下降(60~90次/min)。

    2.2 大鼠肺臟大體變化 NC 組肺臟外形飽滿,呈淺粉色,包膜完整,彈性可,未見充血、水腫、淤斑等。LPS 組肺臟體積稍縮小,表面充血,呈暗紅色,包膜下可見大片淤斑及片狀出血。IN-L 組肺臟體積較LPS 組稍有增大,表面仍充血,顏色深紅,薄膜下淤斑及出血灶有所減少。IN-H組體積接近正常肺臟,顏色淺紅,淤斑、充血、水腫明顯減少。見圖1。

    Fig.1 Macroscopic observation of rat lung tissue圖1 大鼠肺組織肉眼觀察

    2.3 大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分、PaO2、W/D 比較 HE染色結(jié)果顯示,LPS組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯被破壞,肺泡間隔顯著增厚,肺泡可見大面積水腫、充血,伴有炎性細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn),大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分較NC 組升高(P<0.05);而IN-L 組及IN-H 組中肺組織結(jié)構(gòu)較LPS 組明顯清晰,浸潤(rùn)的紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞減少,肺泡間隔縮小,病理評(píng)分下降,且IN-H組病理學(xué)評(píng)分較IN-L 組下降更明顯(均P<0.05),見圖2、表1。與NC組相比,LPS組大鼠PaO2大幅下降,出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥,而不同劑量的肌苷可顯著改善大鼠低氧血癥,其中IN-H 組較IN-L 組的改善作用更加明顯(P<0.05),見表1。LPS組肺W/D較NC組明顯升高,IN-L 組W/D 較LPS 組下降,IN-H 組較IN-L組下降(均P<0.05),見表1。

    Tab.1 Comparison of lung injury pathological scores,lung W/D,and PaO2 of rats between the four groups表1 4組大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分、動(dòng)脈血PaO2、肺W/D比較(n=4,)

    Tab.1 Comparison of lung injury pathological scores,lung W/D,and PaO2 of rats between the four groups表1 4組大鼠肺損傷病理學(xué)評(píng)分、動(dòng)脈血PaO2、肺W/D比較(n=4,)

    **P<0.01;a與NC 組比較,b與LPS 組比較,c與IN-L 組比較,P<0.05;表2、3同;1 mmHg=0.133 kPa。

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    Fig.2 HE staining of lung tissue of rats(×200)圖2 各組大鼠肺組織HE染色(×200)

    2.4 肌苷對(duì)PARP-1、iNOS 及炎性因子的影響 與NC 組相比,LPS 組血清及BALF 中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β含量均升高(P<0.05)。與LPS組相比,IN-L 組和IN-H 組血清及BALF 中PARP-1、iNOS、TNF-α 以及IL-1β 含量均出現(xiàn)降低,且IN-H組下降程度更加明顯(均P<0.05),見表2。

    Tab.2 Comparison of concentrations of PARP-1,iNOS,TNF-α and IL-1β in serum and BALF between the four groups of rats表2 各組大鼠血清和BALF中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β濃度比較(n=3,)

    Tab.2 Comparison of concentrations of PARP-1,iNOS,TNF-α and IL-1β in serum and BALF between the four groups of rats表2 各組大鼠血清和BALF中PARP-1、iNOS、TNF-α及IL-1β濃度比較(n=3,)

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    2.5 肌苷對(duì)肺組織TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 在LPS 組中TLR4、MYD88、p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)較NC 組上調(diào)(P<0.05),IN-L 組TLR4、MYD88、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)較LPS 組降低,IN-H 組較IN-L 組蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05);而4 組NF-κB p65 蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖3、表3。

    Tab.3 Comparison of the protein levels of TLR4,MYD88,NF-κB p65 and p-NF-κB p65 between the four groups of rats表3 各組大鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較(n=3,)

    Tab.3 Comparison of the protein levels of TLR4,MYD88,NF-κB p65 and p-NF-κB p65 between the four groups of rats表3 各組大鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較(n=3,)

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    3 討論

    3.1 LPS 誘導(dǎo)ALI 大鼠模型的建立 ALI 是一種病死率極高的異質(zhì)性肺疾病,目前的標(biāo)準(zhǔn)療法,如機(jī)械通氣、俯臥位和給藥神經(jīng)肌肉阻斷劑的治療效果仍存在一定的限制性[15]。因此,探索治療ALI 的新藥物,總結(jié)其藥理作用并揭示其潛在的機(jī)制具有重要意義。盡管目前ALI已經(jīng)不再被用作描述人類疾病的術(shù)語,但它仍然適用于動(dòng)物模型[16]。在本研究中氣道灌注LPS后大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)均可證實(shí)ALI模型構(gòu)建成功。在使用不同劑量的肌苷干預(yù)后,大鼠肺組織病理損傷程度減輕,炎性指標(biāo)下降,提示肌苷可改善LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI。

