白虎加人參湯加減方對2 型糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4 表達及抗氧化應激作用機制的研究

王芳，劉清，高天慧，宋小妹（.陜西能源職業(yè)技術學院，陜西 咸陽 7000；.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 7046）

目前，全球2 型糖尿?。═2DM）患者數(shù)量逐年增加[1]，其病因復雜，與多種因素有關，胰島素抵抗（IR）及胰島β細胞功能缺陷被公認為是主要的發(fā)病機制。而氧化應激可以通過干擾磷脂酸肌醇3-激酶（PI3K）的活化轉導和骨骼肌葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）的轉位等與胰島素信號傳遞有關的生理活動，從而引發(fā)IR，與T2DM 的發(fā)生發(fā)展密切相關[2-4]。白虎加人參湯是《傷寒論》中的經(jīng)典名方，具有養(yǎng)陰清熱生津的功效，越來越多的臨床研究[5-6]證明，白虎加人參湯能明顯改善糖尿病患者的糖代謝異常、血脂紊亂、IR 等病理狀態(tài)，同時還可以干預體內的炎癥狀態(tài)、氧化應激水平。白虎加人參湯加減方是在原方基礎上去粳米加白術、茯苓、丹參組成，共奏益氣養(yǎng)陰、健脾生津、活血化瘀之效。本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，白虎加人參湯加減方可以減少T2DM 大鼠胰島β 細胞凋亡，改善胰腺組織的病理變化，對胰島細胞具有保護作用，其作用機制可能與調節(jié)PI3K/AKT/FoxO1 信號通路有關。故本研究擬繼續(xù)探討白虎加人參湯加減方對T2DM大鼠抗氧化應激作用機制及對GLUT4 表達的影響，以期闡明其治療T2DM的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物雄性SD大鼠60只，SPF級，體質量（200±20）g，購自陜西中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2021-001。動物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（陜）2021-001；環(huán)境溫度23 ℃左右，濕度（50±5）%，晝夜各半交替照明；大鼠適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗，期間自由攝食飲水。本實驗經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，批文號：SUCMDL20210611001。

1.2 藥物及試劑白虎加人參湯加減方處方：知母10 g、石膏12 g、炙甘草6 g、西洋參8 g、白術6 g、茯苓6 g、丹參6 g，購自空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院中藥房，批號分別為：20210701、2107001、20210524、201201、20201201、20211102、201201。按組方比例稱取藥材，常規(guī)煎煮后濃縮至含生藥量2.0 g·mL-1，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹7]。二甲雙胍，上海施貴寶制藥有限公司，批號：ABJ1186。鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma-Aldrich 公司，批號：S0130；高脂高糖飼料（繁殖鼠料54.6%、豬油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、預混料2.1%、麥芽糊精2.2%），上海普路騰生物科技有限公司，批號：20210621-074；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、胰島素（INS）ELISA 檢測試劑盒，均購自南京建成生物科技有限公司，批號分別為：A003-1-2、A005-1-2、A001-3-2、A003-1-2、H203-1-2；糖化血紅蛋白（HbAlc）檢測試劑盒，瑞士ALEXIS 公司，批號：YB-R0298c；Fyn 抗體，英國Abcam 公司，批號：ab184276； 蛋白激酶B（AKT）抗體、血紅素加氧酶1（HO-1）抗體、GAPDH 抗體、GLUT4 抗體、p-AKT 抗體、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、p-GSK-3β 抗體、核因子NF-E2 相關因子（Nrf2）抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為：GB111114、GB12104、GB111114、GB112175、GB 13012-3、GB1311099、GB114582、GB113808；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox），寶生物工程（大連）有限公司，批號：AIG2018A；Trizol RNA 提取試劑盒，美國Ambion公司，批號：15596026。

1.3 主要儀器Free Sytle 血糖儀及血糖試紙，美國Abbott 公司；DYCZ-24DN 型雙垂直電泳儀，北京六一儀器有限公司；1600型組織切片機，德國Leica 公司；Nanodrop 2000 型超微量核酸蛋白測定儀，美國Thermo Fisher 公司；IKA T10型高速組織勻漿機，德國IKA集團（廣州）儀器設備有限公司；5417R型小型臺式低溫離心機，德國Eppendorf公司；7500 型實時熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司；Nikon Eclipse 80i型倒置顯微鏡，日本Nikon公司；Synergy全自動多功能酶標儀，中國香港基因有限公司。

