金蕎不同器官提取物對幾種雜草種子萌發(fā)的影響及其安全性研究

歐陽屹南 劉洋 沈倫豪 任奎 趙輝 唐新科 周美亮

（1 湖南科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，411201，湖南湘潭；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，100081，北京；3 西南大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，400715，重慶）

田間雜草防治一直是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。我國1400 余種雜草中具有嚴重危害性的有130 余種，在雜草防治年投入235 億元的情況下，因雜草而造成的作物減產(chǎn)仍然高達5000萬t[1]。目前，我國農(nóng)田雜草防控方式主要為人工除草和化學(xué)除草，前者效率低，不利于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，而后者會造成嚴重的環(huán)境污染[2]。相比之下，生物除草具有高效低毒和安全可靠的特點，且能夠?qū)崿F(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，符合人與自然和諧發(fā)展的理念，在未來農(nóng)業(yè)發(fā)展中將占據(jù)重要地位[3]。

化感作用是植物產(chǎn)生和釋放的防御性代謝產(chǎn)物（化感物質(zhì)）對同種或異種植物產(chǎn)生負面影響的一種干擾機制。植物化感物質(zhì)主要為次生代謝物，其成分復(fù)雜且存在一物多效和一效多物現(xiàn)象?；凶饔米鳛橹参镞m應(yīng)環(huán)境的一種機制，作用溫和卻行之有效，并具有一定的特異性，不同的植物具有不同甚至相反的化感作用[4]。植物化感作用的研究一直是生物除草極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中，研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥對某些雜草具有一定的抑制作用，不管是輪作、間作[5-6]還是化感防治[7-8]等都表現(xiàn)出較好的效果，目前蕎麥雜草防控技術(shù)越來越成熟，應(yīng)用也越來越廣泛。其中，金蕎（Fagopyrumcymosum）表現(xiàn)出明顯的抑草作用，可能主要來源于其發(fā)達的根系、快速的生長、寬廣的空間占比和化感物質(zhì)分泌[9]。

金蕎是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（FagopyrumMill.）多年生雙子葉草本植物，是蕎麥屬中主要的野生種[10]。金蕎作為藥食兩用作物[11]，在中國及其他國家均具有悠久的種植歷史[12]。金蕎生藥及化學(xué)成分主要為一類原花色素苷類縮合型單寧混合物，還含有鞣質(zhì)類、黃酮類、苷類、甾體類、萜類、揮發(fā)油類和有機物類化合物等[13-14]。與大多數(shù)植物類似，金蕎分泌的化感物質(zhì)大多為親脂性[4]。為全面探究金蕎化感物質(zhì)對雜草的抑制效果，本研究選取低毒有機溶劑提取金蕎的活性物質(zhì)，采用MS 培養(yǎng)基法和濾紙法比較研究了金蕎根、莖、葉3 個器官的化感物質(zhì)對3 種雜草種子萌發(fā)的影響，并對其安全性進行評估[2]，為蕎麥雜草防控技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草本植物種子為擬南芥（Arabidopsis thaliana）、黑麥草（Loliumperenne）、羊茅（Festuca ovina）和波斯菊（Cosmosbipinnata）[15]，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。供試作物種子為金蕎、甜蕎（Fagopyrumesculentum）、苦蕎（Fagopyrumtataricum）、燕麥（Avenasativa）、小麥（Triticumaestivum）和大麥（Hordeumvulgare），均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 金蕎提取物的制備

取金蕎新鮮根、莖、葉洗凈，烘箱65℃處理4～5h 至恒重，使用粉碎機粉碎，過40 目篩。稱取1g 粉末，以1g:30mL 的料液比混合粉末和提取劑（蒸餾水，或75%乙醇，或75%甲醇），用50℃超聲波處理30min，4 層紗布過濾取濾液（或8000轉(zhuǎn)/min 離心5～10min 后取上清液，根據(jù)不同部位提取物適當調(diào)整離心條件），用0.22μm 濾膜抽濾，即為蕎麥提取物原液。用蒸餾水將不同種類和體積的原液定容至一定體積制成后續(xù)所需的稀釋液，并用0.22μm 針筒過濾除菌，密封避光保存?zhèn)溆肹16]。

