蔓荊子黃素調(diào)控miR-378/PRRX1軸對胃癌生物學(xué)行為的影響

張叢，馮華，黃小龍，王旋

胃癌（gastric cancer，GC）是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，也是癌癥死亡的主要原因［1］。近年來，植物提取物及其活性成分被認(rèn)為是有希望治療癌癥的候選者［2］。蔓荊子黃素（Casticin，Cas）是一種從單葉蔓荊中提取的黃酮類化合物，具有抗炎、平喘、抗血管生成和抗腫瘤活性［3］。研究表明Cas 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、遷移和增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌活性［4］。研究顯示，Cas 可抑制GC 細(xì)胞增殖［5］。然而Cas 對GC 侵襲和遷移的影響及作用機(jī)制尚未完全明確。微小RNA（microRNA，miRNA）通過與靶基因信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）結(jié)合引起靶基因mRNA 的降解或翻譯抑制，參與GC 的發(fā)生和發(fā)展［6］。此外，miRNA 也是Cas發(fā)揮抗癌活性的潛在靶點。據(jù)報道，Cas可通過上調(diào)miR-338-3p 表達(dá)促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞凋亡［7］；在肝癌中，Cas 可通過破壞DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1 和miR-148a-3p 之間的相互負(fù)調(diào)節(jié)來抑制肝癌細(xì)胞的生物活性［8］。基于以上研究，筆者推測Cas 在GC 中的抗癌活性可能與miRNA 有關(guān)。研究顯示，GC 組織中miR-378 表達(dá)下調(diào)，與GC 患者的不良預(yù)后和臨床病理特征相關(guān)；其過表達(dá)可抑制GC細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）［9］。生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，配對相關(guān)同源框1（paired related homeobox 1，PRRX1）與miR-378 存在互補(bǔ)的結(jié)合位點，是miR-378 的潛在靶基因。PRRX1 已被報道在GC 中呈高表達(dá)，可通過調(diào)控EMT 促進(jìn)GC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［10］。然而，miR-378 是否能調(diào)控PRRX1 表達(dá)介導(dǎo)Cas的抗GC活性還未可知。本研究通過觀察Cas在體外和體內(nèi)的抗癌活性，探究Cas抑制GC細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制與miR-378/PRRX1軸的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 GC 細(xì)胞系SGC-7901 購自深圳市華拓生物公司。15 只雄性BALB/c 裸鼠（SPF 級，4 周齡，體質(zhì)量18～20 g）購自常州卡文斯實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2021-0018。在（22±1）℃、50%±5%濕度、12 h 光照/12 h 黑暗的標(biāo)準(zhǔn)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本研究動物實驗經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號：L2022-（29）號。Cas（原料藥，純度≥98.9%）購自南京春秋生物工程有限公司；miR-378 小干擾RNA（siRNA）慢病毒載體、PRRX1 過表達(dá)質(zhì)粒慢病毒載體、miR-378、U6 引物序列、miR-378 模擬物（miR-378 mimics）及其陰性對照（miR-NC mimics）均由上海吉至生化科技有限公司設(shè)計合成；胎牛血清、四唑鹽（MTT）試劑盒、基質(zhì)膠、RNA 提取試劑、RIPA 裂解液均購自廈門甄準(zhǔn)生物技術(shù)有限公司；一體化miRNA 熒光定量PCR（qPCR）檢測試劑盒、兔源PRRX1、GAPDH一抗、羊抗兔二抗、雙熒光素酶檢測試劑盒均購自美國MyBioSource 公司；DMEM 培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000 試劑、化學(xué)發(fā)光試劑盒購自蘇州極創(chuàng)生物科技有限公司。酶標(biāo)儀（型號Infinite F200）、顯微鏡（型號ZEISS）、流式細(xì)胞儀（型號NanoFCM）、蛋白凝膠成像系統(tǒng)（型號GelView 1500P）均購自上海然哲儀器設(shè)備有限公司；Transwell 小室（型號4590）、qPCR儀（型號Esan-Gene 696）均購自天津本生健康科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度Cas 對SGC-7901 細(xì)胞活力的影響 SGC-7901 細(xì)胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%匯合時，使用胰蛋白酶（含乙二胺四乙酸）消化后進(jìn)行細(xì)胞傳代。采用不同濃度的Cas（0、5、10、20、40、80 μmol/L）［11］處理對數(shù)生長期的SGC-7901 細(xì)胞，依次將其標(biāo)記為Cas 0、5、10、20、40 和80 μmol/L 組，每組重復(fù)6 次，將處理后的SGC-7901 細(xì)胞（1×105個/孔）在12 孔板中傳代培養(yǎng)48 h。然后添加10 μL MTT（5 g/L），并將細(xì)胞板在37 ℃下孵育4 h。之后，將200 μL 二甲基亞砜添加到12 孔板中。最后，通過酶標(biāo)儀檢測光密度（OD）490值，計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=Cas各濃度組OD490值/Cas 0 μmol/L組OD490值×100%。

