CircACTR2調(diào)節(jié)miR-23a-3p/TBL1X軸對高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞損傷的影響

黃春艷，向汨，費志醫(yī)，高琴

妊娠糖尿病是女性妊娠過程中發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的糖耐量異常疾病，高齡、肥胖是其主要致病因素［1］。妊娠糖尿病易導致胎兒畸形、早產(chǎn)、流產(chǎn)等，增加妊娠女性發(fā)生2 型糖尿病和心血管疾病的風險［2］。滋養(yǎng)層細胞在胚胎早期著床、排除代謝物和母胎物質(zhì)交換等方面發(fā)揮重要作用，其異常易引起早產(chǎn)、流產(chǎn)等［3］。因此，深入探究滋養(yǎng)層細胞損傷機制對治療妊娠糖尿病有重要意義。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）對包括妊娠期糖尿病在內(nèi)的多種代謝類疾病的增殖、凋亡和遷移等生物學進程具有調(diào)控作用［4］。有研究表明，環(huán)狀RNA 肌動蛋白相關(guān)蛋白2（circular RNA actin related protein 2，circACTR2）在妊娠糖尿病患者中過表達［5］。circRNA 可充當微小RNA（miRNA）的“海綿”來調(diào)節(jié)基因的表達。miR-23a-3p在糖尿病患者中低表達，抑制miR-23a-3p 表達可抵消白藜蘆醇對妊娠糖尿病小鼠和脂肪細胞的葡萄糖攝取和脂質(zhì)代謝的改善作用［6］。還有研究表明，轉(zhuǎn)導素β1X 連鎖蛋白（TBL1X）的異常高表達與胎盤質(zhì)量增加顯著相關(guān)［7］。而circACTR2 通過調(diào)控miR-23a-3p/TBL1X軸對高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞的影響尚不明確。因此，本研究主要探究circACTR2 對高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞的影響及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR-8/Svneo 購自美國ATCC公司。CCK-8試劑盒（R2704）購自北京康瑞納生物科技有限公司；丙二醛（MDA）檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；兔源一抗TBL1X、增殖細胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、胱天蛋白酶3（caspase-3）以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam 公司；LipofectamineTM2000 Reagent 購自美國Invitrogen 公司；circACTR2 敲低質(zhì)粒（si-circACTR2）及對照（si-NC），miR-23a-3p 抑制劑（miR-23a-3p inhibitor）及對照（inhibitor-NC）、miR-23a-3p 模擬物（miR-23a-3p mimics）及對照（mimics-NC）、circACTR2 及miR-23a-3p 引物購自廣州RiboBio公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HTR-8/Svneo 細胞置于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的穩(wěn)定環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)，定期觀察，每2 d更換1次培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%以上時，消化傳代，收集對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的HTR-8/Svneo 細胞分為NG 組（5.5 mmol/L 葡萄糖處理）、HG 組［8］（25 mmol/L 葡萄糖處理）、si-NC 組（25 mmol/L 葡萄糖+轉(zhuǎn)染si-NC）、sicircACTR2 組（25 mmol/L 葡萄糖+轉(zhuǎn)染si-circACTR2）、sicircACTR2+inhibitor-NC 組（25 mmol/L 葡萄糖+si-circACTR2和inhibitor-NC 共轉(zhuǎn)染）、si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor組（25 mmol/L 葡萄糖+si-circACTR2 和miR-23a-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染）。轉(zhuǎn)染嚴格按照Lipofectamine?2000 Transfection Reagent操作步驟進行。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測circACTR2、miR-23a-3p表達 使用Trizol 試劑提取細胞中的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，以cDNA 為模板進行擴增。引物序列：circACTR2 上游5'-TGTGCTTTCTGGAGGTACT-3'，下游5'-TGCCTCATCACCAACCATA-3' ；miR-23a-3p 上 游 5'-CAGTCTTGTCCAGTTTTC-3' ，下游5'-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTG-3' ；GAPDH 上游5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，下游5'-AAGTGGTCGTGTGTGAGGAGCAATG-3'；U6 上游5'-AACGCTTCACGAATTGCGT-3'，下游5'-CTCGCTTCGGCACACA-3'。分別以GAPDH、U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算細胞中circACTR2、miR-23a-3p的相對表達量。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖 各組細胞以1×104個/孔接種到96孔板中。分別將細胞培養(yǎng)24、48、72 h后，棄去細胞上清液，向每個孔中加入含有10 μL CCK-8溶液的100 μL完全培養(yǎng)基。孵育2 h 后，使用酶標儀檢測450 nm 處光密度（OD）值。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集各組HTR-8/Svneo細胞，以預冷的PBS 洗滌2 次，添加100 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細胞，再分別添加Annexin V-FITC 和PI 染液5 μL，充分混勻，于室溫下避光染色15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 取各組細胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，采用20 μL 移液器槍頭進行劃痕，顯微鏡下記0 h 時細胞的劃痕寬度為W0，記24 h 時細胞的劃痕寬度為W24。劃痕愈合率（%）=（W0-W24）/W0×100%。

