NR1D1介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的PASMCs異常增殖和遷移*

白焰平， 王明亮， 甘雪晴， 孫雄山， 趙嘉琪， 陳杰

NR1D1介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的PASMCs異常增殖和遷移*

白焰平1， 王明亮2， 甘雪晴2， 孫雄山2， 趙嘉琪3△， 陳杰4△

（1西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院燒傷科，四川 成都 610083；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科，四川 成都 610083；3西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；4西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心臟外科，四川 成都 610083）

探討核受體亞家族1 D組成員1（NR1D1）在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖和遷移中的作用及機(jī)制。使用過(guò)表達(dá)腺病毒（Ad-Nr1d1）外源性轉(zhuǎn)染PASMCs，然后通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)分析各組NR1D1、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mTORC1）的下游經(jīng)典蛋白S6和4EBP1的磷酸化改變，使用Ki-67免疫熒光染色分析細(xì)胞增殖能力改變，使用Transwell實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力改變。通過(guò)胰島素恢復(fù)降低的mTORC1活性后，進(jìn)一步分析各組細(xì)胞增殖、遷移能力變化是否被逆轉(zhuǎn)。體外Ad-Nr1d1轉(zhuǎn)染PASMCs后，NR1D1表達(dá)明顯上調(diào)，低氧所致的PASMCs增殖、遷移和S6、4EBP1磷酸化都明顯受到抑制。而利用胰島素恢復(fù)降低的mTORC1活性后，過(guò)表達(dá)對(duì)PASMCs增殖和遷移的抑制作用明顯減弱。NR1D1可通過(guò)降低mTORC1活性抑制低氧所致PASMCs異常增殖和遷移。

NR1D1蛋白；肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

動(dòng)脈型肺動(dòng)脈高壓（pulmonary arterial hypertension， PAH）的主要病理機(jī)制是肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈異常收縮，最終導(dǎo)致右心衰竭甚至猝死［1-2］。在PAH各種致病因素中，關(guān)鍵因素是缺氧和低氧［3］，該因素會(huì)刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cells， PASMCs）異常遷移和增殖，最終導(dǎo)致血管腔狹窄甚至徹底閉塞，造成PAH［4］。盡管目前有藥物能延緩PAH進(jìn)展過(guò)程，但PAH臨床預(yù)后差、死亡率高等問(wèn)題仍未解決。因此，探索新的調(diào)控PASMCs增殖和遷移失衡的機(jī)制迫在眉睫。

核受體亞家族1 D組成員1（nuclear receptor subfamily 1 group D member 1， NR1D1）與晝夜節(jié)律生物鐘有關(guān)，其調(diào)控作用涉及自噬和腫瘤等方面［5-6］。此外，研究發(fā)現(xiàn)NR1D1可以通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化從而增強(qiáng)血管壁巨噬細(xì)胞的抗炎功能，影響動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展［7］。而動(dòng)脈粥樣硬化與血管重構(gòu)有著相似的病理機(jī)制，尤其是血管平滑肌細(xì)胞的異常增殖和遷移在兩種病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用，提示NR1D1可能也參與調(diào)控肺血管重構(gòu)。另有研究表明NR1D1在部分腫瘤細(xì)胞中還有抗增殖特性［6］。但NR1D1是否影響PASMCs增殖和遷移尚不得知。

本文利用低氧構(gòu)建PASMCs異常增殖和遷移的體外模型，探索NR1D1在PASMCs異常增殖和遷移中的作用及相關(guān)分子機(jī)制，為探索新的藥物和靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材料和方法

1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

將36只8～10周齡的C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)在室溫下、12 h晝夜交替的動(dòng)物房中，并供應(yīng)有足夠的水和食物。所有的動(dòng)物操作實(shí)驗(yàn)均符合西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：2022EC2-ky042）。

過(guò)表達(dá)腺病毒（adenovirus carrying， Ad-Nr1d1）和對(duì)照空載體腺病毒（control adenovirus，Ad-Con）購(gòu)自中國(guó)上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司；10%胎牛血清購(gòu)自Invitrogen；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone；4'-6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride， DAPI）和增殖相關(guān)抗原Ki-67抗體購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)公司；Transwell試劑盒購(gòu)自Merck；NR1D1、p-4EBP1Thr37/46、4EBP1、p-S6Ser235/236、S6和GAPDH抗體購(gòu)自CST。