1.2.2 細(xì)胞分組及干預(yù) 將對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞分成：對照組、Cas 低濃度組、Cas 中濃度組、Cas 高濃度組、Cas高濃度+miR-378 siRNA 組、Cas 高濃度+PRRX1 組、Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1 組。對照組SGC-7901 細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基中正常培養(yǎng)不進(jìn)行干預(yù)；Cas 低、中、高濃度組分別采用10、20、40 μmol/L 的Cas 處理SGC-7901 細(xì)胞；Cas高濃度+miR-378 siRNA 組：采用40 μmol/L 的Cas 處理SGC-7901細(xì)胞，并同時轉(zhuǎn)染miR-378 siRNA慢病毒載體；Cas高濃度+PRRX1組：采用40 μmol/L 的Cas處理SGC-7901細(xì)胞，并同時轉(zhuǎn)染PRRX1 過表達(dá)質(zhì)粒慢病毒載體；Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1 組采用40 μmol/L 的Cas 處理SGC-7901細(xì)胞，并同時轉(zhuǎn)染miR-378 siRNA慢病毒載體和PRRX1過表達(dá)質(zhì)粒慢病毒載體。每組重復(fù)6次。

1.2.3 MTT法測定細(xì)胞活力 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，MTT法檢測SGC-7901細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=各處理組OD490/對照組OD490×100%。

1.2.4 集落形成實驗 各組細(xì)胞（1×103個/孔）在6孔板中培養(yǎng)2 周，使用4%多聚甲醛固定后用瑞氏-吉姆薩溶液染色。在顯微鏡下計數(shù)由至少50個細(xì)胞組成的集落。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，重懸于100 μL緩沖液中，加入5 μL Annexin V-FITC，4 ℃孵育15 min，再加入5 μL PI，4 ℃孵育5 min，洗滌后移入流式管，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Transwell 小室測定細(xì)胞侵襲能力 將具有8 μm 聚碳酸酯過濾膜的Transwell 小室上室中預(yù)涂30 μg 基質(zhì)膠，將200 μL 處理后的SGC-7901 細(xì)胞（1×105個/mL）添加到上室中，下室中添加500 μL 含20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。孵育48 h 后，用棉簽刮去Transwell 小室上表面沉降的細(xì)胞，并將沉降在下表面的細(xì)胞固定，使用結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下對下室中侵襲細(xì)胞進(jìn)行拍照并計數(shù)。

1.2.7 劃痕實驗測定細(xì)胞遷移能力 處理后的SGC-7901細(xì)胞接種到24孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上時，使用無菌1 mL移液器尖端輕輕刮擦單層細(xì)胞以形成劃痕，然后將細(xì)胞用培養(yǎng)基洗滌2 次以去除脫落的細(xì)胞，培養(yǎng)48 h。使用顯微鏡拍攝0 h 和48 h 后的劃痕照片，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.8 qPCR 檢測細(xì)胞miR-378 表達(dá)水平 處理并培養(yǎng)48 h后的SGC-7901 細(xì)胞，使用RNA 提取試劑分離總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為cDNA，使用一體化miRNA qRCR 檢測試劑盒和實時PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行qPCR。獲取循環(huán)閾值（Ct）后通過2-ΔΔCt方法來量化miR-378 表達(dá)水平。引物序列：miR-378 上游 5'-CTGCACTGGACTTGGAGTC-3' ，下游5'-GCAGGGTCCGAGGTATTA-3'；內(nèi)參U6 上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.9 蛋白印跡實驗檢測SGC-7901 細(xì)胞PRRX1 蛋白表達(dá)水平 SGC-7901 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，采用RIPA 裂解液提取SGC-7901 細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)，對蛋白進(jìn)行定量（90 μg），電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，將膜與兔源PRRX1（1∶1 090）、GAPDH（1∶1 120）一抗孵育24 h，然后與相應(yīng)的羊抗兔二抗（1∶1 970）孵育1.5 h。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒使靶向蛋白質(zhì)可視化，并通過Image J 將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)參蛋白的水平。