1.4 模型復制大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機選取8 只作為對照組，其余為造模組。對照組大鼠繼續(xù)采用普通飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)；4 周后，禁食不禁水12 h，造模組大鼠一次性腹腔注射STZ 40 mg·kg-1，對照組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH=4.2）；72 h后，禁食不禁水12 h，測定大鼠空腹血糖（FBG）水平，2次FBG 值均大于11.0 mmol·L-1者為T2DM大鼠模型復制成功。

1.5 分組及給藥將T2DM 大鼠隨機分為4 組：模型組、陽性藥組（二甲雙胍，200 mg·kg-1）及白虎加人參湯加減方高、低劑量組（37.8、18.9 g·kg-1）[7]，每組8 只；給藥組大鼠按照10 mL·kg-1灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)8 周；模型組、對照組灌胃等量0.5%CMC-Na溶液。模型組及給藥組大鼠每天均給予高脂高糖飼料，對照組每天繼續(xù)給予正常飼料。

1.6 生化指標檢測（1）給藥期間每2 周大鼠尾靜脈取血1 次，測定FBG 值。給藥8 周后，禁食不禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血；一部分血液保存于抗凝試管中，嚴格按照試劑盒說明書步驟測定HbAlc水平；另一部分血液在室溫靜置1 h 后，以3 000 r·min-1（離心半徑15 cm）離心8 min，分離血清于-20 ℃保存，嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，測定INS水平，計算：胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FBG×INS/22.5。（2）取大鼠胰腺組織約0.1 g，加入1 mL 提取液，進行冰浴勻漿；以4 ℃、8 000 r·min-1（離心半徑15 cm）離心10 min，取上清，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，測定CAT、SOD、GSH-Px、MDA水平。

1.7 qRT-PCR 法檢測肌肉組織中GLUT4 mRNA表達水平取大鼠肌肉組織100 mg，按照Trizol法提取總RNA，檢測各樣本RNA 含量和純度；取1.0 μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書步驟操作，合成cDNA，逆轉錄反應條件：35 ℃、10 min，43 ℃、30 min，95 ℃、5 min，5 ℃、5 min。以cDNA 為模板進行PCR 擴增，引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，GLUT4上游引物序列：5'-GCCATGAGCT ACGTCTCCATT-3'，GLUT4 下游引物序列：5'-GGCCACGATGAACCAAGGAA-3'；GAPDH 上游引物序列：5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，GAPDH下游引物序列：5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'。PCR 反應條件：93 ℃、2 min；93 ℃、30 s，55 ℃、1 min，72 ℃、34 min，共40 個循環(huán)；60 ℃、2 min。根據(jù)擴增曲線讀取Ct 值，以GAPDH 為內參，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達水平。

1.8 Western Blot 法檢測肌肉組織中GLUT4 蛋白及胰腺組織中AKT/GSK-3β/Nrf2 通路相關蛋白的表達情況取大鼠肌肉組織或胰腺組織100 mg，分別提取總蛋白和核蛋白（用于測定n-Nrf2、n-Fyn），經(jīng)BCA 蛋白定量和蛋白變性后，進行SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜和封閉。封閉結束后，將PVDF 膜取出，在搖床上用TBST 洗5 遍，每次5 min；裁剪成合適條帶，分別加入稀釋后的p-GSK-3β、GSK-3β、p-AKT、AKT、Fyn、GLUT4、Nrf2、GAPDH 一抗（1∶1 000），充分覆蓋PVDF膜，4 ℃下孵育過夜；次日在搖床上用TBST洗5遍，每次5 min，然后加入相應二抗（1∶5 000），室溫下孵育1 h；在搖床上使用TBST 洗5 遍，每次5 min，采用ECL 化學發(fā)光液曝光、顯影；掃描膠片，采用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶光密度值；以GAPDH 為內參，對目的蛋白進行半定量分析。

