基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對接-實驗驗證的桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的作用機(jī)制研究

方歡樂，陳衍斌，張鑫，劉小溪，周亞明，杜霞（.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 705；.陜西步長制藥有限公司科研部，陜西 西安 70075；.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 7000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是誘發(fā)缺血性心臟病、心肌梗死和中風(fēng)等多種嚴(yán)重心血管疾病的病理基礎(chǔ)，危害著人類健康[1]。AS 發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，主要與脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移等相關(guān)[2-3]。目前臨床以西藥治療為主，這些藥物盡管療效確切但往往伴隨著較大的副作用[4]。近年來，中醫(yī)藥在動脈粥樣硬化的治療中凸顯出越來越重要的作用。

動脈粥樣硬化，屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“脈痹”“中風(fēng)”“厥心痛”等病證范疇。因此，中醫(yī)多從化瘀、補(bǔ)氣、祛痰、活血等來干預(yù)[5]。桃仁與紅花配伍源自《醫(yī)宗金鑒》，是活血化瘀經(jīng)典而常用的藥對之一[6]。桃仁破血祛瘀，其含有苷類、脂類、苦杏仁酶等可擴(kuò)張血管、增加器官血流量、抗血栓、促纖溶等作用[7]；紅花活血化瘀，含有紅花色素、紅花苷、肉豆蔻酸、多糖等，具有抑制血小板聚集、改善血流變、降脂等作用[8]。研究[9]顯示，桃仁∶紅花= 1∶1（占使用桃仁、紅花方劑總數(shù)的53.4%）可很好地改善心腦血管疾病。但目前關(guān)于桃仁-紅花改善AS 的作用機(jī)制研究還較少。

本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從多靶點、多角度、多途徑揭示桃仁-紅花藥對治療AS 的潛在分子機(jī)制，并通過分子對接結(jié)合動物實驗驗證桃仁-紅花藥對（1∶1）不同劑量改善AS的作用，以期為桃仁-紅花藥對的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 桃仁-紅花藥對化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫及靶標(biāo)識別采用TCMIP v2.0 平臺，在“中藥材數(shù)據(jù)庫”模塊檢索桃仁、紅花的所有化學(xué)成分，構(gòu)建桃仁-紅花藥對化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫；利用TCMIP v2.0 平臺中嵌套的MedChem Studio 軟件，基于分子相似性原理進(jìn)行靶標(biāo)識別，即將待測化合物與DrugBank 數(shù)據(jù)庫中的已知藥物進(jìn)行二維結(jié)構(gòu)相似性比較，以Tanimoto系數(shù)表征分子相似性分值，當(dāng)Tanimoto相似性≥0.8，則已知藥物的作用靶標(biāo)即作為待測化合物的作用靶標(biāo)，以此獲得桃仁-紅花所有化學(xué)成分作用的靶標(biāo)。

1.2 動脈粥樣硬化疾病靶標(biāo)收集利用TCMIP v2.0平臺“疾病相關(guān)分子庫”并結(jié)合人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（score＞1），以“atherosclerosis”為檢索關(guān)鍵詞，獲取動脈粥樣硬化相關(guān)的疾病基因信息。

1.3 干預(yù)動脈粥樣硬化潛在作用靶標(biāo)分析采用易漢博生物信息在線作圖（imageGP）平臺的VennDiagram plot 工具，將桃仁-紅花化學(xué)成分作用的靶標(biāo)與動脈粥樣硬化疾病靶標(biāo)進(jìn)行交集映射，獲得桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的潛在作用靶標(biāo)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建及核心靶標(biāo)篩選將上述交集靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 平臺，置信度設(shè)為0.7，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行可視化。利用該軟件的CytoNCA 插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征值分析，以拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征度中心性（degree centrality）大于中位數(shù)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點作為桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)。

1.5 基因本體（GO）和KEGG 通路富集分析利用KOBAS 在線平臺對上述關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，獲得桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白在基因功能和信號通路中的作用。通過KEGG 通路數(shù)據(jù)庫中的分類明確桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的核心作用靶標(biāo)富集的通路類型，去掉“癌癥”等與動脈粥樣硬化無關(guān)的疾病通路，其余通路以P值為參考，P值越小，可信度越高。最后，借助微生信（bioinforamtics）在線繪圖平臺繪制GO和KEGG通路富集圖。

