雷向宏,嚴(yán)文君,熊梅梅,龍海波,陳斯佳
慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD)嚴(yán)重危害人類健康,發(fā)展至終末期可出現(xiàn)多種嚴(yán)重并發(fā)癥,是死亡的主要原因。2016 年,慢性腎臟病在全球死亡原因中排名第16位,預(yù)計(jì)到2040年將上升到第5位[1]。隨著人口老齡化及飲食結(jié)構(gòu)的改變,糖尿病、高血壓患病人群日益增加,自1990年以來,全球CKD 的全年齡患病率增加了29.3%,2017 年全球CKD患者人數(shù)達(dá)6.975億,全球患病率9.1%;中國患病人數(shù)達(dá)1.323 億,因此CKD 防治已成為全世界共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[2]。由于CKD尚無有效的根治方法,對其發(fā)病機(jī)制及干預(yù)靶點(diǎn)的研究成為當(dāng)前熱點(diǎn)。CKD 的一個(gè)重要特征是持續(xù)的腎臟炎癥狀態(tài),并漸進(jìn)性發(fā)展至腎纖維化。已知核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體能夠調(diào)節(jié)腎臟炎癥及腎纖維化[3]。含笑內(nèi)酯(micheliolide,MCL)是以小白菊內(nèi)酯為原料加工合成的具有抗炎及抗腫瘤作用的愈創(chuàng)木倍半萜內(nèi)酯類化合物。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)MCL 可抑制脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞核因子(NF)-κB 通路和NLRP3 炎癥小體通路的活化,從而改善腎小管細(xì)胞炎癥[4]。本研究以單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠為研究對象,研究MCL對UUO 小鼠腎組織NLRP3 炎癥小體活化和相關(guān)炎性因子及腎臟病理損傷的影響,探討其抗腎纖維化機(jī)制。
1.1 動物 SPF 級7 周齡雄性C57BL/6J 小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0004,體質(zhì)量20~25 g,普通飼料飼養(yǎng),溫度20~26 ℃,濕度40%~70%。
1.2 主要試劑 MCL 衍生物二甲胺基含笑內(nèi)酯富馬酸鹽(dimethylaminomicheliolide,DMAMCL)購自天津尚德緣藥業(yè)科技股份有限公司。DMAMCL 溶液配制:稱取DMAMCL 粉末8.0 mg溶解于3.2 mL生理鹽水,終濃度2.5 g/L。BCA蛋白定量試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,預(yù)染蛋白Marker 購自美國Thermo 公司,PVDF 膜購自美國Millipore 公司;兔源一抗NLRP3、胱天蛋白酶(caspase)-1、白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α 和磷酸化的NFκB p65(p-NF-κB p65)等抗體均購自美國Affinity公司,兔源一抗NF-κB p65 購自美國Proteintech 公司;鼠源一抗GAPDH、β-actin、山羊抗鼠IgG(H+L)和山羊抗兔IgG(H+L)購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司;HE 染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;Masson三色染色液購自武漢賽維爾生物科技有限公司;TUNEL檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司;超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 動物模型制備 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)(Sham)組、UUO 組、UUO+MCL(給藥)組,每組6 只。Sham 組將小鼠左側(cè)輸尿管暴露游離,但不結(jié)扎;UUO 組和UUO+MCL 組將小鼠左側(cè)輸尿管暴露游離,用5-0絲線對左側(cè)輸尿管上端進(jìn)行雙結(jié)扎;分層縫合好腹部切口,碘伏消毒。術(shù)后腹腔內(nèi)注射10 萬U 青霉素。UUO+MCL 組小鼠造模前1 d起予以藥物干預(yù),25 mg/kg MCL 每日灌胃0.5 mL,連續(xù)8 d。Sham 組給予等體積生理鹽水灌胃。術(shù)后7 d終止實(shí)驗(yàn),末次給藥24 h 后腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠,用4 ℃預(yù)冷的PBS經(jīng)心臟灌注小鼠全身各臟器,待腎臟顏色變白后,用剪刀迅速摘取腎臟。部分腎組織置于凍存管中迅速放入-80 ℃冰箱中保存用于提取蛋白,留取部分腎組織固定于4%多聚甲醛24 h,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片。實(shí)驗(yàn)流程見圖1。
Fig.1 Schematic diagram of animal experiment design圖1 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖
