黃芩苷通過銅代謝途徑干預銅負荷肝豆狀核變性大鼠的作用機制研究

張明昊，張家樂，吳星霏，申艷朵，吳劉俊，張家明，王瑾瑾（河南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，河南 鄭州 450046）

肝豆狀核變性（Hepatolenticular degeneration，HLD）又稱Wilson?。╓ilson’s disease，WD），是一種常染色體隱性遺傳病，該病因位于13q14.3的腺嘌呤核苷三磷酸7b（ATP7b）基因突變，致使銅藍蛋白（Ceruloplasmin，CP）合成及銅在膽汁中的排泄出現(xiàn)障礙，大量的銅沉積于肝臟、腦、腎臟、角膜等組織中，可使患者出現(xiàn)肝硬化、椎體外系癥狀及角膜色素環(huán)（K-F 環(huán)）等多種臨床表現(xiàn)，嚴重者可危及生命[1-2]。西醫(yī)對HLD 的治療主要以青霉胺、二巰丙磺酸鈉、二巰基丙醇、二巰基丁二酸為代表的金屬絡合劑來促進機體排銅，其中青霉胺一直是治療HLD的首選藥物。上述藥物雖能使機體大量排銅，但長期使用會出現(xiàn)諸多不良反應，如可引起溶血性貧血、皮膚紫癜、狼瘡樣綜合征等，且易使患者產(chǎn)生耐受性[3-4]。

依據(jù)臨床癥狀可將HLD 歸為中醫(yī)學的“震顫”“積聚”“黃疸”“癲狂”等范疇，與風、痰、虛、瘀有關(guān)，責之于肝，故多以平肝熄風、疏肝利膽、清熱退黃為治療原則[5-6]。黃芩苷（Baicalin，分子式：C21H18O11）是中藥黃芩的主要有效成分之一，屬葡萄糖醛酸苷類化合物，具有清熱解毒、疏肝利膽、抗菌抗炎、絡合金屬離子、抗氧化及抗血栓等藥理作用，臨床上可用于病毒性肝炎、腎炎、感染等疾病的治療[7-8]，但少有治療HLD 的報道。本課題組前期研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，黃芩為中醫(yī)治療HLD方劑中的常見中藥，其主要成分黃芩苷又是一種很好的金屬絡合劑，且黃芩苷清熱解毒、疏肝利膽的作用符合中醫(yī)治療HLD 的思路。因此，本課題組擬用黃芩苷對HLD 大鼠進行干預，以青霉胺為陽性對照藥物，觀察黃芩苷對HLD 大鼠銅代謝、肝功能及肝臟病理變化的影響，并基于銅代謝途徑探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物8 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2019-0002，動物質(zhì)量合格證號：110981201100002567。本實驗經(jīng)河南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，動物倫理批文號：DWLL202201010。

1.2 藥物及試劑黃芩苷膠囊（每粒250 mg），批號：2006004，東莞市金美濟藥業(yè)有限公司；青霉胺（每片125 mg），批號：137200602，上海上藥信誼藥廠有限公司；青霉胺、黃芩苷均溶于0.1% CMC-Na 制成混懸液。五水合硫酸銅（CuSO4· 5H2O），批號：20191101，煙臺市雙雙化工有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），批號：20160704，上海國藥集團化學試劑有限公司；銅（Cu，貨號：E010-1-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT，貨號：C009-1-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT，貨號：C010-1-1）測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；兔SP 試劑盒（貨號：SP-9001）、DAB 顯色試劑盒（貨號：ZLI-9018），均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠銅轉(zhuǎn)運體1（CTR1，貨號：bs-10773R）、金屬巰蛋白（MT，貨號：bs-10568R）、腺嘌呤核苷三磷酸7B（ATP7B，貨號：bs-1718R）、細胞色素氧化酶17（COX17，貨號：bs-14005R）抗體，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司； 抗氧化蛋白1（ATOX1，貨號：EPR10352）、超氧化劑物歧化酶銅伴侶蛋白（CCS，貨號：EPR9712）抗體，均購自英國Abcam 公司；TriQuick 總RNA 提取試劑（貨號：R1100）、cDNA 合成試劑盒（貨號：G3330）、實時熒光定量PCR擴增試劑（貨號：G3320），均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器BS110S 型電子天平，北京塞多利斯天平公司；MR-96TB 型酶標儀，騁克儀器（上海）有限公司；RM2235 型石蠟切片機，德國Leica 公司；D3024R 型臺式高速冷凍型微量離心機，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；YD-6D 型組織包埋機、YD-A 型組織攤片機、YD-B 型組織烤片機，金華市科迪儀器設備有限公司；CX23 型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Stepone plus 型熒光定量PCR 儀，美國ABI公司。