1.2.10 雙螢光素酶報告基因測定 構(gòu)建含有miR-378互補(bǔ)結(jié)合位點的3'-UTR PRRX1 野生型（WT）和突變型（MUT）的pmirGLO 雙螢光素酶載體，分別命名為PRRX1-WT 和PRRX1-MUT。通過Lipofectamine 2000 試劑將PRRX1-WT或PRRX1-MUT與miR-378 mimics或miR-NC mimics轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞，然后進(jìn)行雙螢光素酶報告基因分析。

1.2.11 裸鼠異種移植瘤模型實驗 將BALB/c 裸鼠分為模型組、Cas 組、Cas+miR-378 siRNA 組，每組5 只。模型組、Cas 組裸鼠接種100 μL 未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的SGC-7901 細(xì)胞（1×106個/只），Cas+miR-378 siRNA 組裸鼠接種100 μL 轉(zhuǎn)染miR-378 siRNA 的SGC-7901 細(xì)胞（1×106個/只）。在腫瘤體積達(dá)到100 mm3時，Cas 組、Cas+miR-378 siRNA 組裸鼠腹腔注射10 mg/kg 的Cas（注射體積100 μL）［12］；模型組裸鼠腹腔注射100 μL 生理鹽水；每日注射1 次，連續(xù)14 d。藥物治療結(jié)束后，處死所有裸鼠，取出腫瘤組織，計算腫瘤體積并稱質(zhì)量。腫瘤體積=長×寬2/2。將腫瘤組織勻漿，使用1.2.8中的qPCR 檢測腫瘤組織中miR-378表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Cas 對SGC-7901 細(xì)胞活力的影響 與Cas 0 μmol/L 組（100.00%±0.00%）相比，Cas 5 μmol/L 組SGC-7901 細(xì)胞活力（95.07%±4.29%）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而Cas 10、20、40、80 μmol/L組SGC-7901細(xì)胞活力呈濃度依賴性降低（分別為81.12%±7.62%、68.24%±6.53%、52.03%±5.07%、42.13%±4.85%，F(xiàn)=115.368，P＜0.05，n=6），為保證SGC-7901 細(xì)胞具有一定的存活數(shù)量以進(jìn)行后續(xù)實驗，故將10、20、40 μmol/L 的Cas 作為后續(xù)研究濃度。

2.2 各組細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量、細(xì)胞凋亡率比較 與對照組相比，Cas 低、中、高濃度組SGC-7901細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量依次降低，細(xì)胞凋亡率依次升高（P＜0.05）；與Cas 高濃度組相比，Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組和Cas 高濃度+PRRX1 組SGC-7901 細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量升高，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組相比，Cas高濃度+PRRX1組SGC-7901細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量、細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組和Cas 高濃度+PRRX1 組相比，Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1組SGC-7901細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量升高，細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖1、2，表1。

Tab.1 Comparison of SGC-7901 cell viability,colony formation number and cell apoptosis rate between the seven groups表1 各組SGC-7901細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量、細(xì)胞凋亡率比較（n=6，）

Tab.1 Comparison of SGC-7901 cell viability,colony formation number and cell apoptosis rate between the seven groups表1 各組SGC-7901細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量、細(xì)胞凋亡率比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Cas低濃度組比較，c與Cas中濃度組比較，d與Cas 高濃度組比較，e與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組比較，f與Cas高濃度+PRRX1組比較，P＜0.05。

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Fig.1 Colony formation of SGC-7901 cells in each group(Reich-Giemsa staining,×100)圖1 各組SGC-7901細(xì)胞集落形成情況（瑞氏-吉姆薩染色，×100）

Fig.2 Flow chart of SGC-7901 cell apoptosis in each group圖2 各組SGC-7901細(xì)胞凋亡流式圖

2.3 各組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較 與對照組相比，Cas低、中、高濃度組的侵襲細(xì)胞數(shù)量及劃痕愈合率依次降低（P＜0.05）；與Cas 高濃度組相比，Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組和Cas 高濃度+PRRX1 組侵襲細(xì)胞數(shù)量、劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與Cas高濃度+miR-378 siRNA 組相比，Cas 高濃度+PRRX1 組侵襲細(xì)胞數(shù)量、劃痕愈合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組和Cas 高濃度+PRRX1 組相比，Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1 組侵襲細(xì)胞數(shù)量、劃痕愈合率升高（P＜0.05）。見表2，圖3、4。

Tab.2 Comparison of the number of invasive cells and scratch healing rate of SGC-7901 cells between the seven groups表2 各組SGC-7901細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量和劃痕愈合率比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of the number of invasive cells and scratch healing rate of SGC-7901 cells between the seven groups表2 各組SGC-7901細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量和劃痕愈合率比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Cas低濃度組比較，c與Cas中濃度組比較，d與Cas 高濃度組比較，e與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組比較，f與Cas高濃度+PRRX1組比較，P＜0.05。