1.6 “藥材-化合物-核心靶標(biāo)-作用通路”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析采用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥材-化合物-核心靶標(biāo)-作用通路”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并使用插件NetworkAnalyzer 分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)湫再|(zhì)，包括：度中心性（Degree centrality）、介數(shù)中心性（Betweeness centrality）和緊密中心性（Closeness centrality），根據(jù)這三種拓?fù)涮卣髦?，以中位?shù)為卡值，以同時滿足兩者以上為條件篩選出關(guān)鍵化合物、關(guān)鍵核心靶標(biāo)及關(guān)鍵作用通路。

1.7 分子對接分析篩選部分關(guān)鍵化合物和關(guān)鍵核心靶標(biāo)，從PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)文件，從PDB 數(shù)據(jù)庫獲取關(guān)鍵靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)文件。采用AutoDock 進(jìn)行分子對接驗證。利用結(jié)合能評估關(guān)鍵化合物與靶標(biāo)之間的結(jié)合能力。

1.8 動物實驗驗證

1.8.1實驗動物 C57BL/6 雄性8 周齡小鼠，體質(zhì)量（20± 2）g；ApoE-/-雄性8 周齡小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2021-0013，質(zhì)量合格證號：202106004。動物飼養(yǎng)于溫度18～23 ℃，濕度50%～60%，自由攝食、飲水。本實驗經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為：（2022）動物倫審第（14）號。

1.8.2高脂飼料、藥物及試劑 高脂飼料（配方為膽固醇0.15%、脂肪21%、基礎(chǔ)飼料78.85%）購于北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；桃仁、紅花購自陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號分別為：20220101、20220301；辛伐他汀片，涿州東樂制藥有限公司，批號：201004；總膽固醇（TC，批號：20210510）、甘油三脂（TG，批號：20210508）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C，批號：20210510）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C，批號：20210508）試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素6（IL-6，批號：20210608）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號：20210621）ELASA試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供；兔多克隆抗體TLR4 抗體，美國Abcam公司，批號：ab13556；鼠多克隆抗體NF-κB、鼠多克隆抗體P-NF-κB、兔多克隆抗體AKT、兔多克隆抗體P-AKT、鼠多克隆抗體GAPDH抗體，均由美國Immunoway 公司提供，批號分別為：YM3111、YM3224、YT0185、YT0134、YM3029。

1.8.3桃仁、紅花（1∶1）水煎液的制備 取桃仁、紅花各15 g，倒入300 mL 的蒸餾水中，煎煮2 次，合并濾液，濃縮至2.58 g·kg-1備用。

1.8.4儀器 JA10003B大量程電子精密天平，上海精密儀器公司；H-1600A 臺式離心機(jī)，江東儀器公司；Heraeus Fresco 17冷凍高速離心機(jī)、1510全自動酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；PowerPacTM Basic 電泳、Universal Hood III 發(fā)光設(shè)備，美國Bio-Red 公司；ECLIPSE Ci-L正置顯微鏡，日本NIKON公司。

1.8.5實驗分組及給藥方法 10 只C57BL/6 雄性小鼠為正常組，50 只ApoE-/-雄性小鼠隨機(jī)分為模型組、辛伐他汀組（0.002 5 g·kg-1）及桃仁-紅花（1∶1）低、中、高劑量組，每組10 只。桃仁-紅花（1∶1）給藥劑量根據(jù)相關(guān)研究[10]使用的大鼠用藥劑量，結(jié)合大鼠與小鼠用藥劑量換算比例1∶1.4 進(jìn)行換算，得到小鼠低、中、高劑量組給藥劑量為1.30、1.94、2.58 g·kg-1。動物適應(yīng)性生長1 周，在實驗期間自由攝食和水。1 周后正常組普通飲食、每日灌胃等量生理鹽水，模型及給藥組高脂飼料喂養(yǎng)8 周復(fù)制動脈粥樣硬化模型[11]。4 周后給藥，模型組每天灌胃等體積生理鹽水；桃仁-紅花（1∶1）低、中、高劑量組及辛伐他汀組每天給高脂飼料同時灌胃給藥1次，灌胃體積均為10 mL·kg-1，連續(xù)灌胃給藥8 周。實驗結(jié)束前禁食不禁水12 h，摘眼球取血，血液離心做血清學(xué)檢測；小鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下解剖ApoE-/-小鼠，取下小鼠主動脈，仔細(xì)剝除結(jié)締組織，用生理鹽水沖洗干凈后，取部分組織用4%多聚甲醛浸泡做HE染色，剩余組織于-80 ℃凍存。