1.3.2 HE染色觀察小鼠腎組織病理變化 小鼠腎組織塊固定于4%多聚甲醛24 h后,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,切成4 μm切片,放入載玻片上。將腎組織切片,脫蠟水化,HE染色,脫水透明,風(fēng)干后中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察并拍照。
1.3.3 Masson 染色觀察小鼠腎組織腎纖維化情況 石蠟切片脫蠟,經(jīng)核染液染色,1%鹽酸乙醇分化;麗春紅染色;1%磷鉬酸溶液分化;2.5%苯胺藍(lán)溶液復(fù)染;1%冰醋酸分化后,脫水晾干,封片后置于顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J軟件圖像分析計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF),即膠原陽性的面積與組織總面積的百分比,膠原纖維顯示為藍(lán)色。
1.3.4 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 腎組織切片于二甲苯脫蠟后,梯度乙醇水化,將切片置入濕盒。滴加胃蛋白酶,37 ℃反應(yīng)30 min。PBS洗滌后滴加足量TUNEL檢測液,37 ℃避光孵育2 h,洗滌后滴加DAPI 染核。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,置于熒光顯微鏡下觀察并拍照,陽性細(xì)胞核為紅色,使用Image J軟件計(jì)算各視野下陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算其細(xì)胞凋亡率。
1.3.5 免疫組化染色檢測NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α、NF-κB p65蛋白表達(dá) 石蠟切片烤片、脫蠟水化后置于修復(fù)盒中。加入抗原修復(fù)液檸檬酸緩沖液,高壓鍋內(nèi)加熱抗原修復(fù)。經(jīng)3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,5%BSA 滴于載玻片上封閉非特異性蛋白后,滴加足量的稀釋好的一抗NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α、NF-κB p65,置于濕盒中4 ℃孵育過夜。次日漂洗孵育二抗后,PBS淋洗,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,自來水沖洗,最后封片、鏡檢。陽性反應(yīng)組織呈棕色,使用Image J軟件分析計(jì)算各視野的平均光密度值。
1.3.6 Western blot 檢測NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá) 稱取適量腎組織樣本,加入裂解液,放入組織研磨儀內(nèi)研磨后,離心取上清液,用BCA法檢測蛋白濃度并配平。95 ℃煮沸5 min 使蛋白變性。配制SDSPAGE 膠,電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜;用5%脫脂奶粉封閉2 h,NLRP3(1∶500)、caspase-1(1∶500)、IL-1β(1∶500)、TNF-α(1∶500)、p-NF-κB p65(1∶500)、GAPDH(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)一抗4 ℃冰箱孵育過夜;用TBST洗膜3次,PVDF膜孵育二抗2 h后,TBST洗膜3次,用發(fā)光液浸濕PVDF膜后顯影成像。使用Image J 軟件計(jì)算條帶與內(nèi)參的灰度比值。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Tukey檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 HE 染色結(jié)果 Sham 組小鼠腎組織無明顯病變,未見腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤及纖維組織增生性改變。UUO 組腎小管進(jìn)行性擴(kuò)張,間質(zhì)水腫伴有少量的炎性細(xì)胞浸潤。UUO+MCL 組腎組織病變程度較UUO組明顯好轉(zhuǎn)。見圖2。
Fig.2 HE staining Results of renal tissue in each group(×400)圖2 各組腎組織HE染色結(jié)果(×400)
2.2 Masson 染色結(jié)果 Sham 組、UUO 組、UUO+MCL 組CVF(%)分別為2.613±1.358、8.335±2.388 和1.958±0.784(n=6,F(xiàn)=27.133,P<0.01),與Sham 組相比,UUO 組膠原容積分?jǐn)?shù)增加(P<0.05),腎小管擴(kuò)張,腎間質(zhì)寬度增加。UUO+MCL 組膠原容積分?jǐn)?shù)較UUO組減少(P<0.05)。見圖3。
Fig.3 Masson staining Results of kidney tissue in each group(×400)圖3 各組腎組織Masson染色結(jié)果(×400)
2.3 TUNEL 染色結(jié)果 Sham 組、UUO 組、UUO+MCL 組的細(xì)胞凋亡率(%)分別為1.056±0.929、11.037±2.736 和3.611±2.284(n=6,F(xiàn)=35.675,P<0.01),與Sham組相比,UUO組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。與UUO 組相比,UUO+MCL組凋亡率明顯下降(P<0.01)。見圖4。