1.3 種子處理

1.3.1 種子滅菌 擬南芥：取1/4 體積種子于2mL離心管中，加入2mL 75%乙醇持續(xù)上下顛倒10min后倒掉液體，加入2mL 無水乙醇上下顛倒滅菌10min，晾置數(shù)小時至完全干燥。苦蕎、甜蕎和雜草種子：取1/4 體積種子于50mL 離心管中，加入50mL 10%NaClO 持續(xù)上下顛倒7min 后倒掉液體，加入50mL 75%乙醇持續(xù)上下顛倒滅菌5min 后倒掉液體，加入50mL 無菌水上下顛倒洗刷數(shù)次，重復(fù)用無菌水洗刷5～6 次，倒掉液體，晾置數(shù)小時至完全干燥。燕麥、小麥和大麥種子：取1/4 體積種子于50mL 離心管中，加入1%H2O250mL 搖勻后4℃冰箱靜置過夜，在無菌超凈臺中用無菌水洗5～6次，倒掉液體，晾置數(shù)小時至完全干燥，以上均嚴格遵守無菌操作。

1.3.2 制備MS 固體培養(yǎng)基 MS 培養(yǎng)基（1L）：稱取4.43g MS 粉末（Murashige skoeg Basal Medium with Vitamin）和30g蔗糖，溶解定容至1L，用5mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至5.8～6.2，加入植物凝膠2.7g，高壓蒸汽滅菌。含稀釋液的MS 培養(yǎng)基（1L）：定容900mL，在無菌超凈臺中分別將25%、50%和100%的無菌稀釋液以1:9 的比例混合制成不同終濃度的培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿倒入25mL 培養(yǎng)基，凝固后避光常溫放置。

1.3.3 提取和處理方法 如表1 所示，為獲取合理的提取和處理方法，選取水（對照，CK）、75%乙醇及75%甲醇為溶劑，利用超聲波提取根、莖、葉的等比粉末，得到提取物，并分別以3 種溶劑和提取物為稀釋液，擬南芥為受試植物，觀察不同溶劑和濃度的金蕎提取物對擬南芥萌發(fā)的影響[16]。

表1 不同溶劑及濃度的金蕎提取物處理Table 1 Treatments of F.cymosum extract with different solvents and concentration

1.3.4 種子培養(yǎng) 每板50 粒擬南芥種子均勻播種至培養(yǎng)基中。雜草種子和作物種子均采用濾紙萌發(fā)的方法，每個培養(yǎng)皿鋪3 層滅菌濾紙，加入6mL稀釋液，其中雜草種子播種30 粒，作物種子播種20 粒。所有種子播種后均在4℃冰箱中放置48h，之后置于28℃恒溫培養(yǎng)室黑暗培養(yǎng)7d，計算每天的萌發(fā)率（germination rate），3d 時計算種子的發(fā)芽指數(shù)及化感效應(yīng)指數(shù)，7d 時計算種子的發(fā)芽率（germination percentage，GP）等指標。

計算公式如下，萌發(fā)率（%）=（第t天發(fā)芽種子數(shù)/受試種子數(shù)）×100；GP（%）=（第7 天發(fā)芽種子數(shù)/受試種子數(shù)）×100；發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）=∑(Gt/Dt)；化感效應(yīng)指數(shù)（response index，RI）=1–(C/T)，（T≥C）或RI=(T/C)–1，（T

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel Office 16 作圖，用Origin 2021 進行方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對擬南芥種子萌發(fā)的影響

如圖1 和表2 所示，2.5%、5%、10%的乙醇溶劑和10%的甲醇溶劑能完全抑制擬南芥種子萌發(fā)，發(fā)芽率均為0.00%。3 種濃度下水提物處理的擬南芥種子萌發(fā)趨勢為隨濃度的升高而降低，在1～4d存在顯著性差異，萌發(fā)化感效應(yīng)指數(shù)分別為0.58、0.13 和-0.49，但5～7d 的生長曲線和發(fā)芽率與CK基本一致，說明金蕎水提物在擬南芥萌發(fā)初期有明顯的化感作用，且呈現(xiàn)“低促高抑”的現(xiàn)象。甲醇提取物相較于甲醇對擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用更明顯，2.5%和5.0%甲醇提取物的化感效應(yīng)指數(shù)分別為-0.78 和-1.00，比較兩者的萌發(fā)曲線和生長狀況（圖1）可知，5.0%甲醇提取物對擬南芥種子萌發(fā)的抑制作用高于2.5%濃度。同時，鑒于蕎麥中絕大多數(shù)作用于植物的鞣質(zhì)類、黃酮類和苷類等化感物質(zhì)均難溶于水[14]，選取75%甲醇為溶劑，5.0%為稀釋液濃度為后續(xù)金蕎不同器官提取物的作用條件。

圖1 不同金蕎提取物處理7d 后擬南芥種子的萌發(fā)情況Fig.1 Germination of A.thaliana seeds treated with different F.cymosum extracts for seven days

表2 不同溶劑及濃度的金蕎提取物對擬南芥種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of F.cymosum extracts with different solvents and concentrations on seed germination of A.thaliana