1.9 免疫組織化學法檢測胰腺組織中HO-1、n-Nrf2蛋白表達取4%多聚甲醛溶液固定的胰腺組織，制備石蠟切片；脫蠟至水，EDTA 緩沖液修復，用5%BSA 在室溫下封閉30 min；加入一抗HO-1（1∶400）、Nrf2（1∶400），4 ℃下孵育過夜；PBS洗滌后，加入二抗（1∶400），室溫下孵育1.5 h；SABC 孵育1.5 h 后，滴加3，3-二氨基聯(lián)苯胺顯色；蘇木素復染，水洗3 次，每次5 min；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡（×400）下隨機選取3個視野，以棕黃色為陽性染色，采用Image-Pro Plus 5.0分析軟件測定每個視野中的積分光密度（IOD）值，作為目的蛋白表達水平。

1.10 統(tǒng)計學處理方法采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白虎加人參湯加減方對T2DM 大鼠FBG、INS、HbAlc 及HOMA-IR 的影響結果見圖1、表1。與對照組比較，模型組大鼠的FBG、HbAlc 及HOMA-IR 明顯升高（P＜0.05），血清INS水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組大鼠第4、6、8 周的FBG 水平及HbAlc、HOMA-IR 均明顯降低（P＜0.05），陽性藥組及白虎加人參湯加減方高劑量組大鼠的血清INS 水平明顯升高（P＜0.05）。結果表明，白虎加人參湯加減方能夠降低T2DM大鼠的血糖水平，改善IR。

表1 白虎加人參湯加減方對2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的影響（±s，n=8）Table 1 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on HOMA-IR in T2DM rats（±s，n=8）

表1 白虎加人參湯加減方對2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的影響（±s，n=8）Table 1 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on HOMA-IR in T2DM rats（±s，n=8）

注：與對照組比較，#P＜0.05 ；與模型組比較，*P＜0.05

HOMA-IR 4.88±1.10 12.69±3.32#8.96±1.91*8.54±2.18*8.98±2.49*組別對照組模型組陽性藥組白虎加人參湯加減方高劑量組白虎加人參湯加減方低劑量組劑量/（g·kg-1）--37.8 18.9 200 mg·kg-1

圖1 白虎加人參湯加減方對2 型糖尿病大鼠空腹血糖、胰島素、糖化血紅蛋白水平的影響（±s，n=8）Figure 1 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on FBG，INS and HbAlc levels in T2DM rats（±s，n=8）

2.2 白虎加人參湯加減方對T2DM 大鼠抗氧化應激水平的影響結果見圖2。與對照組比較，模型組大鼠胰腺組織的CAT、SOD、GSH-Px 水平均明顯降低（P＜0.05），MDA 水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組大鼠胰腺組織的CAT、SOD水平均明顯升高（P＜0.05）；陽性藥組及白虎加人參湯加減方高劑量組大鼠腺組織的GSH-Px 水平明顯升高（P＜0.05），MDA水平明顯降低（P＜0.05）。結果表明，白虎加人參湯加減方能夠提高T2DM大鼠的抗氧化應激水平。

圖2 白虎加人參湯加減方對2 型糖尿病大鼠抗氧化應激水平的影響（±s，n=8）Figure 2 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on anti-oxidative stress in T2DM rats（±s，n=8）

2.3 白虎加人參湯加減方對T2DM 大鼠肌肉組織中GLUT4 表達的影響結果見圖3。與對照組比較，模型組大鼠肌肉組織中GLUT4 蛋白及mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組大鼠肌肉組織中GLUT4 蛋白及mRNA 表達水平均明顯升高（P＜0.05）。

圖3 白虎加人參湯加減方對2 型糖尿病大鼠肌肉組織中GLUT4 表達的影響（±s，n=8）Figure 3 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on expression of GLUT4 in T2DM rats（±s，n=8）