Fig.4 TUNEL staining Results of kidney tissue in each group(×400)圖4 各組腎組織TUNEL染色結(jié)果(×400)
2.4 免疫組化染色結(jié)果 與Sham 組相比,UUO 組腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);UUO+MCL 組與UUO 組相比,NLRP3、caspase-1、IL-1β 和TNF-ɑ 表達(dá)水平下降(P<0.05)。見圖5、表1。
Tab.1 Comparison of the expression levels of NLRP3,caspase-1,IL-1β and TNF-α proteins in renal tissue between the three groups表1 各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平比較(n=6,xˉ±s)
Fig.5 Immunohistochemical Results of of NLRP3,caspase-1,IL-1β and TNF-ɑ in renal tissue(×400)圖5 各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α免疫組化結(jié)果(×400)
2.5 各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α蛋白印跡結(jié)果 與Sham 組相比,UUO 組腎組織中NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α的表達(dá)水平均升高(P<0.05);UUO+MCL 組較UUO 組NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α均下降(P<0.05)。見圖6、表2。
Tab.2 Comparison of expression levels of NLRP3,caspase-1,IL-1β and TNF-α proteins in renal tissue between the three groups表2 各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平比較(n=6,xˉ±s)
Fig.6 The expression levels of NLRP3,caspase-1,IL-1β and TNF-α proteins in renal tissue of each group detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測各組腎組織NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)情況
2.6 各組腎組織NF-κB p65 的免疫組化染色和p-NF-κB p65蛋白免疫印跡結(jié)果 Sham組、UUO 組和UUO+MCL 組NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平分別為0.043±0.007、0.162±0.012 和0.061±0.008(n=6,F(xiàn)=283.885,P<0.01),與Sham 組相比,UUO 組NF-κB p65 蛋白表達(dá)量上升(P<0.05)。與UUO 組相比,UUO+MCL 組NF-κB p65 蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)。見圖7。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,Sham 組、UUO組和UUO+MCL組p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平分別為0.342±0.072、0.454±0.056 和0.336±0.065(n=6,F(xiàn)=6.281,P<0.05),與Sham 組相比,UUO 組p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)量上升(P<0.05)。與UUO 組相比,UUO+MCL 組p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)。見圖8。
Fig.7 Immunohistochemical Results of NF-κB p65 in renal tissue(×400)圖7 各組腎組織NF-κB p65免疫組化結(jié)果(×400)
腎間質(zhì)炎癥和腎纖維化是終末期腎病病程進(jìn)展的重要病變[5]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)參與了腎纖維化形成的過程,上皮細(xì)胞在慢性或反復(fù)損傷的情況下分化為肌成纖維細(xì)胞,形成纖維化的疤痕組織[6]。炎性細(xì)胞或腎駐留細(xì)胞分泌的促炎和促纖維化因子,如IL-1、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β,參與了CKD 的發(fā)生和進(jìn)展。腎小管間質(zhì)炎癥是腎纖維化形成的關(guān)鍵過程。腎臟損傷后,各種促炎刺激可以激活成纖維細(xì)胞[7]。