2　方法

2.1細(xì)胞分組及處理提取C57BL/6J小鼠的肺動(dòng)脈組織培養(yǎng)獲得PASMCs，分為常氧+Ad-Con組、常氧+Ad-Nr1d1組、低氧+Ad-Con組、低氧+Ad-Nr1d1組、低氧+Ad-Nr1d1+生理鹽水組和低氧+Ad-Nr1d1+胰島素組，每組復(fù)孔4個(gè)，按以上分組培養(yǎng)細(xì)胞，常氧培養(yǎng)條件為21%氧氣，低氧培養(yǎng)條件為3%氧氣，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%左右時(shí)，與Ad-Con或Ad-Nr1d1共培養(yǎng)48 h。胰島素組使用5 mg/L濃度處理24 h，其溶劑對(duì)照組用等量生理鹽水處理相同時(shí)間。

2.2Western blot實(shí)驗(yàn)蛋白裂解液法提取細(xì)胞總蛋白，利用凝膠電泳法分離不同分子量蛋白，膜電轉(zhuǎn)法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到膜， 5%胎牛血清封閉含蛋白的膜1 h。然后使用相應(yīng)抗體4 ℃過(guò)夜孵育。Ⅰ抗處理完畢后充分洗膜，接著用Ⅱ抗常溫孵育1 h。最后，用化學(xué)發(fā)光液將條帶進(jìn)行顯色曝光，最后用ImageJ定量分析蛋白條帶。

2.3免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)按以上分組的細(xì)胞懸液倒入6孔板，孔底部放一玻片，細(xì)胞培養(yǎng)處理后待細(xì)胞固定在玻片，倒掉殘余培養(yǎng)液，倒入PBS緩沖液至孔里，輕輕搖晃幾次倒掉，連續(xù)3次清洗后，滴加0.1% Triton X-100穿孔處理15 min，清洗后在室溫下血清封閉0.5 h。使用Ki-67 Ⅰ抗（1∶500）在濕箱4 ℃過(guò)夜孵育，相應(yīng)的Ⅱ抗在室溫下再避光孵育1 h。之后以DAPI染料復(fù)染細(xì)胞核5 min，熒光顯微鏡下拍照，計(jì)算Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比率。

2.4Transwell分析將以上分組處理的PASMCs細(xì)胞懸液置于Transwell培養(yǎng)板的上層小室中，將小室放到24孔板的孔中，孔內(nèi)為無(wú)血清培養(yǎng)基，接下來(lái)在常氧和低氧環(huán)境下分別持續(xù)培養(yǎng)12 h。之后，把小室內(nèi)側(cè)一面的細(xì)胞完全擦除干凈，而細(xì)胞遷移到外膜的一面使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，無(wú)菌PBS緩沖液沖洗后，將含遷移細(xì)胞的膜剪下，平放于玻璃片，使用1%結(jié)晶紫染液染色20 min，無(wú)菌水輕輕沖洗掉剩余的染液，顯微鏡下觀(guān)察檢測(cè)遷移細(xì)胞數(shù)目比例。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Graphpad Prism 6作圖，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示計(jì)量數(shù)據(jù)，兩組之間的差異用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)進(jìn)行比較，三組以上的組間差異用方差分析進(jìn)行比較，以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　Ad-Nr1d1體外轉(zhuǎn)染PASMCs后NR1D1蛋白表達(dá)水平變化

利用Ad-Nr1d1轉(zhuǎn)染PASMCs實(shí)現(xiàn)體外過(guò)表達(dá)NR1D1。Western blot結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染Ad-Con組相比，轉(zhuǎn)染Ad-Nr1d1后，NR1D1表達(dá)明顯升高（0.01），見(jiàn)圖1。

Figure 1.　Protein expression of NR1D1 in different groups. Mean±SD. n=4. ▲▲P<0.01 vs Ad-Con group.

2　Nr1d1過(guò)表達(dá)對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖的調(diào)控作用

通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低氧條件下，NR1D1表達(dá)明顯下降（0.01），見(jiàn)圖2A。通過(guò)Ki-67免疫熒光染色評(píng)估PASMCs增殖能力變化，結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比率明顯升高（0.01）；而在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的PASMCs中，與轉(zhuǎn)染Ad-Con相比，轉(zhuǎn)染Ad-Nr1d1后，Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比率顯著下降（0.01），見(jiàn)圖2B。這表明NR1D1對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs過(guò)度增殖有抑制作用。

Figure 2.　Protein expression of NR1D1 （A） and immunofluorescence staining for Ki-67 in different groups （B； ×400）. Mean±SD. n=4. △△P<0.01 vs normoxic group；**P<0.01 vs normoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group.

