溫光敏兩系雜交小麥雜交種純度的表型和標(biāo)記檢測(cè)比較

李宏生 李紹祥 楊忠慧 楊家李 劉琨熊世安 李富乾 郭輝 楊木軍

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，650205，云南昆明；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，650201，云南昆明；3 鎮(zhèn)雄縣種子管理站，657200，云南昭通）

雜種優(yōu)勢(shì)利用是進(jìn)一步提高作物單產(chǎn)的有效途徑之一[1-5]。小麥溫光敏兩系法具有無需保持系、恢復(fù)源廣且制種程序簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑[6-9]。兩系雜交小麥品種在示范推廣中表現(xiàn)出豐產(chǎn)、節(jié)水、抗旱和耐瘠等優(yōu)勢(shì)，尤其在中低產(chǎn)田，增產(chǎn)可達(dá)20%以上[10-12]。對(duì)雜交種進(jìn)行純度鑒定是雜交種生產(chǎn)和應(yīng)用中必不可少的環(huán)節(jié)[13]。常用的純度鑒定方法是田間種植雜交種，抽穗后對(duì)植株表型進(jìn)行檢測(cè)，該方法鑒定時(shí)間長(zhǎng)，且準(zhǔn)確性易受環(huán)境影響[14-16]。近年來，SSR 標(biāo)記已成功應(yīng)用于核心種質(zhì)基因型分析[17-19]、小麥區(qū)域試驗(yàn)品系DUS 測(cè)試[20-23]以及構(gòu)建小麥DNA 指紋圖譜[24-26]等?；跓晒鈽?biāo)記SSR 的毛細(xì)管電泳檢測(cè)法可得到目標(biāo)DNA 片段的準(zhǔn)確大小，具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確和高效等特點(diǎn)，已廣泛用于大批量品種的鑒定和指紋圖譜檢測(cè)分析[27-29]。

為探索熒光標(biāo)記SSR 在溫光敏兩系雜交小麥雜交種純度檢測(cè)中應(yīng)用的可行性，本研究對(duì)2 個(gè)溫光敏兩系組合的雜交種采用田間種植表型鑒定和熒光標(biāo)記SSR 進(jìn)行了純度分析，比較2 種方法的準(zhǔn)確性，建立快速鑒定雜交種純度的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為小麥溫光敏核不育系K64S、恢復(fù)系20Y4-5、組合K64S/20Y4-5 和K64S/MR1238的雜交種，均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供；恢復(fù)系MR1238 由綿陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育提供。不育系K64S、恢復(fù)系20Y4-5、組合K64S/20Y4-5 和K64S/MR1238 的雜交種均為春性品種，在昆明均可常年種植并正常抽穗；2 個(gè)雜交種均來自1334m2（2 畝）的小規(guī)模制種試驗(yàn)。K64S、20Y4-5 和MR1238 在昆明常年種植的株高分別為60～65cm、75～80cm 和90～95cm，雜交種的株高介于雙親之間。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料種植 試驗(yàn)材料于2021 年5 月21 日播種于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院昆明嵩明試驗(yàn)基地，該地海拔1920m，春性小麥材料全年均可種植，并可正常抽穗收獲。行長(zhǎng)1.2m，采用點(diǎn)播，株行距10cm×25cm，每個(gè)雜交種播種1500 粒，每20 行種植1 行父本和1 行母本作為表型鑒定對(duì)照。

1.2.2 田間表型鑒定 因不育系與恢復(fù)系間株高差異明顯，植株抽穗揚(yáng)花后到成熟期，以株高結(jié)合穗部性狀判斷每個(gè)單株表型，與不育系相同記為“1”，與恢復(fù)系相同記為“2”，不同于雙親的記為“3”（即為雜交種）。