1.4 分組、模型復制及給藥取雄性SD 大鼠50 只，適應性飼養(yǎng)1 周后，以CuSO4·5H2O 為銅源，按300 mg·kg-1灌胃CuSO4·5H2O 溶液，每日1 次，連續(xù)30 d，復制銅負荷HLD 大鼠模型。然后隨機分為模型組、青霉胺組和黃芩苷低、中、高劑量組，每組10 只，另取10 只大鼠作為正常組。黃芩苷、青霉胺的成人給藥劑量分別為1.5、1.0 g·d-1，根據(jù)人鼠劑量換算公式（S200g大鼠=0.018×S70kg人）計算，得到黃芩苷、青霉胺的大鼠給藥劑量分別為135、90 mg·kg-1。以折算劑量135 mg·kg-1為黃芩苷中劑量；以67.5 mg·kg-1（折算劑量的1/2倍）為黃芩苷低劑量；以270 mg·kg-1（折算劑量的2倍）為黃芩苷高劑量；以90 mg·kg-1為青霉胺劑量。各組大鼠造模同時灌胃給藥，灌胃體積10 mL·kg-1，每日1 次，連續(xù)30 d；正常組和模型組大鼠灌胃等體積0.1% CMC-Na溶液。

1.5 樣本采集末次給藥后將各組大鼠單只置于代謝籠中留取24 h 尿液；然后腹腔注射氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，腹主動脈取血；所得尿液、血液以3 000 r·min-1（離心半徑10 cm）離心10 min，取上清液于-80 ℃下儲存。然后處死大鼠，解剖取肝臟；去除周圍結(jié)締組織，生理鹽水洗滌；用濾紙吸盡肝臟表面液體，拍照，稱質(zhì)量；計算：肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）。再將肝組織一分為二，其中1份用4%多聚甲醛溶液固定；另1份用液氮速凍后于-80 ℃下儲存。

1.6 尿銅、血銅、肝銅水平檢測嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，檢測各組大鼠血清及尿液中的銅水平。取凍存肝組織0.1 g，加入0.9 mL 冰生理鹽水制備10%組織勻漿液，以3 000 r·min-1（離心半徑10 cm）離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書步驟檢測肝組織中的銅水平。

1.7 肝功能檢測嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，檢測各組大鼠血清及肝組織中的GPT、GOT水平。

1.8 肝組織病理學觀察將各組大鼠肝臟組織用4%多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)脫水、透明、包埋后切片（4 μm）；切片經(jīng)二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅（HE）染色，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，在光學顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.9 免疫組織化學法檢測肝組織中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT 蛋白表達水平將肝臟組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后，用H2O2封閉；PBS清洗后，檸檬酸鹽緩沖液熱修復；滴加山羊血清封閉液，室溫下孵育，傾去液體；分別滴加CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT 抗體（1∶200），4 ℃下孵育過夜；滴加二抗后37 ℃下孵育20 min，DAB 顯色，自來水沖洗；蘇木素復染1～2 min，鹽酸乙醇分化后，自來水再次沖洗；然后脫水、透明、封片、鏡檢。每只大鼠肝臟切片在光學顯微鏡（×400）下隨機選取1 個視野，以棕黃色為陽性染色，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定每個視野中的積分光密度（IOD）值，以此評價目標蛋白的表達水平。