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Fig.3 Invasion map of SGC-7901 cells in the lower compartment of Transwell cell in each group(crystal violet staining,×200)圖3 各組Transwell小室下室中SGC-7901細(xì)胞侵襲圖（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig.4 SGC-7901 cell migration diagram of each group(×100)圖4 各組SGC-7901細(xì)胞遷移圖（×100）

2.4 各組細(xì)胞miR-378 和PRRX1 蛋白表達(dá)水平比較 與對照組相比，Cas 低、中、高濃度組SGC-7901細(xì)胞miR-378 表達(dá)水平依次升高，PRRX1 蛋白表達(dá)水平依次降低（P＜0.05）；與Cas 高濃度組相比，Cas高濃度+miR-378 siRNA 組miR-378表達(dá)水平降低，PRRX1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），Cas 高濃度+PRRX1 組miR-378 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），PRRX1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組相比，Cas 高濃度+PRRX1組miR-378表達(dá)水平升高（P＜0.05），PRRX1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Cas 高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1組miR-378表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），PRRX1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與Cas 高濃度+PRRX1 組相比，Cas高濃度+miR-378 siRNA+PRRX1 組SGC-7901 細(xì)胞miR-378 表達(dá)水平降低，PRRX1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖5、表3。

Tab.3 Comparison of miR-378 and PRRX1 protein expression levels between the seven groups of SGC-7901 cells表3 各組SGC-7901細(xì)胞miR-378和PRRX1蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of miR-378 and PRRX1 protein expression levels between the seven groups of SGC-7901 cells表3 各組SGC-7901細(xì)胞miR-378和PRRX1蛋白表達(dá)水平比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與Cas低濃度組比較，c與Cas中濃度組比較，d與Cas 高濃度組比較，e與Cas 高濃度+miR-378 siRNA 組比較，f與Cas高濃度+PRRX1組比較，P＜0.05。

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Fig.5 PRRX1 protein blotting of SGC-7901 cells in each group圖5 各組SGC-7901細(xì)胞PRRX1蛋白印跡圖

2.5 miR-378 靶向調(diào)控PRRX1 表達(dá) Starbase 和miRwalk 網(wǎng)站預(yù)測到PRRX1 的3'-UTR 區(qū)域含有miR-378特異性結(jié)合的序列，見圖6。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與miR-NC mimics和PRRX1-WT 共轉(zhuǎn)染相比，miR-378 mimics 和PRRX1-WT 共轉(zhuǎn)染熒光素酶相對活性降低（P＜0.05）；miR-NC mimics 和PRRX1-MUT 共轉(zhuǎn)染與miR-378 mimics 和PRRX1-MUT 共轉(zhuǎn)染熒光素酶相對活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

Tab.4 Comparison of relative activity of luciferase between the two groups of SGC-7901 cells表4 各組SGC-7901細(xì)胞熒光素酶相對活性比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of relative activity of luciferase between the two groups of SGC-7901 cells表4 各組SGC-7901細(xì)胞熒光素酶相對活性比較（n=6，）

＊＊P＜0.01。

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Fig.6 Nucleotide sequence of complementary binding of PRRX1 3'-UTR and miR-378 predicted by Starbase圖6 Starbase預(yù)測的PRRX1 3'-UTR與miR-378互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列

2.6 Cas在體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤活性并促進(jìn)miR-378表達(dá) 與模型組相比，Cas組裸鼠腫瘤體積、質(zhì)量降低，腫瘤組織miR-378 表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與Cas組相比，Cas+miR-378 siRNA 組腫瘤體積、質(zhì)量升高，腫瘤組織miR-378表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖7、表5。

Fig.7 Representative pictures of tumor tissue formed in xenotransplantation nude mouse models in each group圖7 各組異種移植裸鼠模型中形成的腫瘤組織代表性圖片