1.2.3 SSR 標(biāo)記基因型鑒定 基因組DNA 提?。弘s交種及其雙親生長(zhǎng)到3 葉期，從2 個(gè)組合所有雜交種行區(qū)各隨機(jī)選574 個(gè)單株（加上2 個(gè)親本共計(jì)576 個(gè)單株，96 孔PCR 儀剛好運(yùn)行6 次）掛牌編號(hào)、取葉片，同時(shí)取對(duì)應(yīng)不育系、恢復(fù)系植株葉片，用植物基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取待檢測(cè)樣品基因組DNA；用Nanodrop one 檢測(cè)DNA 濃度，用超純水將DNA 稀釋為10ng/μL 備用。取樣的雜交種植株于抽穗后逐株記錄表型純度鑒定結(jié)果。

從行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 3749-2020 普通小麥品種純度鑒定SSR 分子標(biāo)記法》推薦的10 對(duì)引物中選取8 對(duì)引物，篩選父母本間有多態(tài)性的引物，引物信息見表1。

熒光PCR 擴(kuò)增體系10μL，包括基因組DNA 1μL、上、下游引物0.3μL、2×TaqPCR Master Mix 5μL、超純水補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，62℃～52℃退火30s，72℃延伸30s，運(yùn)行10 個(gè)循環(huán)；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，運(yùn)行25 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸20min。然后上機(jī)檢測(cè)，取3μL 熒光PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)熒光PCR 擴(kuò)增條帶是否正常，并參照標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker 將熒光PCR 產(chǎn)物稀釋至相同濃度，分別取每個(gè)稀釋后的熒光PCR 產(chǎn)物1μL 加入7μL 混有4‰Liz 500 內(nèi)標(biāo)的去離子甲酰胺，上ABI 3730XL 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

用峰圖分析軟件GeneMarker 2.0 讀取熒光PCR 擴(kuò)增片段大小。

1.3 純度鑒定

通過表型鑒定和基因型鑒定分別計(jì)算雜交種純度。計(jì)算公式如下。

田間雜交種純度（%）=表型為“3”的植株數(shù)/播種雜交種總株數(shù)×100；

分子標(biāo)記雜交種純度（%）=父母本雜合帶植株數(shù)/檢測(cè)雜交種總株數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間表型純度鑒定

組合K64S/MR1238 和K64S/20Y4-5 的雜交種分別播種1500 粒，各出苗1467 和1448 株。不育系K64S 平均株高62.3cm，變幅為61.2～63.1cm；恢復(fù)系MR1238 平均株高88.6cm，變幅為87.8～90.2cm；恢復(fù)系20Y4-5 平均株高75.6cm，變幅為74.3～76.9cm；K64S/MR1238 雜交種平均株高74.7cm，變幅為62.5～88.9cm；K64S/20Y4-5 雜交種平均株高69.3cm，變幅為62.4～74.4cm。2 個(gè)雜交種與其雙親間株高均差異明顯，以株高差異結(jié)合穗部性狀對(duì)2 個(gè)雜交種的純度進(jìn)行表型鑒定，結(jié)果見表2。

K64S/MR1238 的雜交種中偽雜交種17 株，其中8 株為不育系，9 株為恢復(fù)系MR1238，純度為98.84%。

K64S/20Y4-5 的雜交種中偽雜交種30 株，包括23 株自交不育系和7 株恢復(fù)系，純度為97.93%。

2.2 SSR 標(biāo)記篩選

8 對(duì)引物中，3 對(duì)引物在恢復(fù)系20Y4-5、MR1238與不育系K64S 間表現(xiàn)出多態(tài)性（表3，圖1），可用于2 個(gè)雜交種的純度鑒定。其中barc164在3 個(gè)親本間分別擴(kuò)增出211、199 和208bp 片段；gwm161擴(kuò)增出192、195 和174bp 片段；gwm610在2 個(gè)恢復(fù)系20Y4-5和MR1238上均分別擴(kuò)增出189、189bp片段，在不育系K64S 擴(kuò)增出193bp 片段，仍可用于純度鑒定，但如果制種中2 個(gè)組合相鄰種植，該標(biāo)記不能區(qū)分雜交種中混雜的恢復(fù)系來源。因此，3 對(duì)引物中barc164和gwm161的檢測(cè)效果更好。