1.10 Real-time PCR 法檢測肝組織中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT mRNA 表達水平取100 mg 大鼠肝組織，用液氮研磨后收集于EP 管中，加入1 mL TriQuick 試劑提取肝組織總RNA，檢測RNA 含量和純度（A260/A280=1.8～2.0）。采用Servicebio 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應，反應條件為：65 ℃、5 min，42 ℃、60 min，70 ℃、5 min，4 ℃保持。然后進行PCR 反應，反應體系為15 μL；反應條件：預變性95 ℃、10 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、1 min，共40 個循環(huán)。擴增反應后進行熔解曲線分析，判斷產(chǎn)物是否有非特異性擴增；分析擴增曲線，計算Ct 值；以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計算各組間mRNA 表達水平差異，正常組基因表達量設為1；實驗重復3 次。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR

1.11 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對HLD 大鼠尿銅、肝銅及血銅水平的影響結(jié)果見圖1。與正常組比較，模型組大鼠的尿銅、肝銅、血銅水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，青霉胺組和黃芩苷低、中、高劑量組大鼠的尿銅、肝銅、血銅水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，黃芩苷能改善HLD大鼠的尿銅、肝銅及血銅水平。

圖1 黃芩苷對肝豆狀核變性大鼠尿銅、肝銅及血銅水平的影響（±s，n=10）Figure 1 Effects of baicalin on the levels of urine copper，liver copper and serum copper in hepatolenticular degeneration rats（±s，n=10）

2.2 黃芩苷對HLD 大鼠肝臟功能的影響結(jié)果見圖2。與正常組比較，模型組大鼠的肝臟系數(shù)以及血清和肝臟GPT、GOT水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，青霉胺和黃芩苷低、中、高劑量組大鼠的肝臟系數(shù)以及血清和肝臟GPT、GOT 水平均明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，黃芩苷能改善HLD 大鼠的肝功能。

圖2 黃芩苷對肝豆狀核變性大鼠肝功能的影響（±s，n=10）Figure 2 Effect of baicalin on liver function in hepatolenticular degeneration rats（±s，n=10）

2.3 黃芩苷對HLD 大鼠肝組織病理變化的影響結(jié)果見圖3。正常組大鼠肝細胞核清晰，呈圓形、居中，肝小葉結(jié)構(gòu)完整。與正常組比較，模型組大鼠的肝細胞腫大，胞質(zhì)疏松呈絲網(wǎng)狀，出現(xiàn)羽毛狀變性及網(wǎng)狀壞死等病理變化，與HLD 引起的肝臟損傷特征一致，表明造模成功。與模型組比較，青霉胺組和黃芩苷低、中、高劑量組大鼠的肝細胞羽毛狀變性與網(wǎng)狀壞死程度明顯減輕。結(jié)果表明，黃芩苷能改善HLD引起的肝臟組織病理損傷。

圖3 黃芩苷對肝豆狀核變性大鼠肝組織病理變化的影響（HE 染色，×400）Figure 3 Effect of baicalin on liver histopathology in hepatolenticular degeneration rats（HE staining，×400）

2.4 黃芩苷對HLD 大鼠肝組織中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT 蛋白表達水平的影響結(jié)果見圖4。與正常組比較，模型組大鼠肝組織中CTR1、MT 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），ATOX1、ATP7B、CCS、COX17蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，青霉胺組和黃芩苷低、中、高劑量組大鼠肝組織中CTR1、MT蛋白水平明顯降低（P＜0.05），ATOX1、ATP7B、CCS、COX17蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。

圖4 黃芩苷對肝豆狀核變性大鼠肝組織中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT 蛋白表達水平的影響（免疫組化，×400；±s，n=10）Figure 4 Effects of baicalin on protein expression levels of CTR1，ATOX1，ATP7B，CCS，COX17 and MT of liver tissues in hepatolenticular degeneration rats（IHC，×400；±s，n=10）