3 討論

3.1 Cas 可抑制SGC-7901 細(xì)胞的生物學(xué)活性 GC的標(biāo)準(zhǔn)治療包括手術(shù)、放療和化療。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的主要原因之一［1］。鑒于轉(zhuǎn)移性GC患者的臨床效果較差，故而抑制轉(zhuǎn)移對于提高生存率至關(guān)重要［13］。黃酮類化合物是一種多酚類物質(zhì)，廣泛存在于食用植物中，具有抗炎、抗病毒、抗血栓、抗菌、抗腫瘤和抗突變等作用。木犀草素是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的天然黃酮類化合物，可通過調(diào)節(jié)miRNA在GC中發(fā)揮抗腫瘤活性［14］。槲皮素可調(diào)節(jié)多種腫瘤相關(guān)的miRNAs，包括miR-16、miR-216等，阻斷腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［15-16］。Cas已被證實在多種癌癥中具有抗腫瘤活性，如口腔癌［17］、食管癌［12］和胃癌［5］等。在本研究中，Cas處理以濃度依賴性方式抑制SGC-7901 細(xì)胞增殖。在集落形成和凋亡實驗中，Cas 降低了SGC-7901 細(xì)胞的集落形成能力，提高了細(xì)胞凋亡率；這進(jìn)一步證實了Cas在體外可抑制SGC-7901 細(xì)胞的生長。此外，Cas 在裸鼠體內(nèi)可抑制移植瘤的生長。癌細(xì)胞遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［18］。在本研究中，Cas 降低了SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移能力，提示Cas在GC中具有潛在的抗癌作用。

Tab.5 Comparison of tumor volume,tumor weight and miR-378 expression level in tumor tissue ofxenotransplantation nude mice between the three groups表5 各組異種移植裸鼠模型中腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量及腫瘤組織中miR-378表達(dá)水平比較（n=5，）

Tab.5 Comparison of tumor volume,tumor weight and miR-378 expression level in tumor tissue ofxenotransplantation nude mice between the three groups表5 各組異種移植裸鼠模型中腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量及腫瘤組織中miR-378表達(dá)水平比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與模型組比較，b與Cas組比較，P＜0.05。

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3.2 Cas 通過調(diào)節(jié)miR-378/PRRX1 軸在SGC-7901細(xì)胞中發(fā)揮抗癌作用 miR-378 是一種多功能miRNA，參與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。雖然對miR-378 的研究較多，但其作用仍存在爭議。Jin等［19］研究顯示，miR-378 在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)降低，低表達(dá)的miR-378患者預(yù)后更差，且miR-378低表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展過程中充當(dāng)腫瘤抑制因子。Wang等［20］研究表明，miR-378在卵巢癌中充當(dāng)促癌因子，敲低miR-378可通過直接調(diào)控其下游靶基因，減少增殖和遷移相關(guān)蛋白來抑制血管生成和卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。而在GC 中，已被證實miR-378 充當(dāng)腫瘤抑制因子，上調(diào)其表達(dá)可通過調(diào)控其靶基因抑制GC 細(xì)胞侵襲、遷移和EMT 過程［9］。miR-378在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用的原因推測可能與腫瘤類型和其下游靶基因有關(guān)。PRRX1 是配對同源框家族的成員之一，其可通過調(diào)控多種信號通路（如轉(zhuǎn)化生長因子-β 通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白通路和Notch 通路）影響腫瘤EMT 的發(fā)生［21］。另外，PRRX1 已被證實為GC 中一種新的EMT 誘導(dǎo)劑，并且PRRX1 可能通過調(diào)節(jié)EMT 促進(jìn)GC 轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響患者預(yù)后，可作為預(yù)測或預(yù)防GC轉(zhuǎn)移的新生物指標(biāo)［10］。在本研究中，Cas 可上調(diào)SGC-7901 細(xì)胞中miR-378 表達(dá)，抑制PRRX1 表達(dá)，并且生物信息學(xué)分析和雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實PRRX1 是miR-378 的靶基因。為了進(jìn)一步驗證兩者在Cas 抗腫瘤作用中的功能，本研究在Cas處理的基礎(chǔ)上，用miR-378 siRNA 或PRRX1 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC-7901 細(xì)胞，結(jié)果顯示，下調(diào)miR-378 表達(dá)或上調(diào)PRRX1 表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)Cas 對SGC-7901 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響；且下調(diào)miR-378 表達(dá)聯(lián)合PRRX1 過表達(dá)可顯著拮抗Cas 對SGC-7901 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的抑制作用。提示Cas可能通過調(diào)節(jié)miR-378/PRRX1 軸抑制SGC-7901 細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究在體內(nèi)和體外證明了Cas 對SGC-7901 細(xì)胞的抗腫瘤活性，且證實了miR-378/PRRX1 軸可能涉及此過程，從而初步揭示了Cas 抗GC 的分子機(jī)制。這對于將Cas 開發(fā)為抗癌藥物奠定了理論基礎(chǔ)。然而，Cas 在其他GC 細(xì)胞系中是否具有相同的抗癌活性仍需進(jìn)一步探討。