Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化地黃酵素的制備工藝及質(zhì)量評價*

何江龍,牟文榮,張童童,紀寶玉,3,裴莉昕

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,河南 鄭州 450046; 2.河南省道地藥材生態(tài)種植工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州 450046;3.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,天津 300072

地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根,具有清熱涼血、滋陰生津等功效,其化學(xué)成分主要含有環(huán)烯醚萜類、三萜類、木脂素類、黃酮類、酚酸類等[1]。地黃道地產(chǎn)區(qū)為河南焦作(古懷慶府),是著名的“四大懷藥”之一,也是六味地黃丸等諸多中成藥的要藥。地黃的炮制品被收錄于藥品及保健品目錄中,地黃相關(guān)的保健品、功能食品等較多,但地黃酵素等生物發(fā)酵制品的研究少見,以地黃為原材料,通過酵母菌和乳酸菌的雙重發(fā)酵制作酵素不但能夠解決新鮮地黃不易貯存的問題,還能縮短發(fā)酵時間提升口感[2-3],同時作為一種新型飲片的新興態(tài)勢,具有一定的研究意義和實用價值。

傳統(tǒng)酵素中含有豐富的多糖、酚酸、氨基酸、蛋白質(zhì)等活性成分,在醫(yī)療保健中應(yīng)用廣泛[4-5]。呂明珊等[6]、李相禹等[7]以總酚酸為指標,以桑葚、獼猴桃為原料進行響應(yīng)面分析得到桑葚和獼猴桃的最佳發(fā)酵工藝條件。地黃中所含的酚酸是一類含有酚環(huán)的有機酸,是廣泛存在于自然界生物體內(nèi)的天然功能性高分子化合物[8],具有極強的自由基清除能力和抗氧化功能[9-10],可延緩機體衰老、預(yù)防心血管疾病,具有抗炎、抗腫瘤、抗?jié)兊裙π11-12]。

本文以四大懷藥中的地黃為原料,在單因素實驗基礎(chǔ)上,通過研究地黃酵素發(fā)酵過程中多酚含量的變化,對影響制備地黃酵素工藝的各因素進行Box-Behnken實驗設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化,以期獲得地黃酵素發(fā)酵的最佳工藝,為新型中藥制劑地黃酵素的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑實驗材料采集于河南省焦作市沁陽陳莊村,經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為玄參科植物地黃的新鮮塊根;酵母菌:安琪酵母股份有限公司;嗜酸乳桿菌:北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;MRS瓊脂、MRS肉湯、YPD液體培養(yǎng)基、蔗糖:北京索萊寶科技有限公司。沒食子酸標準品、葡萄糖標準品:上海源葉生物科技有限公司;福林酚、茚三酮、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3:麥克林生物科技有限公司;乙腈、甲醇、磷酸:賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備潔凈工作臺SW-CJ-1FD(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);高壓蒸汽滅菌鍋 KG-AP40M(KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC);電子分析天平 FA2004N-01156(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);高速冷凍離心機JW-3021HR(安徽嘉文儀器裝備有限公司);精密臺式pH計FE28(海梅特勒-托利多儀器有限公司);多功能微孔板讀數(shù)儀VLBL0TD0(河南德信匯儀器設(shè)備有限公司)、高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

1.3 測量方法

1.3.1 地黃酵素中總酚酸的含量測定采用Folin-Ciocalteu法測定地黃酵素多酚的含量[13-14],繪制沒食子酸標準曲線。沒食子酸的濃度C (mg·L-1)與吸光值A(chǔ)的標準線性方程是y=0.005 6x+0.063 6,R2=0.999 0。結(jié)果表明沒食子酸標準溶液吸光度與其濃度在0～100 mg·L-1存在較好的線性關(guān)系。取0.10 mL地黃酵素液至1.5 mL試管中,加入10%的福林酚溶液0.50 mL,6 min后加入0.40 mL的7.5%Na2CO3,避光保存40 min后,于765 nm波長處測試樣吸光值,每只試樣重復(fù)3次,統(tǒng)計平均值,并根據(jù)回歸曲線計算發(fā)酵液中的總酚酸含量。

1.3.2 地黃酵素pH值的測定參照GB-10468-1989方法對地黃酵素樣品上清液進行檢測,每個樣品重復(fù)3次,計算平均值。檢測前,在25 ℃下將酸度計用pH 4.00、6.86、9.18的標準緩沖液進行校準。