2.5 黃芩苷對HLD 大鼠肝組織中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT mRNA表達水平的影響結(jié)果見圖5。與正常組比較，模型組大鼠肝組織中CTR1、MT mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），ATOX1、ATP7B、CCS、COX17 mRNA表達水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，青霉胺組和黃芩苷低、中、高劑量組大鼠肝組織中CTR1、MT mRNA水平明顯降低（P＜0.05），ATOX1、ATP7B、COX17 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），青霉胺組和黃芩苷中、高劑量組大鼠肝組織中CCS mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05）。

圖5 黃芩苷對肝豆狀核變性大鼠肝組織中CTR1、ATOX1、ATP7B、CCS、COX17、MT mRNA 表達水平的影響（±s，n=3）Figure 5 Effects of baicalin on mRNA expression levels of CTR1，ATOX1，ATP7B，CCS，COX17 and MT of liver tissues in hepatolenticular degeneration rats（±s，n=3）

3 討論

肝豆狀核變性（HLD）患者因染色體異常導致與銅離子結(jié)合形成銅藍蛋白的α2球蛋白合成水平下降，銅從膽汁排出減少，大量蓄積于肝、腎及腦基底節(jié)膜，故尿銅、肝銅和血銅水平可作為該病的客觀評價指標[11]。目前HLD 研究中尚無動物模型可以完全復制其臨床特征，但高銅飲食可在大鼠肝臟中產(chǎn)生類似于HLD 特征的銅蓄積[12]。本實驗通過灌胃CuSO4·5H2O 造成大鼠體內(nèi)銅蓄積，引發(fā)肝臟損傷，進而構(gòu)建了HLD 大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLD 大鼠尿銅、肝銅、血銅水平明顯升高，表明造模成功。

西醫(yī)治療HLD 主要圍繞機體銅代謝異常展開，以促進機體排銅、抑制機體對銅的吸收和相應器官組織損傷的對癥治療為主要思路，通過金屬絡合劑、鋅劑等藥物及肝移植來實現(xiàn)。金屬絡合劑可與機體血液及組織中的銅離子絡合形成水溶性絡合物，再通過膽道、尿液排出體外，此類藥物雖排銅量高，但會使機體產(chǎn)生諸多不良反應[3-4]。鋅劑可誘導人體腸上皮細胞中金屬硫蛋白的合成，使銅優(yōu)先與該蛋白結(jié)合，抑制腸道對銅的攝取，但鋅從高銅組織中將銅排出體外的能力有限[13]。中醫(yī)治療HLD以平肝熄風、疏肝利膽及清熱退黃為原則，以肝豆湯、肝豆片和柴黃肝豆散為代表方劑，在個案報道中療效較好，且毒副作用小[14-15]。本課題組在前期研究[7]中分析中醫(yī)治療HLD的方劑發(fā)現(xiàn)，黃芩是這些方劑中普遍使用的中藥，其清熱燥濕、瀉火解毒功效有助于對HLD 的治療。黃芩苷是中藥黃芩的有效成分[8]，其清熱解毒、疏肝利膽及絡合金屬離子的作用符合中西醫(yī)對HLD 的治療思路。故本實驗選擇了黃芩苷干預HLD 大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷能明顯降低HLD 大鼠的尿銅、肝銅、血銅水平，表明其可以降低HLD大鼠體內(nèi)的銅蓄積水平。

銅在體內(nèi)蓄積具有選擇性，以肝臟沉積居多，故HLD 的發(fā)生通常會伴隨肝功能異常和肝組織損傷。肝臟系數(shù)可以反映肝臟的狀態(tài)，其升高則提示肝臟可能出現(xiàn)了腫脹、肥大等病理變化；GPT、GOT水平可反映肝細胞膜的穩(wěn)定性，是臨床上判斷肝功能異常的常用指標，其水平升高則提示肝細胞發(fā)生病變[16-17]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HLD 大鼠的血清GPT、GOT 水平及肝臟系數(shù)明顯升高，肝組織出現(xiàn)羽毛狀變性及網(wǎng)狀壞死，而黃芩苷可以下調(diào)其GPT、GOT水平，降低肝臟系數(shù)，改善肝組織變性，表明黃芩苷對HLD大鼠肝臟具有較好的保護作用。