3.1 腎臟炎癥在腎纖維化發(fā)展中的作用 本實(shí)驗(yàn)UUO 動物模型是以腎小管損傷為主要特征的腎間質(zhì)纖維化模型。輸尿管梗阻導(dǎo)致腎間質(zhì)炎癥和纖維化反應(yīng),慢性腎小管間質(zhì)性腎炎是CKD特別是梗阻性尿路疾病的主要病理改變[8]。通過調(diào)控相關(guān)因子抑制腎小管炎癥可減輕腎纖維化的嚴(yán)重程度[9-10]。本研究HE 染色及Masson 染色結(jié)果表明MCL 減輕UUO小鼠的腎間質(zhì)炎癥及腎纖維化,TUNEL染色結(jié)果表明MCL下調(diào)了UUO小鼠的腎組織的細(xì)胞凋亡。炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的傳感器,可通過損傷相關(guān)的分子模式與細(xì)胞表面Toll樣受體家族的連接而被激活,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。這個(gè)過程激活NF-κB信號通路或線粒體活性氧的產(chǎn)生并觸發(fā)炎癥小體[11]。NLRP3 炎癥小體能夠調(diào)節(jié)腎臟炎癥及腎纖維化[12]。其可被多種非微生物危險(xiǎn)信號激活。NLRP3通過富含亮氨酸的重復(fù)序列和含熱蛋白結(jié)構(gòu)域招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC),然后ASC水解pro-caspase-1。最后,活化的caspase-1 將IL-1β 和IL-18 切割成成熟形式[13]。IL-1β 和IL-18 是參與CKD 進(jìn)展的重要促炎細(xì)胞因子。Vilaysane等[12]研究發(fā)現(xiàn),在UUO小鼠模型中,NLRP3 基因敲除(NLRP3-/-)小鼠較野生型小鼠caspase-1、IL-1β 和IL-18 表達(dá)顯著降低,腎小管損傷,炎癥和纖維化明顯減少。
3.2 MCL 對腎臟炎癥及腎纖維化的作用機(jī)制探討 MCL是以NF-κB抑制劑小白菊內(nèi)酯(PTL)體外半合成的倍半萜烯內(nèi)酯化合物。小白菊內(nèi)酯是從艾菊、觀光木等藥用植物中提取而來。MCL 較PTL 具有更高的穩(wěn)定性,更低的毒性和更長的半衰期[14]。本研究使用的DMAMCL 在生理或中性條件下表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性、更低的毒性以及MCL釋放的持續(xù)性?,F(xiàn)已證明MCL具有強(qiáng)大的抗炎和抗癌作用[15],具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。MCL能通過上調(diào)腹膜間皮細(xì)胞的自噬水平有效抑制腹膜纖維化[16]。MCL能通過抑制糖尿病小鼠Mtdh 介導(dǎo)的腎臟炎癥水平改善糖尿病性腎臟疾病腎損傷[17]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)MCL可通過抑制線粒體ROS的釋放,進(jìn)一步抑制NF-κB通路及NLRP3炎癥小體的活化,改善腎小管細(xì)胞炎癥[4]。
本研究發(fā)現(xiàn),MCL可減輕UUO小鼠腎組織間質(zhì)炎癥反應(yīng)及腎纖維化,并減少腎組織細(xì)胞凋亡;免疫組化染色及免疫印跡結(jié)果顯示,MCL 干預(yù)后NLRP3、caspase-1、IL-1β 較UUO 組顯著下調(diào),表明MCL抑制UUO小鼠腎組織NLRP3炎癥小體的活化,改善了腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)。已知細(xì)胞焦亡是一種炎性細(xì)胞死亡方式,主要標(biāo)志是炎癥小體的形成、caspase的激活以及大量促炎因子的釋放。因此,筆者認(rèn)為MCL可抑制UUO小鼠腎組織的細(xì)胞焦亡。
促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的多個(gè)方面。在炎癥小體中,NF-κB 可誘導(dǎo)NLRP3和IL-1β在炎癥信號應(yīng)答中轉(zhuǎn)錄調(diào)控[11]。靜息狀態(tài)下NF-κB的異源二聚體(p65-p50)和抑制蛋白IκB 結(jié)合,以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)NF-κB 被IL-1、IL-2、TNF-α 等細(xì)胞因子刺激后,導(dǎo)致NF-κB p65磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)MCL 下調(diào)UUO 小鼠腎組織p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá),表明MCL 可通過抑制NF-κB 通路抑制UUO 小鼠腎組織間質(zhì)炎癥,在NLRP3炎癥小體活化的過程中,NF-κB 活化介導(dǎo)了NLRP3 啟動過程,因此推測MCL 通過抑制NF-κB/NLRP3 軸減輕UUO 小鼠腎間質(zhì)炎癥及纖維化。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)MCL通過下調(diào)UUO小鼠腎組織p-NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β、TNF-α表達(dá)減輕腎間質(zhì)炎癥及腎纖維化,表明MCL可能通過抑制NF-κB/NLRP3軸實(shí)現(xiàn)腎臟保護(hù)作用。這對今后MCL 在腎纖維化的防治中提供了理論依據(jù),但本研究樣本數(shù)目較少,且只選擇了術(shù)后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究,故結(jié)果具有一定局限性。今后將擴(kuò)大樣本深入研究MCL抗腎纖維化機(jī)制。