PRR11和MMP9在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與臨床預(yù)后的關(guān)系

江曉珍,鄧 葵,花美玲,郭芬棻,楊玄勇,萬紅萍

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院a.病理中心; b.骨科; c.神經(jīng)外科,南昌 330006)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)最常見的腫瘤,約占所有CNS腫瘤的27%[1]。近年來,膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物檢測作為補(bǔ)充診斷依據(jù)、預(yù)測疾病預(yù)后的手段,極大推進(jìn)了原有的單純組織學(xué)分類[2]。富含脯氨酸蛋白11(PRR11)在細(xì)胞中周期性表達(dá),與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),但其與膠質(zhì)瘤組織病理學(xué)分級、IDH1突變狀態(tài)之間的關(guān)系少見報道?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)是基質(zhì)金屬蛋白酶中相對分子質(zhì)量最大的酶,以酶原的形式分泌,通過水解細(xì)胞基底膜、纖維黏連蛋白等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移[3]。本研究通過分析PRR11和MMP9在膠質(zhì)瘤石蠟組織中的表達(dá),探討它們及與膠質(zhì)瘤分子分型、臨床病理參數(shù)和患者生存預(yù)后的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn):1)經(jīng)影像學(xué)、病理明確診斷為膠質(zhì)瘤;2)初次發(fā)病、首次手術(shù)切除;3)術(shù)前未接受放、化療及其他治療;4)入組病例具有完整的臨床及病理學(xué)信息。

排除標(biāo)準(zhǔn):1)合并其他病患,如自身免疫病、血液系統(tǒng)病、血友病等;2)應(yīng)用抗凝治療或抗血小板治療;3)發(fā)生膠質(zhì)瘤前有血栓病史;4)有其他惡性腫瘤病史。

1.2 研究對象

收集2017—2019年于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的100例膠質(zhì)瘤患者臨床資料,并獲取其膠質(zhì)瘤組織(膠質(zhì)瘤組,n=100)及瘤旁腦組織(正常組,n=100)。100例患者中男52例,女44例,年齡13～78歲(中位年齡53歲)。根據(jù)第五版神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤WHO分級[4],其中IDH1突變型彌漫性星形細(xì)胞瘤45例,IDH1野生型彌漫性星形細(xì)胞瘤NOS 14例,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、IDH1野生型41例。按組織病理學(xué)分類,低級別膠質(zhì)瘤(WHO 1、2級)36例,其中1例發(fā)生1p19q雜合性缺失;高級別膠質(zhì)瘤(WHO 3、4級)64例,1p19q存在雜合性缺失1例?；颊咝g(shù)前均未接受任何藥物及放射治療,術(shù)后給予規(guī)范治療。該研究獲得南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 材料與試劑

兔抗人PRR11多克隆抗體(稀釋比例1：200)購自Abcam公司,兔抗人MMP9單克隆抗體購自福州市邁新生物技術(shù)開發(fā)公司,鼠抗人IDH1單克隆抗體購自O(shè)RIGENE公司,辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG購自上海滬峰化工有限公司,鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒購自美國Abcam公司,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.2 免疫組織化學(xué)染色

石蠟組織經(jīng)脫蠟、脫水、枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓熱修復(fù)3 min,3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min,PBS沖洗后滴加兔抗PRR11、MMP9單/多克隆抗體(1：200),鼠抗人單克隆抗體IDH1工作液,4 ℃孵育過夜,室溫孵育1 h后PBS沖洗滴加Envision廣譜二抗,37 ℃孵育30 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染。用PBS代替一抗作為陰性對照。