    3.2 肌苷通過調(diào)節(jié)TLR4/NF- κB 通路改善ALI TLR4/MYD88/NF-κB 信號(hào)通路與內(nèi)臟敏感性、腫瘤、功能性腸病等多種疾病相關(guān),在炎癥反應(yīng)過程中扮演重要角色[17]。TLR4 是TLR 跨膜蛋白家族成員之一,除TLR3 以外的所有TLRs 均可通過MYD88介導(dǎo)激活NF-κB以及產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[18]。IL-1β 是IL-1 家族的重要成員之一,可誘導(dǎo)釋放多種促炎介質(zhì),從而放大最初的炎癥反應(yīng)[19]。TNF-α同樣是ALI 中的關(guān)鍵炎性介質(zhì),可以刺激產(chǎn)生IL-1β,協(xié)同增強(qiáng)IL-1β的作用[20]。在LPS刺激下,激活的TLR4 提高M(jìn)YD88 銜接蛋白募集,加速NF-κB 核易位,促使TNF-α、IL-1β 等炎性細(xì)胞因子釋放入血;同時(shí),這些炎性因子也反過來加強(qiáng)NF-κB通路,加重肺組織損傷[21]。

    在本研究中,LPS誘導(dǎo)后在大鼠血清和BALF中TNF-α 及IL-1β 含量顯著增加,肺組織中TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)增加,而分別給予不同劑量肌苷干預(yù)后,上述變化均被抑制。Guo 等[13]研究證實(shí)肌苷可以通過減少肝細(xì)胞中TLR4、MYD88、NF-κB mRNA 等的表達(dá)改善LPS 誘導(dǎo)的急性肝損傷,這與本研究得出的結(jié)論相符。通過調(diào)節(jié)TLR4/MYD88/NF-κB 信號(hào)通路,肌苷抑制了NF-κB的活化入核,減少TNF-α、IL-1β 炎性介質(zhì)的釋放,從而減輕LPS 誘導(dǎo)的ALI,上述改變?cè)贗N-H 組中較IN-L組更為明顯,因此在一定范圍內(nèi)更高劑量的肌苷可能起到更好的肺保護(hù)作用。

    3.3 肌苷對(duì)ALI中PARP-1的影響 多聚ADP核糖基化修飾是一種重要的翻譯后蛋白質(zhì)修飾,參與DNA 修復(fù)和復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞死亡等生理過程,PARP 家族在此過程中發(fā)揮主要的作用[22]。其中PARP-1是最典型的PARP家族成員,在人體中發(fā)揮著家族90%以上的功能[4]。目前關(guān)于PARP-1 對(duì)NF-κB 的調(diào)節(jié)機(jī)制主要存在2 種猜測(cè):(1)酶途徑。激活的PARP-1可催化NF-κB p65的RelA亞基的糖基化,從而誘導(dǎo)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)和促炎基因表達(dá)增加。(2)非酶途徑。PARP-1 可以作為對(duì)接分子,直接與NF-κB的p65和p50亞基結(jié)合[5]?;罨腘F-κB 可轉(zhuǎn)錄調(diào)控iNOS 的基因表達(dá),iNOS 表達(dá)的增加可直接導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增強(qiáng),產(chǎn)生的NO彌散入細(xì)胞可抑制線粒體呼吸鏈,影響能量代謝,進(jìn)一步加劇組織損傷[23]。

    Virág 等[24]研究首次證實(shí)肌苷可劑量依賴性地抑制過氧亞硝酸鹽處理的巨噬細(xì)胞中PARP-1的激活,推測(cè)這是因?yàn)榧≤张cPARP-1 的底物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸擁有部分相似的結(jié)構(gòu),因此在理論上可能具備抑制PARP-1的效果。本實(shí)驗(yàn)中給予不同劑量的肌苷后,大鼠血清以及BALF 中PARP-1 下降,p65 磷酸化及NF-κB p65 的核易位受到抑制,iNOS 含量也出現(xiàn)下降,各項(xiàng)肺損傷指標(biāo)均有所改善,提示肌苷可以通過對(duì)PARP-1 的抑制下調(diào)NFκB在肺組織中的表達(dá),從而起到肺保護(hù)的作用。

    3.4 局限性 目前臨床上ALI的標(biāo)準(zhǔn)治療手段仍是機(jī)械通氣,但考慮到使用機(jī)械通氣可能存在加重機(jī)械性肺損傷的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)可供參考的文獻(xiàn)較少,在相關(guān)參數(shù)的選擇上難度較高,因此在本研究中并未聯(lián)合機(jī)械通氣進(jìn)行治療。在后續(xù)的研究中,可以嘗試在機(jī)械通氣的基礎(chǔ)上使用肌苷對(duì)ALI 進(jìn)行干預(yù),為肌苷治療ALI提供更加有力的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

    綜上所述,肌苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的大鼠ALI 具有一定的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與下調(diào)TLR4/MYD88/NF-κB信號(hào)通路,抑制PARP-1活性,減少NF-κB核易位相關(guān)。這有望為ALI的臨床藥物治療提供更多的參考,但其具體機(jī)制以及適用性仍需進(jìn)一步研究。

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