1.3.3 地黃酵素中梓醇、地黃苷D的含量測定參考李洵等[15]采用HPLC多成分同時測定的方案,略做修繕,對地黃酵素中的梓醇及地黃苷D進行含量測定,并繪制標準曲線。梓醇的濃度C(mg·L-1)和吸光值A(chǔ)的標準線性方程為y=11 949x+1523.9,R2=0.999 5,結(jié)果表明,梓醇標準溶液的吸光度在75～2 400 mg·L-1范圍內(nèi)與濃度呈良好的線性關(guān)系;地黃苷D的濃度C(mg·L-1)和吸光值A(chǔ)的標準線性方程為y=9 901.7x-0.286 7,R2=0.999 9,結(jié)果表明,梓醇標準溶液的吸光度在7.5～300.0 mg·L-1范圍內(nèi)與濃度呈良好的線性關(guān)系。取地黃酵素液臨用前用0.22 μm微孔濾膜過濾,測量樣品的吸光值,每個樣品重復(fù)3次,計算平均值,并根據(jù)回歸曲線計算發(fā)酵液中的相對物質(zhì)含量。

1.3.4 地黃酵素中還原糖的含量測定采用DNS法對地黃酵素還原糖的含量進行測定[16-17],并繪制葡萄糖標準曲線。葡萄糖的濃度C (mg·L-1)與吸光值A(chǔ)的標準線性方程是y=1.028 6x-0.005 2,R2=0.9992。結(jié)果表明葡萄糖標準溶液吸光度與80～720 mg·L-1之間存在較好的線性關(guān)系。取地黃酵素液0.10 mL,加入DNS試劑0.20 mL 混勻,沸水水浴5 min,顯色后冷卻至室溫,加蒸餾水至 4 mL,于540 nm波長處測試樣品吸光度,每只樣品重復(fù)3次,取平均值,并根據(jù)回歸方程計算發(fā)酵液中的還原糖含量。

1.4 實驗方法

1.4.1 地黃酵素工藝流程新鮮地黃→切片烘干→打粉過篩→加水→超聲→滅菌→(菌種→活化→擴大培養(yǎng))接菌發(fā)酵→終止發(fā)酵→貯藏。

1.4.2 操作要點(1) 菌種活化及培養(yǎng)。在YPD液體培養(yǎng)基和MRS液體培養(yǎng)基分別接種上酵母菌和乳酸菌,封口后在搖床內(nèi)28 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)酵母菌,在37 ℃,100 r·min-1條件下培養(yǎng)乳酸菌,使菌株到達對數(shù)生長期。(2) 地黃酵素的制備。選取地黃供試材料,洗凈切片,烘干粉碎,過三號篩,加入適量蔗糖,調(diào)整糖度,加入40 mL水,超聲30 min后,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,以1：3的比例接種活化好的酵母菌、乳酸菌液,130 r·min-1、37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h,制備地黃發(fā)酵液。

1.4.3 單因素實驗以料液比(1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50)、發(fā)酵時間(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h)、初糖量(0.0 g、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.6 g)、發(fā)酵溫度(28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃)、酵母菌同乳酸菌接菌比例(2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5)為單因素進行實驗。見表1。

1.4.4 Box-Behnken響應(yīng)面分析采用Design-Expert 11軟件展開響應(yīng)面實驗設(shè)計。以-1,0,1代表自變量水平,以地黃發(fā)酵總酚酸含量為響應(yīng)面值進行優(yōu)化處理,進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 單因素實驗

2.1.1 初糖量對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響在發(fā)酵過程中,蔗糖為微生物生長提供碳源,地黃粉含有氨基酸和蛋白質(zhì)為微生物生長提供氮源。在氮源和碳源適宜的條件下,微生物生長繁殖速度會大大提高,從而使代謝產(chǎn)物增加[18]。隨著初糖量的增加,pH值呈現(xiàn)先減小后增加趨勢,總酚酸含量呈現(xiàn)先增加后減小趨勢。此現(xiàn)象可能由于氮源不足從而導(dǎo)致微生物代謝發(fā)生了改變。在初糖量為0.4 g時,pH值達到最低點5.11,總酚酸含量達到最高點53.09 mg·L-1,因此認為最佳初糖量在 0.4 g 左右。見圖1。