2.3 結(jié)果判讀

由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法判定,若意見不一致則由本科室另一位主任醫(yī)師最終判定。IDH1表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒判為陽性細(xì)胞,陽性細(xì)胞超過5%為IDH1突變陽性。p53表達(dá)于細(xì)胞核,以細(xì)胞核出現(xiàn)彌漫棕黃色或棕褐色,或不著色判為突變型;細(xì)胞核出現(xiàn)強(qiáng)弱不等著色,且散在分布判為野生型。PRR11蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì),陽性細(xì)胞描述分為無著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色。MMP9蛋白定位于細(xì)胞質(zhì),采用染色面積和強(qiáng)度雙重評分法:1)陽性細(xì)胞數(shù)所占的比例計分依據(jù),無陽性細(xì)胞為0分,<25%為1分,25%～50%為2分,>50%～75%為3分,>75%為4分。2)陽性強(qiáng)度所占的比例計分依據(jù),無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。將1)和2)評分相乘,<6分為低表達(dá),≥6分為高表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0和GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以n(%)表示,組間比較采用χ2檢驗;PRR11與MMP9表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman檢驗;采用Kaplan-Meier法計算生存率,組間生存率比較采用Log-rank檢驗;采用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響生存預(yù)后的因素,計算風(fēng)險比(HR)和95%的可信區(qū)間(95%CI)。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 2組PRR11和MMP9的表達(dá)

PRR11和MMP9的表達(dá)見圖1—2。膠質(zhì)瘤組PRR11和MMP9陽性表達(dá)率均高于正常組(χ2=47.77、χ2=82.42;P<0.01),見表1。Spearman相關(guān)分析顯示,膠質(zhì)瘤組PRR11和MMP9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.71,P<0.01),見表2。

表2 PRR11和MMP9在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性 例

A:低級別膠質(zhì)瘤蘇木精-伊紅染色;B:PRR11;C:MMP9;D:IDH1。圖1 低級別膠質(zhì)瘤組織HE形態(tài)及部分免疫組織化學(xué)表達(dá)

A:高級別膠質(zhì)瘤蘇木精-伊紅染色;B:PRR11;C:MMP9;D:IDH1。圖2 高級別膠質(zhì)瘤組織HE形態(tài)及部分免疫組織化學(xué)表達(dá)

3.2 PRR11和MMP9的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

PRR11和MMP9的表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)、腫瘤組織學(xué)分級和p53突變有關(guān)(P<0.01),與患者年齡、性別、IDH1突變狀態(tài)均未顯示相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 PRR11和MMP9蛋白與臨床病理特征的關(guān)系 例

3.3 PRR11和MMP9蛋白表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者3年總生存率的關(guān)系

100例膠質(zhì)瘤患者中PRR11陽性和陰性表達(dá)患者3年總生存率分別為32.1%和61.7%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);MMP9陽性和陰性表達(dá)患者3年總生存率分別為35.3%和59.4%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);PRR11和MMP9均陽性、單一陽性及均陰性表達(dá)的患者3年總生存率為28.0%、32.0%和65.5%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

A:PRR11陰性和陽性表達(dá)者3年總生存率;B:MMP9陰性和陽性表達(dá)者3年總生存率;C:PRR11和MMP9均陽性和陰性與單一陽性表達(dá)3年總生存率。

3.4 Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響膠質(zhì)瘤臨床預(yù)后因素

將膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)、PRR11和MMP9表達(dá)狀態(tài)納入Cox比例風(fēng)險回歸模型,分析影響膠質(zhì)瘤臨床預(yù)后的因素。結(jié)果顯示,腫瘤組織學(xué)分級、細(xì)胞增殖指數(shù)、p53突變、MMP9表達(dá)和PRR11表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后有關(guān)(P<0.05);其中腫瘤組織學(xué)分級是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立危險因素(HR=30.03,P<0.01)。見圖4、表4。

表4 膠質(zhì)瘤患者總生存率相關(guān)因素的單因素和多因素分析

A:腫瘤組織學(xué)分級;B:腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù);C:p53的狀態(tài);D:MMP9的表達(dá);E:PRR11的表達(dá)。