3　Nr1d1過(guò)表達(dá)對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs遷移的調(diào)控作用

通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)分析NR1D1對(duì)低氧所致PASMCs異常遷移的影響。結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組穿膜細(xì)胞百分比明顯升高（0.01）；而在低氧環(huán)境培養(yǎng)的PASMCs中，與轉(zhuǎn)染Ad-Con相比，轉(zhuǎn)染Ad-Nr1d1后，穿膜細(xì)胞百分比顯著下降（0.01），見(jiàn)圖3。以上表明，NR1D1能夠抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs過(guò)度遷移。

Figure 3.　Transwell assay of PASMCs in different groups （×100）. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs normoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group.

4　過(guò)表達(dá)Nr1d1對(duì)mTORC1下游效應(yīng)分子蛋白水平的調(diào)控作用

當(dāng)PASMCs受到外界刺激（如缺氧）時(shí)，細(xì)胞中mTORC1被激活，進(jìn)而磷酸化下游效應(yīng)蛋白S6和4EBP1，促進(jìn)PASMCs的增殖和遷移［8］。研究結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組PASMCs S6和4EBP1的磷酸化水平顯著增強(qiáng)（0.01）；而在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的PASMCs中，與轉(zhuǎn)染Ad-Con相比，轉(zhuǎn)染Ad-Nr1d1后，S6和4EBP1的磷酸化水平明顯降低（<0.01）。說(shuō)明NR1D1對(duì)PASMCs增殖和遷移的調(diào)控可能與mTORC1活性改變有關(guān)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.　Protein expression of mTORC1-associated proteins in different groups. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs normoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group.

5　恢復(fù)mTORC1活性對(duì)NR1D1調(diào)控PASMCs增殖的影響

為探索mTORC1活性降低是否參與過(guò)表達(dá)抑制低氧所致PASMCs異常增殖的過(guò)程，我們用胰島素恢復(fù)PASMCs中被過(guò)表達(dá)降低的mTORC1活性。結(jié)果顯示，與低氧+Ad-Nr1d1+生理鹽水組相比，低氧+Ad-Nr1d1+胰島素組中S6和4EBP1磷酸化水平明顯回升（<0.01），見(jiàn)圖5。此外Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞比率也顯著增高（<0.01），見(jiàn)圖6。說(shuō)明NR1D1通過(guò)降低mTORC1活性抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs過(guò)度增殖。

Figure 5.　Protein expression of mTORC1-associated proteins in different groups. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Nr1d1 group.

Figure 6.　Immunofluorescence staining for Ki-67 in different groups （×400）. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Nr1d1 group.

6　恢復(fù)mTORC1活性對(duì)NR1D1調(diào)控PASMCs遷移的影響

為探索mTORC1活性降低是否參與過(guò)表達(dá)抑制低氧所致PASMCs異常遷移的過(guò)程，我們使用胰島素恢復(fù)PASMCs中被過(guò)表達(dá)降低的mTORC1活性。結(jié)果顯示，與低氧+Ad-Nr1d1+生理鹽水組相比，低氧+Ad-Nr1d1+胰島素組中穿膜細(xì)胞比例顯著回升（<0.01），見(jiàn)圖7。這說(shuō)明NR1D1通過(guò)降低mTORC1活性抑制低氧引起的PASMCs遷移。

Figure 7.　Transwell assay of PASMCs in different groups （×100）. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs hypoxic+Ad-Con group；##P<0.01 vs hypoxic+Ad-Nr1d1 group.

討論

PAH致死率高，不僅發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因也多種多樣。在缺氧、低氧誘導(dǎo)下，肺血管重構(gòu)的發(fā)病過(guò)程包括肺血管內(nèi)皮功能紊亂、異常分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，打破生理?xiàng)l件下PASMCs增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，最終引起PAH［4］。因此，PASMCs作為肺動(dòng)脈壁的主要結(jié)構(gòu)成分細(xì)胞，其增殖和遷移失衡是PAH的關(guān)鍵核心事件，目前有多種分子機(jī)制參與調(diào)控該過(guò)程，如內(nèi)皮素1、缺氧誘導(dǎo)因子1等各種細(xì)胞因子［9］。

本研究揭示了NR1D1是低氧所致PASMCs異常增殖和遷移的新的調(diào)控因子，首先，我們利用腺病毒外源性過(guò)表達(dá)NR1D1后，低氧引起的PASMCs異常過(guò)度增殖和遷移被抑制；其次，過(guò)表達(dá)NR1D1抑制低氧誘導(dǎo)的mTORC1活化；最后，恢復(fù)mTORC1活性后，過(guò)表達(dá)NR1D1對(duì)低氧所致PASMCs異常增殖和遷移的抑制作用消失。以上結(jié)果顯示，NR1D1有可能成為預(yù)防和治療PAH的新靶點(diǎn)。