2.2 對雜草種子萌發(fā)的影響

2.2.1 對黑麥草種子萌發(fā)的影響 如表3 和圖2 所示，水、甲醇溶液和根提取物處理的種子7d 萌發(fā)率曲線沒有顯著差異，莖和葉的甲醇提取物在種子萌發(fā)第1 天呈現(xiàn)明顯的抑制作用。其中莖甲醇提取物的萌發(fā)化感效應(yīng)指數(shù)與CK 有顯著性差異。說明5.0%金蕎莖甲醇提取物可明顯抑制黑麥草種子初期的萌發(fā)。

圖2 不同金蕎提取物處理7d 后3 種草本植物種子的萌發(fā)情況Fig.2 Germination of seeds of three herbaceous plants treated with different buckwheat extracts for seven days

表3 金蕎不同器官甲醇提取物對黑麥草種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of L.perenne

2.2.2 對羊茅種子萌發(fā)的影響 如表4 和圖2 所示，5 組處理的羊茅種子1～4d 萌發(fā)率曲線沒有顯著性差異，金蕎根、莖、葉提取物處理均呈負向的化感作用，化感效應(yīng)指數(shù)分別為-0.43、-0.33 和-0.39。但7d 的萌發(fā)率曲線中，金蕎提取物的化感效應(yīng)在5～7d 對羊茅種子萌發(fā)的影響最大，且莖提取物處理在第5 天相較于CK 有明顯的抑制作用。

表4 金蕎不同器官甲醇提取物對羊茅種子萌發(fā)的影響Table 4 Effects of methanol extracts from different organs of F.cymosum on seed germination of F.ovina

2.2.3 對波斯菊種子萌發(fā)的影響 如表5 和圖2 所示，相較于CK，甲醇和金蕎根、莖、葉甲醇提取物處理的波斯菊種子7d 的萌發(fā)率沒有顯著性差異，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)同樣沒有明顯變化。說明金蕎提取物對波斯菊種子萌發(fā)沒有明顯的化感作用。

表5 金蕎不同器官甲醇提取物對波斯菊種子萌發(fā)的影響Table 5 Effects of methanol extracts from different organs of F.cymosum on seed germination of C.bipinnata

2.3 對作物種子發(fā)芽的安全性分析

2.3.1 對甜蕎種子萌發(fā)的影響 如圖3 和表6 所示，相較于CK，甲醇和3 種金蕎提取物處理下甜蕎種子7d 的萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)均無顯著性差異。其中莖提取物處理的種子發(fā)芽指數(shù)偏低，與葉提取物處理呈現(xiàn)顯著性差異，但與CK 沒有明顯差異。故種植甜蕎時可以使用低濃度的金蕎甲醇提取物研制除草劑。根據(jù)化感效應(yīng)指數(shù)，使用的優(yōu)先級為葉提取物（0.18）＞根提取物（-0.13）＞莖提取物（-0.40）。

圖3 金蕎不同器官甲醇提取物處理7d 后5 種作物種子萌發(fā)情況Fig.3 Seed germination of five crops after seven days of treatment with methanol extracts from different F.cymosum organs

表6 金蕎不同器官甲醇提取物對甜蕎種子萌發(fā)的影響Table 6 Effects of methanol extracts from different organs of F.cymosum on seed germination of F.esculentum

2.3.2 對苦蕎種子萌發(fā)的影響 如圖3 和表7 所示，5 個處理對苦蕎種子萌發(fā)均無明顯抑制作用，其中葉提取物在第1 天呈現(xiàn)顯著的促進作用，但隨著萌發(fā)的進行萌發(fā)率差異逐漸消失。從萌發(fā)曲線、發(fā)芽率和發(fā)芽勢的對比來看，金蕎根、莖、葉的提取物在5%濃度下對苦蕎種子萌發(fā)均沒有抑制作用，故種植苦蕎時可以使用低濃度金蕎的根、莖、葉甲醇提取物研制除草劑。根據(jù)化感效應(yīng)指數(shù)，使用的優(yōu)先級為葉提取物（0.37）＞根提取物（0.02）＞莖提取物（0.00）。

表7 金蕎不同器官甲醇提取物對苦蕎種子萌發(fā)的影響Table 7 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of F.tataricum

2.3.3 對燕麥種子萌發(fā)的影響 如圖3 和表8 所示，5 個處理的燕麥種子萌發(fā)情況均基本一致，1～3d的萌發(fā)率、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均無顯著性差異，說明金蕎的根、莖、葉甲醇提取物在5.0%濃度下對燕麥種子發(fā)芽沒有明顯的抑制作用，在種植燕麥時均可用于研制除草劑。根據(jù)化感效應(yīng)指數(shù)，使用的優(yōu)先級為莖提取物（0.05）＞根提取物（0.04）＞葉提取物（-0.11）。