1.8.6HE 染色觀察主動脈血管形態(tài) 將固定完全的主動脈進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片，HE染色，鏡下觀察。

1.8.7生化指標(biāo)的測定 小鼠血液以3 500 r·min-1離心（離心半徑12 cm）20 min，分離血清，應(yīng)用全自動酶標(biāo)儀測定各組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C 含量。具體操作按試劑盒說明書完成。

1.8.8酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法測定TNF-α、IL-6 含量 將各組小鼠血清采用雙抗體夾心ABCELISA法測定TNF-α、IL-6的濃度。實驗操作步驟按試劑盒說明書方法進(jìn)行。

1.8.9蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測血管組織TLR4、NF-κB、AKT 蛋白表達(dá) 取-80 ℃保存的血管組織100 mg，進(jìn)行組織裂解，4 ℃離心，100 ℃變性后保存?zhèn)溆?。?%SDS-多聚酰胺凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF 膜上，室溫封閉1 h 后，分別加入特異性一抗TLR4（1∶500）、NF-κB（1∶500）、PNF-κB（1∶500）、P-AKT（1∶500）、AKT（1∶500）、GAPDH（1∶2 000）孵育，4 ℃過夜。用TBST 洗膜5 次后與二抗結(jié)合（抗鼠或抗兔1∶5 000）室溫孵育1 h后，TBST洗膜5次。條帶用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（Millipore）發(fā)光，照片用Gel-Pro Analyzer 4.0 software分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件，計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 桃仁-紅花藥對化學(xué)成分及靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果在TCMIP v2.0 平臺“中藥材數(shù)據(jù)庫”模塊分別檢索“桃仁”和“紅花”，共收集到49 個化合物，其中桃仁共3 個化合物，分別為：兒茶素、α-蒎烯和Methyl-α-D-Fructofuranoside；紅花包含46 個化合物，主要為黃酮類、脂肪酸類、聚炔類和其他類化合物。靶標(biāo)識別結(jié)果顯示，桃仁所含成分作用靶標(biāo)共有53 個，紅花所含成分作用靶標(biāo)共有255 個，去重后共計256個。

2.2 桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化潛在靶標(biāo)利用TCMIP v2.0 的“疾病相關(guān)分子庫”結(jié)合GeneCards數(shù)據(jù)庫共獲得1 399個動脈粥樣硬化疾病靶標(biāo)，采用Venn分析與成分作用靶標(biāo)映射取交集后共獲得74個靶標(biāo)（見圖1）。

圖1 桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的靶標(biāo)韋恩圖Figure 1 Venn diagram of related targets of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶標(biāo)篩選將上述交集靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 平臺，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，采用Cytoscape 3.7.1進(jìn)行可視化（見圖2），所有節(jié)點的degree值中位數(shù)為3，選取degree＞3的靶標(biāo)節(jié)點作為桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的核心網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，共35個。

圖2 桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI network of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

2.4 核心靶標(biāo)的GO 和KEGG 通路富集分析將上述35 個核心靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID 在線平臺進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，取P＜0.001的GO 結(jié)果繪制氣泡圖（見圖3）。結(jié)果顯示，桃仁-紅花的核心靶標(biāo)主要參與的生物學(xué)過程包括RNA 聚合酶II 啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、血糖穩(wěn)態(tài)等過程；在分子功能上，桃仁-紅花主要與RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性、鋅離子結(jié)合、酶結(jié)合及類固醇結(jié)合等相關(guān)；在細(xì)胞組分方面，其主要作用于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等。

圖3 桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的核心靶標(biāo)的GO 功能富集氣泡圖Figure 3 GO function enrichment bubble chart of key targets of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