1.2.7 MDA 水平以及LDH、SOD 活性檢測 取各組HTR-8/Svneo細胞，加入提取液，超聲破碎細胞，收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測MDA含量和LDH、SOD活性。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達 利用RIPA裂解緩沖液冰上裂解30 min提取HTR-8/Svneo 細胞總蛋白。BCA 法定量，蛋白樣品變性后每孔50 μg加載到10%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離，100 V 恒壓轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，將膜與一抗TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜，再將膜與HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育2 h，棄去液體，洗滌3 次，加入ECL 試劑觀察蛋白質(zhì)印跡，Image J 軟件評估蛋白的灰度值。通過目的蛋白與GAPDH 的灰度值比，得出其蛋白相對表達量，GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.2.9 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?分別構(gòu)建circACTR2野生型質(zhì)粒（circACTR2-WT）和突變型質(zhì)粒（circACTR2-MUT），TBL1X 野生型質(zhì)粒（TBL1X-WT）和突變型質(zhì)粒（TBL1XMUT），將其分別與mimics-NC 或miR-23a-3p mimics 共轉(zhuǎn)染于HTR-8/Svneo細胞，48 h后檢測螢光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法 Graphpad Prism 7.0 軟件用于數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料采用均值±標準差（）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。所有實驗重復6次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HTR-8/Svneo 細胞中circACTR2、miR-23a-3p 表達比較 與NG 組相比，HG 組HTR-8/Svneo細胞中circACTR2表達升高，miR-23a-3p表達降低（P＜0.05）；與HG 組、si-NC 組相比，sicircACTR2組細胞中circACTR2表達降低，miR-23a-3p 表達升高（P＜0.05）；與si-circACTR2 組、sicircACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組細胞中circACTR2 表達變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），miR-23a-3p 表達降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of expression of circACTR2 and miR-23a-3p in HTR-8/Svneo cells between the six groups表1 各組HTR-8/Svneo細胞中circACTR2、miR-23a-3p表達比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與NG 組比較，b與HG 組比較，c與si-NC 組比較，d與si-circACTR2 組比較，e 與si-circACTR2+inhibitor-NC 組比較，P＜0.05；表2—4同。

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2.2 各組HTR-8/Svneo 細胞增殖能力比較 培養(yǎng)24、48、72 h后，與NG組相比，HG組HTR-8/Svneo細胞OD450值降低（P＜0.05）；與HG 組、si-NC 組相比，si-circACTR2 組HTR-8/Svneo 細胞OD450值升高（P＜0.05）；與si-circACTR2 組、si-circACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組HTR-8/Svneo 細胞OD450值降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of proliferative ability of HTR-8/Svneo cells between the six groups表2 各組HTR-8/Svneo細胞增殖能力比較（n=6，OD450值，）

Tab.2 Comparison of proliferative ability of HTR-8/Svneo cells between the six groups表2 各組HTR-8/Svneo細胞增殖能力比較（n=6，OD450值，）

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2.3 各組HTR-8/Svneo 細胞凋亡情況比較 與NG組相比，HG 組HTR-8/Svneo 細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與HG 組、si-NC 組相比，si-circACTR2 組HTR-8/Svneo 細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與sicircACTR2 組、si-circACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組HTR-8/Svneo細胞凋亡率升高（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Comparison of HTR-8/Svneo cell apoptosis and apoptosis rate between the six groups圖1 各組HTR-8/Svneo細胞凋亡情況及凋亡率比較