圖1 初糖量對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.1.2 接菌比例對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響酵母菌與乳酸菌作為傳統(tǒng)發(fā)酵劑,在發(fā)酵過程中主要有共生與拮抗兩種關(guān)系,直接影響著發(fā)酵液的質(zhì)量。通過調(diào)整接菌比例,一方面使發(fā)酵原料充分利用,另一方面獲得更理想的發(fā)酵產(chǎn)物[19]。隨著接菌比例增加,pH值呈現(xiàn)先增加后減小再增加趨勢,總酚酸含量呈現(xiàn)先增加后減小趨勢。此現(xiàn)象可能由于在不同發(fā)酵階段,由于酵母菌與乳酸菌拮抗和共生關(guān)系不同,從而導(dǎo)致代謝產(chǎn)物產(chǎn)生差異。在接菌比例為1：3時,pH達到最低值4.72,總酚酸含量達到最高值為64.29 mg·L-1,因此認為最佳接菌比例在1：3(酵母菌：乳酸菌=1：3)左右。見圖2。

圖2 接菌比例對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.1.3 發(fā)酵時間對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響當發(fā)酵時間較短,原料沒有被充分利用。當發(fā)酵時間過長,微生物逐漸衰亡,導(dǎo)致雜菌生長,從而影響最終代謝產(chǎn)物[20]。隨著時間增加,pH值呈現(xiàn)先降低再升高后降低的趨勢,總酚酸含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。此現(xiàn)象可能是由于發(fā)酵時間過長,導(dǎo)致微生物逐漸死亡,雜菌生長。當發(fā)酵時間在96 h時,pH達到最低值4.05,總酚酸含量達到最高值110.23 mg·L-1,因此認為最佳發(fā)酵時間應(yīng)該在96 h左右。見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.1.4 發(fā)酵溫度對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響發(fā)酵過程中,隨著溫度不斷增加,pH值呈現(xiàn)先降低然后逐漸升高趨勢,總酚酸含量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。此現(xiàn)象可能由于較低的發(fā)酵溫度可以抑制地黃酵素液中酶的活性從而減緩代謝的速度,過高的溫度也會影響酶的活性與微生物生長,甚至使酶失活[21],從而導(dǎo)致代謝產(chǎn)物減少甚至喪失。當發(fā)酵溫度在37 ℃時,pH達到最低值4.16,總酚酸含量達到最高值75.22 mg·L-1,因此認為最佳發(fā)酵溫度應(yīng)該在37 ℃。見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.1.5 料液比對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響地黃發(fā)酵隨著料液比的增加,其總酚酸含量逐漸降低,其發(fā)酵后的pH值呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢,當料液比為1：40時其pH值最低為4.64,原因可能是料液比過低時,地黃溶液濃度過高,不利于乳酸菌和酵母菌的發(fā)酵,從而使地黃酵素中pH值下降較慢,料液比過高時,地黃溶液濃度過低,使得酵素中的酚酸含量被稀釋[22],從而使pH值升高。因此料液比選在1：40左右較為合適。見圖5。

圖5 料液比對地黃酵素pH值和總酚酸含量的影響

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 模型方差分析利用Design-Expert 11軟件建立總酚酸含量的多元二次回歸響應(yīng)面模型,通過多元線性回歸和二項擬合對實驗結(jié)果進行分析,驗證回歸模型與因素的顯著性。建立的回歸模型中F值為13.88,P值<0.000 1,表明本實驗建立的回歸模型的差異極顯著;失擬項P值為0.010 7<0.05,同樣可以說明模型差異顯著。一次項中初糖量(A)和發(fā)酵溫度(D)對總酚酸含量的影響較顯著,接菌比例(B)與發(fā)酵時間(C)的影響不顯著;二次項中A2、B2和C2對總酚酸的影響均不顯著,D2對總酚酸含量的影響極顯著;交互項中AB、AC、BC、AD、CD、BD對總酚酸含量的影響均不顯著。將表3中F值的大小進行比較可得出結(jié)論:4個因素對總酚酸含量的影響程度大小為發(fā)酵溫度(D)>初糖量(A)>接菌比例(B)>發(fā)酵時間(C)。見表3。

表3 方差分析

2.2.3 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線結(jié)果分析響應(yīng)面圖可以直觀地反映出兩變量對因變量的影響程度,曲面坡度愈陡,實驗時因變量對響應(yīng)值的影響程度愈大,而當曲面坡度較小時,則說明實驗中因變量對響應(yīng)值的影響很小;等高線圖越趨向橢圓,表明兩變量之間的交互作用越顯著,等高線圖越趨向圓形,則代表兩變量之間的交互作用越小[23]。根據(jù)響應(yīng)面回歸模型所建立的初糖量(A)、接菌比例(B)、發(fā)酵時間(C)、發(fā)酵溫度(D)的交互效應(yīng)響應(yīng)面圖及等高線圖見圖6。