作為機(jī)體生物鐘的一員，NR1D1也被叫做Rev-erbα，在糖脂代謝、腫瘤和自噬調(diào)控中發(fā)揮重要作用［5-6］。NR1D1的高表達(dá)水平與多種血管事件演變相關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化病變的減輕［7］和促進(jìn)血管修復(fù)過(guò)程［10］。而NR1D1和與這些血管事件有著相似病理機(jī)制的PAH有無(wú)調(diào)控作用既往尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)NR1D1在多類(lèi)細(xì)胞中發(fā)揮抗增殖、抗遷移特性，如肺癌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞等等［11-13］。我們當(dāng)前研究也發(fā)現(xiàn)NR1D1可以抑制缺氧引起的PASMCs過(guò)度增殖和遷移，這也是NR1D1可能發(fā)揮抗PAH的機(jī)制之一。

既往研究發(fā)現(xiàn)NR1D1可在心肌細(xì)胞和肌小管中調(diào)控mTORC1活性［14-15］。mTOR是一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)形成mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合體發(fā)揮生物學(xué)特性。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如低氧等，mTORC1激活從而調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等過(guò)程［16］。此外，mTORC1的活化也與低氧所致的PASMCs過(guò)度增殖和遷移有關(guān)［8］。而NR1D1能否在PASMCs中影響mTORC1尚未知。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)低氧可誘導(dǎo)PASMCs中mTORC1下游效應(yīng)分子S6和4EBP1磷酸化增強(qiáng)，即mTORC1激活，而過(guò)表達(dá)NR1D1明顯削弱了mTORC1活化的強(qiáng)度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)胰島素恢復(fù)降低的mTORC1活性之后，NR1D1對(duì)低氧所致PASMCs增殖、遷移的抑制作用明顯減弱。因此，我們認(rèn)為NR1D1通過(guò)降低mTORC1活性從而抑制PASMCs增殖和遷移。

綜上所述，本研究證實(shí)了NR1D1可以抑制低氧誘導(dǎo)的PASMCs過(guò)度增殖和遷移，其機(jī)制與mTORC1活性降低有關(guān)。我們的研究結(jié)果為探索抗肺動(dòng)脈高壓藥物新靶點(diǎn)的研發(fā)提供了參考和理論依據(jù)。但對(duì)于NR1D1調(diào)控PASMCs具體機(jī)制的研究不夠深入，需要進(jìn)一步完善補(bǔ)充。

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NR1D1 mediates abnormal proliferation and migration of PASMCs induced by hypoxia

BAI Yanping1， WANG Mingliang2， GAN Xueqing2， SUN Xiongshan2， ZHAO Jiaqi3△， CHEN Jie4△

（1，，610083，；2，，610083，；3，，646000，；4，，610083，）

To investigate the role and mechanism of nuclear receptor subfamily 1 group D member 1 （NR1D1） in the proliferation and migration of pulmonary arterial smooth muscle cells （PASMCs）.NR1D1 was exogenously overexpressed in PASMCs through adenovirus carrying（Ad-Nr1d1） transfection. Western blot was performed to assess the protein expression of NR1D1 and the phosphorylation of classical mammaliant target of rapamycin complex 1 （mTORC1） downstream factors， S6 and 4E-binding protein 1 （4EBP1）. Immunofluorescence staining for Ki-67 and Transwell assay were performed to assess cell proliferation and migration， respectively. After mTORC1 activity was restored by insulin， the proliferation and migration of PASMCs were further assessed in each group.Transfection of PASMCs with Ad-Nr1d1 significantly increased the protein expression of NR1D1. Overexpression of NR1D1 attenuated the proliferation and migration of hypoxia-challenged PASMCs. In addition， it suppressed the phosphorylation of S6 and 4EBP1 in hypoxia-challenged PASMCs. Insulin-induced restoration of mTORC1 activity attenuated the Ad-Nr1d1-mediated inhibition of cell proliferation and migration.NR1D1 suppresses the proliferation and migration of hypoxia-challenged PASMCs by reducing mTORC1 activity.

NR1D1 protein； pulmonary arterial smooth mucle cells； cell proliferation； cell migration

R363； R543.2； R364.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.009

1000-4718（2023）09-1605-06

2023-02-27

2023-08-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 82100419）

趙嘉琪 Tel： 17716138078； E-mail： zjq950121@163.com；陳杰 Tel： 17760378037； E-mail： chenjie181213@sina.com

（責(zé)任編輯：宋延君，余小慧）