KEGG 通路富集結(jié)果（圖4）中，去掉分類屬于疾病類的通路，其余取P＜0.05的KEGG通路富集結(jié)果繪制氣泡圖。結(jié)果顯示，桃仁-紅花干預(yù)動脈粥樣硬化的核心靶標(biāo)主要富集于PI3K-Akt 信號通路、甲狀腺激素信號通路、胰島素抵抗、AMPK 信號通路、中性粒細(xì)胞形成、脂肪細(xì)胞脂肪分解調(diào)節(jié)、Toll 樣受體信號通路、TNF 信號通路、花生四烯酸代謝及細(xì)胞凋亡等信號通路。其中，富集靶標(biāo)數(shù)量最多的通路分別為PI3K-Akt 信號通路和甲狀腺激素信號通路。在PI3K-Akt 信號通路上共富集到7 個靶標(biāo)，分別為：RXRA（類視黃醇X 受體）、IFNB1（干擾素Β 重組蛋白1）、AKT1（蛋白激酶B1）、TLR4（Toll 樣受體4）、NFKB1（核因子κB1）、JAK1（酪氨酸激酶蛋白1）和INS（胰島素受體）；在甲狀腺激素信號通路上共富集到6 個靶標(biāo)，分別為：NCOA2（核受體輔激活因子2）、HDAC2（蛋白脫乙酰酶2）、RXRA、AKT1、ESR1（雌激素受體1）和ACTB（肌動蛋白β）。

圖4 桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的核心靶標(biāo)的KEGG 通路富集桑基圖Figure 4 KEGG pathway enrichment Sankey diagram map of potential targets of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in intervention of atherosclerosis

2.5 桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化“藥材-化合物-核心靶標(biāo)-作用通路”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析采用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥材-化合物-核心靶標(biāo)-作用通路（H-C-T-P）”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)（見圖5），綜合考察桃仁-紅花干預(yù)動脈粥樣硬化的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制。如圖所示，該網(wǎng)絡(luò)共包含80 個節(jié)點和544 個邊，其中節(jié)點包括2 個藥材、16 個化合物、35 個靶標(biāo)和28 個作用通路靶標(biāo)。利用NetworkAnalyzer插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)湫再|(zhì)分析，以度中心性（DC）＞5，介數(shù)中心性（BC）＞0.014 5，緊密中心性（CC）＞0.343 6為篩選條件，任意滿足其二的作為關(guān)鍵化合物、關(guān)鍵核心靶標(biāo)及關(guān)鍵作用通路，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，在H-C-T-P 網(wǎng)絡(luò)中，兒茶素、紅花素、15A，20β-二羥基-Δ4-孕烯-3-酮等13 個化合物，AKT1、PPARA、NFKB1、TLR4等9個靶標(biāo)及PI3K-Akt、甲狀腺激素及胰島素抵抗等6個信號通路較為關(guān)鍵。

表1 桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的“藥材-化合物-核心靶標(biāo)-作用通路”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鹘Y(jié)果Table 1 Topological characteristics of multidimensional correlation network of "medicinal materials-compounds-core targets-action pathways" of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

圖5 桃仁-紅花藥對干預(yù)動脈粥樣硬化的“藥材-化合物-核心靶標(biāo)-作用通路”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)Figure 5 Multidimensional association network of "medicinal materials-compounds-core targets-action pathway" of Persicae Semen-Carthami Flos drug pair in the intervention of atherosclerosis

2.6 分子對接驗證關(guān)鍵化合物與靶標(biāo)之間的相互作用選擇富集在PI3K-Akt 通路上的3 個關(guān)鍵靶標(biāo)NFKB1、AKT1 和TLR4 以及與這些靶標(biāo)有相互作用的關(guān)鍵化合物為研究對象，例如：15Α，20ΒDihydroxy-Δ4-Pregnen-3-One 與NFKB1，Catechin、Carthamidin、Onjixanthone II 與AKT1，Arachic Acid、Palmitic Acid、Linolenic Acid 與TLR4，采用分子對接技術(shù)考察這些關(guān)鍵化合物與其作用靶標(biāo)之間的相互作用情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些化合物與其對應(yīng)的靶標(biāo)均能直接相互作用，結(jié)合能見表2。采用Discovery Studio 4.5結(jié)合LigPlus軟件將分子對接結(jié)果可視化，見圖6。