4 討論

PRR11位于染色體17q22,在多種實體腫瘤中異常表達(dá)[5-7],與腫瘤的臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度相關(guān)。QIAO等[8]研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞癌組織中PRR11 mRNA的表達(dá)水平明顯高于腫瘤旁組織,與腫瘤大小、TNM分期及較差的患者總生存時間相關(guān)。CHEN等[9]發(fā)現(xiàn)降低膽管細(xì)胞癌細(xì)胞內(nèi)PRR11表達(dá)水平,細(xì)胞周期進(jìn)程受阻,細(xì)胞的侵襲、遷移能力減弱。本文檢測100例膠質(zhì)瘤及瘤旁組織中PRR11的表達(dá)水平,結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤組織中PRR11陽性表達(dá)率明顯高于瘤旁組織。與膠質(zhì)瘤臨床病理特征相關(guān)性分析顯示PRR11陽性表達(dá)與腫瘤直徑、細(xì)胞增殖指數(shù)、腫瘤組織學(xué)分級及p53的突變有關(guān),與文獻(xiàn)[9]報道一致。提示PRR11可能參與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展。

ZHU等[10]研究發(fā)現(xiàn),PRR11在卵巢癌組織及細(xì)胞中表達(dá)量均升高,下調(diào)PRR11的表達(dá),細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力受抑制,且其可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)發(fā)揮上述生物學(xué)功能?；|(zhì)金屬蛋白酶家族通過降解細(xì)胞基底膜、纖維粘連蛋白等成分,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)MMP9在多種實體腫瘤中表達(dá)升高,能增強(qiáng)腫瘤患者術(shù)后轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[11-13],既往報道[14]亦顯示,MMP9陽性表達(dá)與膠質(zhì)瘤侵襲能力密切相關(guān)。故本文同樣檢測膠質(zhì)瘤及瘤旁組織中MMP9的表達(dá),結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤組織中MMP9的表達(dá)水平顯著高于瘤旁組織,并與腫瘤直徑、細(xì)胞增殖指數(shù)、腫瘤組織學(xué)分級及p53的突變有關(guān)。本文Spearman相關(guān)性分析顯示,PRR11與MMP9的表達(dá)呈正相關(guān)。PRR11、MMP9陽性表達(dá)患者的3年總生存率均低于陰性表達(dá)者,且PRR11與MMP9均呈陽性表達(dá)患者的3年總生存率最低。推測,PRR11與MMP9之間存在一定的聯(lián)系,共同促進(jìn)膠質(zhì)瘤的臨床進(jìn)展。

PRR11在多種腫瘤中異常表達(dá),甚至可以作為某些腫瘤患者預(yù)后的重要指標(biāo)。TAN等[15]檢測268例胰腺癌石蠟組織中PRR11的表達(dá),結(jié)果顯示其不但與腫瘤的分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),而且與患者預(yù)后相關(guān),PRR11陽性表達(dá)患者預(yù)后較差。本文生存分析結(jié)果亦顯示:PRR11和MMP9與膠質(zhì)瘤患者總生存時間相關(guān),是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。但COX多因素回歸模型結(jié)果顯示PRR11及MMP9并非膠質(zhì)瘤預(yù)后的獨立危險因素,這可能與納入的病例數(shù)少及隨訪時間短有關(guān)。本文為單中心研究,研究結(jié)果可能存在偏倚,兩者能否作為膠質(zhì)瘤預(yù)后的獨立危險因素需后續(xù)大規(guī)模病例研究證實。

綜上所述,膠質(zhì)瘤屬多基因突變病,致病因素很多,包括癌基因的激活、抑癌基因突變等。PRR11和MMP9在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平升高,且兩者的表達(dá)狀態(tài)密切相關(guān),對膠質(zhì)瘤的臨床進(jìn)展發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用,降低膠質(zhì)瘤患者的生存期。聯(lián)合檢測PRR11和MMP9的表達(dá)對膠質(zhì)瘤的臨床進(jìn)展有一定的預(yù)測價值。