2.4 各組HTR-8/Svneo 細胞遷移能力比較 與NG組相比，HG 組細胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）；與HG組、si-NC組相比，si-circACTR2組細胞劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與 si-circACTR2 組、sicircACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circNFATC3+miR-183-5p inhibitor 組細胞劃痕愈合率降低（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Comparison of HTR-8/Svneo cell migration and scratch healing rate between the six groups圖2 各組HTR-8/Svneo細胞遷移情況及其劃痕愈合率比較

2.5 各組HTR-8/Svneo 細胞MDA 水平以及LDH、SOD 活性比較 與NG 組相比，HG 組HTR-8/Svneo細胞中MDA 水平升高，LDH 活性增強，SOD 活性減弱（P＜0.05）；與HG組、si-NC 組相比，si-circACTR2組HTR-8/Svneo 細胞MDA 水平降低，LDH 活性減弱，SOD活性增強（P＜0.05）；與si-circACTR2組、sicircACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circNFATC3+miR-183-5p inhibitor組細胞MDA水平升高，LDH活性增強，SOD活性減弱（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of MDA level,LDH,SOD activities of HTR-8/Svneo cells between the six groups表3 各組HTR-8/Svneo細胞MDA水平以及LDH、SOD活性比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of MDA level,LDH,SOD activities of HTR-8/Svneo cells between the six groups表3 各組HTR-8/Svneo細胞MDA水平以及LDH、SOD活性比較（n=6，）

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2.6 各組TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3 蛋白表達水平比較 與NG 組相比，HG 組HTR-8/Svneo細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低，TBL1X、caspase-3表達升高（P＜0.05）；與HG組、si-NC 組相比，si-circACTR2 組HTR-8/Svneo 細胞PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白表達升高，TBL1X、caspase-3 表達降低（P＜0.05）；與si-circACTR2 組、si-circACTR2+inhibitor-NC 組相比，si-circACTR2+miR-23a-3p inhibitor 組HTR-8/Svneo 細胞PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達降低，TBL1X、caspase-3表達升高（P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.3 Western blot detection of TBL1X,PCNA,MMP-2,MMP-9 and caspase-3 protein expression in HTR-8/Svneo cells圖3 Western blot檢測HTR-8/Svneo細胞中TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達

Tab.4 Comparison of protein expression of TBL1X,PCNA,MMP-2,MMP-9 and caspase-3 in HTR-8/Svneo cells between the six groups表4 各組HTR-8/Svneo細胞中TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達比較 （n=6，）

Tab.4 Comparison of protein expression of TBL1X,PCNA,MMP-2,MMP-9 and caspase-3 in HTR-8/Svneo cells between the six groups表4 各組HTR-8/Svneo細胞中TBL1X、PCNA、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表達比較 （n=6，）

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2.7 雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果 Starbase 網(wǎng)站預測circACTR2與miR-23a-3p的結(jié)合位點見圖4A，miR-23a-3p 與TBL1X 的結(jié)合位點見圖5A。在circACTR2-WT 中，與轉(zhuǎn)染mimics-NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-23a-3p mimics 后細胞螢光素酶活性降低（P＜0.05），在circACTR2-MUT的細胞中螢光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4B。與轉(zhuǎn)染mimics-NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-23a-3p mimics 后，同時轉(zhuǎn)染TBL1X-WT 的細胞螢光素酶活性降低（P＜0.05），而同時轉(zhuǎn)染TBL1X-MUT 的細胞螢光素酶活性變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖5B。

Fig.4 Binding sites of circACTR2 to miR-23a-3p and Results of dualluciferase assay圖4 circACTR2與miR-23a-3p的結(jié)合位點及雙螢光素酶檢測結(jié)果

Fig.5 Binding sites of miR-23a-3p to TBL1X and Results of dualluciferase assay圖5 miR-23a-3p與TBL1X的結(jié)合位點及雙螢光素酶檢測結(jié)果