表2 關(guān)鍵化合物與靶標(biāo)之間的結(jié)合自由能Table 2 Binding free energy between key compounds and targets

圖6 關(guān)鍵化合物與靶標(biāo)相互作用圖Figure 6 Interaction diagram of key compounds and targets

2.7 動物實驗驗證

2.7.1桃仁-紅花藥對對AS 的ApoE-/-小鼠主動脈病理學(xué)變化影響 結(jié)果見圖7。正常組小鼠主動脈內(nèi)膜內(nèi)壁平滑肌細(xì)胞形態(tài)正常、排列緊密。模型組小鼠主動脈內(nèi)膜內(nèi)壁出現(xiàn)明顯動脈粥樣硬化斑塊突起，內(nèi)膜明顯增加，薄厚不一。與模型組比較，桃仁-紅花中、高劑量組小鼠主動脈內(nèi)膜損傷較輕，斑塊減少。以上表明動脈粥樣模型建立成功，桃仁-紅花藥對對其有一定改善作用。

2.7.2桃仁-紅花藥對對AS的ApoE-/-小鼠血脂的影響 從表3 可見與正常組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平顯著增加，HDL-C 水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，桃仁-紅花中、高劑量組可顯著降低小鼠血清TC、TG、LDL-C（僅高劑量組）含量，增高HDL-C 含量，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

表3 各組小鼠血脂含量比較（±s，n=10）Table 3 The lipid content in each group of mice（±s，n=10）

表3 各組小鼠血脂含量比較（±s，n=10）Table 3 The lipid content in each group of mice（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

HDL-C/（nmol·mL-1）4.69±1.09 3.00±0.08**3.44±0.17 3.89±0.07##3.90±0.89##4.19±0.42##分組正常組模型組桃仁-紅花低劑量組桃仁-紅花中劑量組桃仁-紅花高劑量組辛伐他汀組劑量/（g·kg-1）--1.30 1.94 2.58 0.002 5 TG/（nmol·mL-1）1.87±0.01 3.46±0.25**3.11±0.23#2.92±0.46##2.51±0.18##2.33±0.75##TC/（nmol·mL-1）16.63±0.42 29.50±4.00**25.62±2.28#22.70±3.49##20.81±0.89##19.67±2.62##LDL-C/（nmol·mL-1）3.03±0.28 5.10±1.02**4.78±0.13 4.28±0.98 3.60±0.67##3.40±0.64##

2.7.3桃仁-紅花藥對對AS 的ApoE-/-小鼠血清中TNF-α、IL-6 含量的影響 結(jié)果見表4 。與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達(dá)量明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，桃仁-紅花藥對中、高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6 表達(dá)量明顯減少（P＜0.01）。結(jié)果表明桃仁-紅花藥對能明顯抑制高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠的主動脈炎癥反應(yīng)。

表4 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6 水平比較（±s，n=10）Table 4 The content of TNF-α，IL-6 in serum of mice in each group（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

TNF-α/（pg·mL-1）103.99±2.17 176.77±27.66**150.02±23.25#149.77±4.87##131.20±3.61##128.69±2.39##分組正常組模型組桃仁-紅花低劑量組桃仁-紅花中劑量組桃仁-紅花高劑量組辛伐他汀組劑量/（g·kg-1）--1.30 1.94 2.58 0.002 5 IL-6/（pg·mL-1）84.88±15.56 125.25±9.19**113.75±12.73 101.78±2.83##92.63±13.44##87.75±12.02##

2.7.4桃仁-紅花藥對對AS 的ApoE-/-小鼠主動脈血管關(guān)鍵靶標(biāo)NF-κB、TLR4、AKT蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖8，與正常組比較，模型組小鼠主動脈血管組織中P-NF-κB、TLR4、P-AKT蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，桃仁-紅花中、高劑量組可明顯降低其表達(dá)（P＜0.01，P＜0.05）。實驗表明，桃仁-紅花藥對可以調(diào)節(jié)PI3K-Akt通路，抑制P-NF-κB、TLR4、P-AKT蛋白表達(dá)。