表8 金蕎不同器官甲醇提取物對燕麥種子萌發(fā)的影響Table 8 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of A.sativa

2.3.4 對小麥種子萌發(fā)的影響 如圖3 和表9 所示，5 個處理的小麥種子萌發(fā)情況基本一致，1～3d萌發(fā)率、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均無顯著性差異，說明金蕎的根、莖、葉甲醇提取物在5.0%的濃度下對燕麥種子發(fā)芽沒有明顯的抑制作用，在種植燕麥時均可以用于研制除草劑。根據(jù)化感效應(yīng)指數(shù)，使用的優(yōu)先級為根提取物（-0.06）＞葉提取物（-0.18）＞莖提取物（-0.22）。

表9 金蕎不同器官甲醇提取物對小麥種子萌發(fā)的影響Table 9 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of T.aestivum

2.3.5 對大麥種子萌發(fā)的影響 如圖3 和表10 所示，5 個處理的大麥種子1～3d 萌發(fā)率、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均無顯著差異。莖和葉提取物處理的大麥種子1 和2d 萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)則明顯低于CK，其中葉提取物明顯降低了大麥種子的發(fā)芽率，說明金蕎莖和葉的甲醇提取物對大麥種子的萌發(fā)有十分明顯的抑制作用。

表10 金蕎不同器官甲醇提取物對大麥種子萌發(fā)的影響Table 10 Effects of methanol extract from different organs of F.cymosum on seed germination of H.vulgare

3 討論

化感作用是植物與其他物種之間產(chǎn)生次生物質(zhì)相互影響的一種現(xiàn)象[18]，產(chǎn)生化感作用的次生物質(zhì)被稱為化感物質(zhì)[19]。許多研究指出，苦蕎秸稈還田具有良好的雜草抑制效應(yīng)及增產(chǎn)效應(yīng)[6,9,20]，與此同時，蕎麥化感物質(zhì)對許多雜草有明顯的抑制作用[21]，對金蕎提取物的抑草機制研究較少。金蕎生藥及化學(xué)成分主要為一類原花色素苷類縮合型單寧混合物[13-14]，與苦蕎抑制雜草的化感物質(zhì)十分相似[22-25]。大多數(shù)脂溶性溶劑對植物具有一定的毒性，為了排除有機溶劑本身對雜草種子萌發(fā)的干擾，本研究以擬南芥為受試植物初步確定了金蕎活性物質(zhì)發(fā)揮化感作用的最佳條件，即75%甲醇為提取溶劑，5.0%為作用濃度，研究金蕎有機溶劑提取物對黑麥草、羊茅和波斯菊3 種雜草種子萌發(fā)的影響。

植物不同器官中化感物質(zhì)的種類和含量分布差異較大，研究化感物質(zhì)在植物體中的分布對生物除草劑的開發(fā)和利用具有重要意義[26]。本研究提取了金蕎根、莖、葉3 個器官的活性物質(zhì)，探究它們對3 種雜草種子萌發(fā)趨勢和發(fā)芽率的影響，發(fā)現(xiàn)提取物對單子葉雜草黑麥草和羊茅的種子萌發(fā)有明顯抑制作用，能不同程度地改變其萌發(fā)曲線，降低萌發(fā)率，而對雙子葉雜草波斯菊種子萌發(fā)的影響十分有限。據(jù)此推測，金蕎化感物質(zhì)可能對單子葉草本植物有抑制特異性。

除化感物質(zhì)的影響外，植物間還存在生長空間和資源的競爭[16]。在對金蕎抑草機制分析中同樣需考慮化感物質(zhì)和植物競爭的協(xié)同作用。本研究中，金蕎3 種器官的甲醇提取物對雜草種子的抑制作用主要表現(xiàn)在萌發(fā)初期，但對種子培養(yǎng)7d 的發(fā)芽率影響不大。由此推測，金蕎含有的化感物質(zhì)雖然不能完全抑制雜草種子的萌發(fā)，但可能通過延緩雜草種子初期的萌發(fā)，幫助金蕎在生長早期取得競爭優(yōu)勢，從而進一步抑制雜草生長。

4 結(jié)論

金蕎莖5.0%甲醇提取物對黑麥草和羊茅種子萌發(fā)有明顯抑制作用，可用于黑麥草和羊茅除草劑的研究；金蕎5.0%甲醇提取物對甜蕎、苦蕎、燕麥和小麥種子萌發(fā)均沒有顯著影響，可作為生物除草材料應(yīng)用。