圖6 交互效應(yīng)響應(yīng)面圖及等高線圖

在固定因素發(fā)酵時間(C)與發(fā)酵溫度(D)的情況下,隨著初糖量(A)的增加,總酚酸含量呈現(xiàn)遞增趨勢;隨著接菌比例(B)增加,總酚酸含量呈現(xiàn)先增加后減小趨勢。在初糖量為0.45～0.50 g,接菌比例為2.0～2.5時,總酚酸含量在較高范圍內(nèi)。固定接菌比例(B)與發(fā)酵溫度(D),隨著發(fā)酵時間(C)不斷增加,總酚酸含量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢;隨著初糖量(A)增加,總酚酸含量呈現(xiàn)增加趨勢。在發(fā)酵時間為84～90 h,初糖量為0.45～0.50 g時,總酚酸含量處于較高水平。在固定接菌比例(B)與發(fā)酵時間(C)的情況下,隨著發(fā)酵溫度(D)的增加,總酚酸含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢;隨著初糖量(A)增加,總酚酸含量呈現(xiàn)增加趨勢。發(fā)酵溫度為34～36 ℃,初糖量為0.45～0.50 g時,總酚酸含量較高。固定初糖量(A)與發(fā)酵溫度(D),隨著發(fā)酵時間(C)與接菌比例(B)不斷增加,總酚酸含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。發(fā)酵時間為84～90 h,接菌比例為2.0～2.5時,總酚酸含量在較高范圍。在固定初糖量(A)與發(fā)酵時間(C)的情況下,隨著接菌比例(B)和發(fā)酵溫度(D)的增加,總酚酸含量呈現(xiàn)先增加后減少趨勢。在接菌比例為2.0～2.5,發(fā)酵溫度為34～36 ℃時,總酚酸處于較高水平。在固定接菌比例(B)和初糖量(A)的情況下,隨著發(fā)酵時間(C)和發(fā)酵溫度(D)的增加,總酚酸含量呈現(xiàn)先增加后減少趨勢。當發(fā)酵溫度為34～36 ℃,發(fā)酵時間為84～90 h時,總酚酸含量處于較高水平。

2.2.4 驗證性實驗結(jié)果與分析對回歸擬合方程進行求解,得出總酚酸含量最高時最佳條件:A=0.499 0 g,B=2.284：1,C=85.97 h,D=35.107 ℃此條件下,預(yù)測最佳總酚酸含量為81.677 mg·L-1。根據(jù)實驗和實際操作可行性,調(diào)整后的地黃酵素制備工藝條件為:初糖量為0.499 0 g,接菌比例為 2.280：1(即乳酸菌比酵母菌為456 μL：200 μL),發(fā)酵溫度為35.1 ℃,發(fā)酵時間為86 h。采用優(yōu)化后的工藝制備地黃酵素進行驗證性實驗,得到驗證性實驗結(jié)果為:總酚酸含量為83.165 mg·L-1,預(yù)期總酚酸含量為81.766 mg·L-1,同模型預(yù)測相對誤差僅為1.71%,說明響應(yīng)面法對地黃酵素制備工藝優(yōu)化的參數(shù)較為準確可靠,具有一定應(yīng)用的價值性。

2.3 地黃酵素的品質(zhì)分析

2.3.1 地黃酵素中梓醇、地黃苷D的含量通過酵母菌和乳酸菌對地黃進行發(fā)酵制得的地黃酵素,其梓醇含量為2.170%,地黃苷D含量為0.466%;參照2020版《中華人民共和國藥典》地黃中梓醇含量不少于0.20%,地黃苷D含量不少于0.10%的規(guī)定,此方法制得的地黃酵素符合要求。何偉等[24]、羅盟錡等[25]、劉秋瑾等[26]對靈芝、甘草、黃芪、板藍根進行發(fā)酵研究,均有新的發(fā)現(xiàn),可為下一步地黃新型飲片的開發(fā)提供較好的參考和實際的數(shù)據(jù)支撐。同時,目前利用微生物發(fā)酵中藥是中藥研發(fā)的新途徑,在此基礎(chǔ)上,還可拓展其在食品、保健品行業(yè)等更多領(lǐng)域的應(yīng)用范圍,具備很好的開發(fā)價值。