圖8 各組小鼠主動脈血管NF-κB、TLR-4、AKT 蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）Figure 8 The protein expressions of NF-κB，TLR-4，AKT in aorta of mice in each group（±s，n=3）

3 討論

動脈粥樣硬化（AS）是一種以脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等為主要病理基礎(chǔ)的慢性血管性疾病[12]，抗炎、干預(yù)炎性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中的一些關(guān)鍵靶點，對于改善AS 非常重要?，F(xiàn)有研究[13]發(fā)現(xiàn)活血、祛瘀的中成藥可很好地改善炎癥反應(yīng)、對抗AS。桃仁-紅花是經(jīng)典的活血化瘀藥對。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，揭示了桃仁-紅花藥對治療AS 的潛在靶標(biāo)和作用機(jī)制，結(jié)果顯示，桃仁-紅花49個活性成分能夠作用于256個作用靶標(biāo)，通過與1 399個AS疾病相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行交集映射，共獲得其干預(yù)AS的74個靶標(biāo)。PPI 網(wǎng)絡(luò)共篩選35 個核心靶標(biāo)，其可與桃仁-紅花中16 種主要化合物如：兒茶素、谷甾醇、亞油酸、紅花素等發(fā)揮抗AS 作用。KEGG 富集分析得到PI3K-Akt 信號通路和甲狀腺激素信號通路為富集最多的主要通路。改善AS 的關(guān)鍵靶標(biāo)為PPARA、IFNB1、AKT1、TLR4、NFKB1、JAK1 和INS 靶點。說明桃仁-紅花治療AS 過程中，起主導(dǎo)作用的可能是PI3K-Akt 通路調(diào)節(jié)及對NF-κB 等炎癥蛋白的影響。

PI3K 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖、迀移、分化、轉(zhuǎn)錄和翻譯，與Akt 組成的PI3K-Akt 信號通路與AS的關(guān)系最為緊密[14-15]。研究[16]表明，通常情況下，PI3K 被激活后，可招募并激活A(yù)KT，活化的AKT 通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如NF-κB、P56、VEGF 等因子的表達(dá)。NF-κB 是細(xì)胞活動中與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其可介導(dǎo)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[17]。TLR是一種新型的炎癥信號傳遞蛋白，研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，人與鼠AS 斑塊大部分內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中TLR4的表達(dá)明顯增加，同時伴隨著NF-κB的表達(dá)參與小鼠AS的發(fā)展。

有研究[20]報道，紅花的主要提取物紅花素可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路對抗炎癥反應(yīng)改善腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷。桃仁的提取物兒茶素、花生酸等可能通過減少NF-κB 含量，改善血瘀癥，減輕心肌損傷[21]。結(jié)果表明桃仁、紅花可能通過調(diào)節(jié)TLR4、NF-κB 等蛋白抗炎改善心腦血管病癥，這些研究結(jié)果均與本網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測相吻合。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果，本研究進(jìn)一步對AKT1、TLR4，NFKB1關(guān)鍵靶標(biāo)與其相互作用的化合物進(jìn)行了分子對接。結(jié)合自由能結(jié)果顯示，兩者之間都能夠直接相互作用。同時開展動物實驗驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桃仁-紅花中、高劑量組能夠顯著降低小鼠血清中IL-6、TNF-α 含量，抑制關(guān)鍵靶標(biāo)TLR4、NF-κB、AKT 蛋白表達(dá)，降低血脂，減小主動脈斑塊面積對抗AS的發(fā)生。

綜上所述，本研究基于桃仁-紅花活血祛瘀的功效，探討了其治療AS 的現(xiàn)代作用機(jī)理，通過構(gòu)建“桃仁，紅花-化合物-核心靶標(biāo)-作用通路”多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)一步結(jié)合分子對接及動物實驗驗證，明確了桃仁-紅花通過調(diào)節(jié)PI3K-AkT 等信號通路，抑制NF-κB、AKT、TLR4 等炎癥蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)血脂改善AS。本研究為桃仁-紅花的臨床合理應(yīng)用、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究提供了必要的理論支撐。