排銅是逆轉(zhuǎn)HLD 臨床癥狀的一個主要途徑。在肝細胞內(nèi)，銅離子會被轉(zhuǎn)運、加工和利用，這一過程由銅代謝與轉(zhuǎn)運途徑的多個蛋白參與，一旦發(fā)生異常，銅將蓄積于肝臟，過載后將溢出入血，隨尿排出。CTR1 蛋白由190 個氨基酸殘基組成，可將細胞外銅離子特異地轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，其表達水平受細胞內(nèi)銅離子濃度影響。銅離子進入細胞后，可與2個ATOX1 單體結(jié)合形成同源二聚體，利用ATP 水解產(chǎn)生的能量，以劑量依賴和可飽和的方式將銅離子轉(zhuǎn)運到ATP7B 的氨基末端，并在細胞水平上調(diào)節(jié)銅離子的分布情況。ATP7B 一方面接收ATOX1 傳遞而來的銅離子合成銅藍蛋白（CP），另一方面誘導高銅環(huán)境下的銅離子從膽道排出。有研究[18]顯示，多數(shù)HLD患者的ATP7B 基因發(fā)生突變致使其功能缺陷，肝細胞內(nèi)CP合成和膽汁銅排泄障礙，引起血清CP水平降低和銅在肝臟、腎臟等臟器中蓄積。CCS 蛋白由270～300個氨基酸殘基組成，可將銅離子傳遞給超氧化物歧化酶1（SOD1），促進SOD1 的歧化作用，保護細胞免遭氧化自由基損害，并維持細胞內(nèi)的銅穩(wěn)態(tài)。MT不直接參與銅攝取與轉(zhuǎn)運，而是起銅儲存和隔離游離銅毒性的作用。高銅環(huán)境下，MT可以暫時與銅離子結(jié)合，使胞質(zhì)內(nèi)的銅濃度短時間內(nèi)維持在合適水平[19]。線粒體細胞色素C氧化酶（COX）是呼吸鏈末端限速酶，也是一種銅依賴酶，它的兩個亞基單位COX1 和COX2 分別有一個銅結(jié)合區(qū)，可把銅傳遞給COX17，由此催化細胞色素C（Cyt）的電子轉(zhuǎn)移給分子氧，矢量質(zhì)子通過基質(zhì)泵轉(zhuǎn)運到膜間隙，形成跨膜質(zhì)子梯度，線粒體ATP 合酶即可利用該梯度驅(qū)動ATP 合成，故COX17 對維持線粒體銅穩(wěn)態(tài)有重要意義[18，20-21]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HLD 大鼠肝組織中ATP7B、ATOX1、CCS、COX17蛋白及mRNA 表達水平明顯降低，而黃芩苷可以上調(diào)ATP7B、ATOX1、CCS、COX17蛋白及mRNA表達水平，以促進銅離子排出，降低肝組織中的銅水平，減輕高銅負荷所致的肝臟損傷；此外，HLD 大鼠肝組織中CTR1、MT蛋白及mRNA 表達水平明顯升高，而黃芩苷可以下調(diào)CTR1、MT蛋白及mRNA表達水平，以減少肝細胞對銅離子的攝入，降低肝細胞內(nèi)的銅離子水平。

綜上所述，黃芩苷能降低HLD 大鼠體內(nèi)的銅蓄積水平，并改善肝功能及肝臟組織病理損傷，其機制可能與調(diào)節(jié)銅代謝途徑相關(guān)因子表達水平有關(guān)，該研究結(jié)果可為黃芩苷在HLD 治療方面的深入研究提供參考。