2.3.2 地黃酵素總酚酸含量對地黃液和地黃酵素進行總酚酸含量測定結(jié)果顯示,地黃液總酚酸含量為62.904 mg·L-1,發(fā)酵后地黃酵素總酚酸含量為83.165 mg·L-1,相對發(fā)酵前總酚酸含量提升了32.2%,這同易媛等[27]、周偏等[28]和高振鵬等[29]對桑葚酵素、諾麗酵素和蘋果酵素中酚酸含量測定的結(jié)果一致,發(fā)酵后總酚酸含量增加,分析原因可能是微生物可以將共價鍵結(jié)合的酚酸物質(zhì)降解為小分子酚酸物質(zhì),也可能是微生物使地黃中的生物活性物質(zhì)進行代謝,產(chǎn)生了新的酚類化合物,導(dǎo)致總酚酸含量升高?？偡铀峋哂锌寡趸?、防腐等作用,常作為抗氧化劑、殺菌劑應(yīng)用于果蔬保鮮,其含量的增高可使地黃酵素更易貯藏。

2.3.3 地黃酵素還原糖含量對地黃液和地黃酵素進行還原糖含量測定結(jié)果顯示,地黃液還原糖含量為376.76 mg·L-1,地黃酵素液還原糖含量為614.25 mg·L-1,比發(fā)酵前提高了63.03%;地黃經(jīng)發(fā)酵后還原糖含量增加。在此之前,易媛等[27]、劉磊等[30]和謝東東等[31]對桑葚、米糠以及不同水果進行發(fā)酵,研究發(fā)現(xiàn)還原糖含量呈不斷下降的趨勢;在胡蘿卜汁發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)多糖含量增加,還原糖含量降低,這同地黃發(fā)酵的結(jié)果相反,原因可能是發(fā)酵過程中糖類物質(zhì)被微生物不斷降解利用,導(dǎo)致還原糖含量不斷下降;也可能其在發(fā)酵過程中合成果糖基轉(zhuǎn)移酶,使單糖主要轉(zhuǎn)化為多糖,導(dǎo)致還原糖含量降低[32-33]。本實驗地黃經(jīng)發(fā)酵后還原糖含量增加,分析原因可能是不同微生物對多糖的降解效果存在顯著差異[34],也可能是由于地黃中的多糖含量較多,酵母菌和乳酸菌對地黃多糖進行降解,其代謝產(chǎn)生的各種消化酶能將多糖分解為小分子還原糖[31],最終導(dǎo)致還原糖含量增加。地黃還原糖具有補氣血的作用,且在地黃炮制后含量變化最為顯著,其含量的增高說明對地黃進行發(fā)酵處理制作酵素新型飲片具備可行性。

3 結(jié)論

筆者以“四大懷藥”中的地黃為原料,用酵母菌和乳酸菌進行發(fā)酵制備地黃酵素。在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行了4因素3水平的響應(yīng)面實驗,得出各因素對地黃酵素總酚酸含量的影響從高到低為發(fā)酵溫度>初糖量>接菌比例>發(fā)酵時間?？紤]實驗的實際性和可操作性,將地黃酵素最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為液料比40 mL：1 g、初糖量0.499 0 g、乳酸菌和酵母菌接菌比例為2.280：1、發(fā)酵時間為86 h、發(fā)酵溫度為35.1 ℃。在此條件下地黃經(jīng)發(fā)酵后,pH值由6.19降至4.33,總酚酸含量由62.904 mg·L-1升至83.165 mg·L-1,相對發(fā)酵前總酚酸含量提升了32.2%;還原糖含量由376.76 mg·L-1升至 614.25 mg·L-1,相對于發(fā)酵前還原糖含量提高了63.03%;且梓醇、地黃苷D含量均符合2020版《中華人民共和國藥典》的要求。地黃酵素含有較高的酚酸類物質(zhì)和還原糖,作為一種酵素飲品可以很好地滿足人們對營養(yǎng)的需求;含有的梓醇、地黃苷D含量符合藥用地黃標準,作為一種新型中藥制劑可以很好地滿足臨床用藥的需求。本實驗結(jié)果可為規(guī)?；苽涞攸S酵素提供一定的參考,更優(yōu)化的制備工藝及總酚酸的理化性質(zhì)均有待進一步的深入研究。