圖1 3 個(gè)親本的多態(tài)性引物峰圖Fig.1 The peak spectrum of polymorphic primers of three parents

表3 親本間多態(tài)性引物篩選Table 3 Polymorphic primer screening between parents

2.3 雜交種單株基因型檢測(cè)

根據(jù)上述SSR 引物篩選結(jié)果，選擇引物barc164對(duì)2 個(gè)雜交種進(jìn)行純度檢測(cè)，并與對(duì)應(yīng)表型鑒定結(jié)果進(jìn)行比較（表4）。2 個(gè)組合雜交種隨機(jī)取樣的574 株表型鑒定純度分別為98.43%和97.74%，對(duì)應(yīng)的SSR 標(biāo)記檢測(cè)純度分別為97.73%和97.21%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩種純度間差異不顯著，χ2檢測(cè)值分別為0.55（P=0.51）和0.62（P=0.49），說明分子標(biāo)記鑒定與田間表型鑒定都可用于雜交種純度鑒定，且兩者間鑒定結(jié)果相近。574 株雜交種田間表型檢測(cè)純度分別為98.43%和97.74%，全部1467 株和1448 株雜交種的表型鑒定純度分別為98.84%和97.93%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)兩者間純度差異不顯著，χ2檢測(cè)值分別為0.55（P=0.46）和0.07（P=0.79），說明隨機(jī)取樣的574 株雜交種的表型檢測(cè)純度與全部1467 株和1448 株雜交種的表型鑒定純度相同。

表4 574 株雜交種的表型和標(biāo)記鑒定純度比較Table 4 Comparison of the purity of 574 hybrids tested by phenotype and marker identification

標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，組合K64S/MR1238 的雜交種中有13 株偽雜種，包括4 株不育系、5 株恢復(fù)系MR1238 和4 株其他基因型，其雜交種純度為97.73%（表4）。4 株其他基因型偽雜種，其基因型為224bp/208bp 雜合帶型，MR1238 的barc164帶型為199bp（表3），4 株偽雜種單株占總鑒定數(shù)（574 株）0.70%，可能來自MR1238 中雜株。

組合K64S/20Y4-5 的雜交種中有16 株偽雜種，包括9 株不育系、4 株恢復(fù)系20Y4-5 和3 株其他基因型，其雜交種純度為97.21%。3 株偽雜種基因型為199bp/208bp 雜合帶型，20Y4-5 的barc164帶型為211bp，MR1238 的barc164帶型為199bp，該組合的雜交種出現(xiàn)199bp/208bp 雜合帶型的原因可能是制種中與上一組合的父本MR1238 發(fā)生“串粉”，因2 個(gè)組合試制種時(shí)相鄰種植，用吹風(fēng)機(jī)輔助授粉時(shí)，少量MR1238 花粉越過隔離布與鄰田不育系K64S 授粉，導(dǎo)致K64S/20Y4-5 雜交種中出現(xiàn)199bp/208bp 帶型的雜交種。

3 討論

溫光敏兩系法雜交種的純度受恢復(fù)系純度、不育系純度和制種環(huán)境溫光條件的影響。雜交種純度直接影響雜種優(yōu)勢(shì)的表現(xiàn)，種子純度每下降1 個(gè)百分點(diǎn)可直接導(dǎo)致作物減產(chǎn)約1%[30]，而且純度不達(dá)標(biāo)的雜交種不能進(jìn)入市場(chǎng)銷售。因此，雜交種在種子加工前必須進(jìn)行純度檢測(cè)。