3 討論

3.1 高糖可誘導HTR-8/Svneo 細胞損傷 妊娠糖尿病是妊娠期發(fā)生的一種嚴重危害母嬰健康的疾?。?］。妊娠糖尿病發(fā)生的主要原因是糖代謝異常，高糖處理能使滋養(yǎng)層細胞的微絨毛排列紊亂，出現(xiàn)疏密不均等現(xiàn)象，促進滋養(yǎng)層細胞凋亡和氧化應激，抑制細胞增殖和遷移［10］。本研究用25 mmol/L 葡萄糖處理HTR-8/Svneo 細胞，結(jié)果表明細胞增殖和遷移能力、SOD 活性減弱，MDA 含量升高，LDH 活性、凋亡能力增強。

3.2 敲低circACTR2 可抑制高糖誘導的HTR-8/Svneo 細胞損傷 circRNA 是一類具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、表達豐富、內(nèi)源性競爭等特點的非編碼RNA，其可參與到妊娠糖尿病的多種生物學過程中［11］。有研究表明，circ_0008285 在妊娠糖尿病患者中表達顯著上調(diào)，敲低circ_0008285 促進了高糖誘導的HTR-8/Svneo細胞的增殖、侵襲和遷移［12］。而在妊娠糖尿病患者的胎盤和血漿中circ_0005243 表達顯著降低，敲低circ_0005243可抑制滋養(yǎng)層細胞的增殖和遷移能力［13］。circACTR2 在高糖誘導的HK-2 細胞中表達上調(diào)，可參與炎癥反應和細胞焦亡［14］，而孕婦血漿中circACTR2 水平升高可預測妊娠糖尿病，妊娠糖尿病患者血漿circACTR2 水平升高可預測宮內(nèi)死亡、胎兒畸形等多種不良事件［5］。本研究結(jié)果顯示，敲低circACTR2 可使HTR-8/Svneo 細胞增殖能力、PCNA、MMP-2、MMP-9 表達、SOD 活性升高，circACTR2 和caxpase-3 表達、凋亡率、MDA 含量、LDH 活性明顯降低，提示敲低circACTR2 可促進高糖誘導的HTR-8/Svneo 細胞增殖和遷移能力，抑制細胞凋亡和氧化應激。

3.3 敲低circACTR2 可通過靶向miR-23a-3p 抑制HTR-8/Svneo細胞損傷 miRNA在妊娠糖尿病進展中發(fā)揮重要作用［15］。與健康妊娠者相比，妊娠糖尿病患者血清中的miR-195-5p 表達顯著增加，miR-195-5p 可作為妊娠糖尿病的診斷生物標志物［16］。circRNA 可靶向miRNA 對妊娠糖尿病起調(diào)控作用，如circ-PNPT1 可通過直接吸附miR-889-3p 調(diào)節(jié)高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞功能障礙［17］。本研究結(jié)果顯示，敲低circACTR2 可靶向上調(diào)miR-23a-3p 表達，且抑制miR-23a-3p減弱了敲低circACTR2對HTR-8/Svneo細胞增殖和遷移能力的促進作用，增強了細胞凋亡和氧化應激。故提示敲低circACTR2可能通過上調(diào)miR-23a-3p 促進HTR-8/Svneo 細胞增殖和遷移，抑制細胞凋亡和氧化應激。

3.4 敲低circACTR2 可通過調(diào)控miR-23a-3p/TBL1X軸抑制HTR-8/Svneo細胞損傷 miRNA可通過靶向抑制其特定mRNA翻譯或促進降解來調(diào)控基因表達，從而參與細胞增殖、凋亡和遷移等多種生物學過程。有研究表明，miR-345-3p 通過靶向BAK1抑制滋養(yǎng)層細胞凋亡，促進細胞增殖和遷移［18］。本研究表明，miR-23a-3p 可靶向負調(diào)控TBL1X 表達，下調(diào)miR-23a-3p 減弱了敲低circACTR2 對TBL1X蛋白表達的抑制作用。

綜上所述，敲低circACTR2 可通過調(diào)控miR-23a-3p/TBL1X軸，進而抑制高糖誘導的滋養(yǎng)層細胞損傷，從而發(fā)揮保護作用。circACTR2/miR-23a-3p/TBL1X 軸可能成為治療妊娠糖尿病的一個新的靶點。然而本研究尚存在不足之處，僅在細胞水平上驗證了circACTR2/miR-23a-3p/TBL1X 軸對HTR-8/Svneo細胞增殖、凋亡、遷移和氧化應激的影響，后續(xù)研究將會在動物體內(nèi)進一步探索。