傳統(tǒng)的雜交種田間種植表型純度檢測(cè)法，需在異地或異季耗時(shí)一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)（3～4 個(gè)月），如果雙親與雜交種間表型差異較小，還會(huì)影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度。SSR 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)能夠檢測(cè)2bp 差異，分辨率較傳統(tǒng)銀染高[31-34]，本研究中也獲得相同結(jié)果，引物cfa2028 在父本20Y4-5 和母本K64S 間擴(kuò)增出275bp 和277bp 片段，因此能精準(zhǔn)鑒定雜交種在該位點(diǎn)的來源。此外，本研究篩選出3 個(gè)標(biāo)記barc164、gwm161、gwm610可用于優(yōu)勢(shì)組合K64S/MR1238 和K64S/20Y4-5 的雜交種純度檢測(cè)，其中barc164和gwm161標(biāo)記較好；不同雜交組合可能有不同的純度檢測(cè)分子標(biāo)記，需另行篩選確定。

分子標(biāo)記利用種子即可進(jìn)行基因型鑒定，進(jìn)行純度估算。小麥溫光敏兩系雜交種分子標(biāo)記檢測(cè)純度鮮有研究。為驗(yàn)證分子標(biāo)記檢測(cè)的適用性，本研究利用田間苗期取樣，表型與基因型相互對(duì)應(yīng)，從而使表型鑒定與標(biāo)記鑒定為同一材料，降低因材料不同而產(chǎn)生的隨機(jī)誤差。

本研究中2 個(gè)組合K64S/MR1238 和K64S/20Y4-5 雜交種的SSR 標(biāo)記檢測(cè)純度（97.73%和97.21%）略低于田間表型鑒定純度（98.84%和97.93%），與匡猛等[35]和李倩等[36]在棉花和茄子雜交種的純度檢測(cè)結(jié)果一致，差異原因與2 種方法對(duì)偽雜種的區(qū)分程度有關(guān)。本研究中偽雜種來自小麥溫光敏不育系自交結(jié)實(shí)和父本的機(jī)械混雜或生物學(xué)混雜，SSR 熒光標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)K64S/20Y4-5 雜交種中有3 株為母本K64S 與鄰田父本MR1238 花粉“串粉”產(chǎn)生的雜交種，雖然正季種植時(shí)2 個(gè)組合的雜交種株高相差約5cm，但在本次夏播田間種植表型鑒定中未能區(qū)分出來，加之2 個(gè)組合為同一母本，對(duì)表型鑒定有干擾，這也顯示了分子標(biāo)記檢測(cè)純度的優(yōu)點(diǎn)。同一品種或組合，在異季、異地種植時(shí)其表型與正季種植相比有一定差異，進(jìn)而影響純度鑒定結(jié)果。

本研究同時(shí)用田間種植表型鑒定和SSR 熒光標(biāo)記2 種方法對(duì)2 個(gè)溫光敏兩系雜交小麥雜交種的純度進(jìn)行了測(cè)定，2 種方法的純度鑒定結(jié)果在2 個(gè)組合上都高度一致，無明顯差異，證明SSR 熒光標(biāo)記不僅能準(zhǔn)確檢測(cè)小麥雜交種純度，還能進(jìn)一步鑒定偽雜種的來源，為制種中的防雜保純提供參考依據(jù)，因此可以替代田間種植表型鑒定法。同時(shí)該檢測(cè)方法7d 內(nèi)即可獲得純度結(jié)果，為后續(xù)種子加工、銷售或新組合參加各種試驗(yàn)提供了充足時(shí)間。

在利用SSR 熒光標(biāo)記進(jìn)行小麥雜交種純度檢測(cè)中，檢測(cè)樣本大小無疑對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。本研究中用于標(biāo)記分析的樣本數(shù)約占田間種植總株數(shù)的1/3（574 株），準(zhǔn)確鑒定純度所需最少樣本數(shù)還需進(jìn)一步研究確定。

4 結(jié)論

通過田間種植表型鑒定和標(biāo)記基因型鑒定對(duì)2 個(gè)小麥溫光敏兩系雜交種純度進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記鑒定不僅可區(qū)分雜交種中恢復(fù)系和不育系混雜，還可以區(qū)分其他恢復(fù)系花粉“串粉”等造成的偽雜種，且檢測(cè)周期短，可替代田間種植表型鑒定法。