2.4 白虎加人參湯加減方對T2DM 大鼠胰腺組織中AKT/GSK-3β/Nrf2 通路相關蛋白表達的影響結果見圖4 。與對照組比較，模型組中大鼠胰腺組織中的p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），n-Nrf2、n-Fyn、HO-1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組大鼠胰腺組織中的p-AKT/AKT、n-Nrf2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），n-Fyn 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；陽性藥組及白虎加人參湯加減方高劑量組大鼠胰腺組織中的p-GSK-3β/GSK-3β、HO-1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。

圖4 白虎加人參湯加減方對2 型糖尿病大鼠胰腺組織中AKT/GSK-3β/Nrf2 通路相關蛋白表達的影響（±s，n=8）Figure 4 Effect of Modified Baihu Plus Renshen Decoction on expression of AKT/GSK-3β/Nrf2-related proteins in T2DM rats（±s，n=8）

3 討論

在2 型糖尿?。═2DM）研究中，利用高脂高糖飼料飼養(yǎng)數(shù)周后再聯(lián)合注射小劑量STZ誘導的T2DM大鼠模型是目前被廣泛認可并應用的一類T2DM動物模型[8]。造模時首先通過給大鼠長期喂養(yǎng)高脂高糖飼料以造成胰島素抵抗（IR），然后再聯(lián)合注射小劑量STZ可破壞胰島β細胞，旨在模擬人類T2DM的自然病理過程[8-9]。本實驗結果顯示，模型組大鼠的FBG、HbAlc 及HOMA-IR 明顯升高，血清INS 水平明顯降低，該方法所建立的T2DM 模型成模率高，T2DM 特征明顯，穩(wěn)定性較好，且死亡率低。

臨床上T2DM 患者常伴隨著IR 和胰島β 細胞受損，造成INS 分泌減少或相對不足，引起FBG 升高。FBG是糖尿病的主要診斷指標，而HbAlc常作為反映血糖控制水平的主要指標。本研究結果顯示，給予白虎加人參湯加減方干預后，模型組大鼠的FBG 水平及HbAlc、HOMA-IR 均明顯降低，血清INS 水平明顯升高，表明白虎加人參湯加減方能夠降低T2DM大鼠的血糖水平，改善IR。

IR和胰島β細胞功能缺陷被認為是T2DM發(fā)病的重要病理生理機制[10]，而氧化應激可以通過干擾PI3K 活化轉導和GLUT4 轉位等與胰島素信號傳遞有關的生理活動而引發(fā)IR[2-4]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，GLUT4 表達下調、轉位障礙是IR 發(fā)病機制中的主要因素，GLUT4 作為一種膜蛋白主要分布在細胞內，正常狀態(tài)下胰島素效應器官中的GLUT4 會從胞內轉至細胞膜上，從而協(xié)助葡萄糖進入細胞及合成糖原，而在T2DM中該作用會被大大減弱。本研究結果顯示，白虎加人參湯加減方能夠改善T2DM大鼠的IR，明顯降低HOMA-IR值，可能與上調GLUT4表達密切相關。

當機體長期處于高血糖狀態(tài)，會在體內引起氧化應激，活性氧（ROS）異常增高，過量的ROS可啟動細胞線粒體凋亡程序，從而引發(fā)胰島β 細胞凋亡[12-14]。正常狀態(tài)下，可通過GSH-Px、SOD、CAT 等抗氧化酶來清除機體自由基和過氧化物，但是在T2DM中機體處于氧化應激狀態(tài)，脂質過氧化的降解產(chǎn)物MDA增多，抗氧化酶減少，導致機體ROS 大量形成，引起胰島β 細胞凋亡，導致IR 加重。本研究結果顯示，白虎加人參湯加減方能夠提高T2DM大鼠胰腺組織中SOD、GSH-Px 及CAT 水平，并降低MDA 水平，表明其能提高T2DM大鼠的抗氧化應激水平。

Nrf2/ARE 通路是細胞內重要的內源性抗氧化防御機制之一，而PI3K/AKT 信號通路廣泛參與了Nrf2的活化和核移位過程[15]。PI3K 通過磷酸化來活化AKT，活化的AKT進一步誘導GSK-3β磷酸化，從而抑制其活性，磷酸化GSK-3β可以降低Nrf2負向調節(jié)因子Fyn的核內轉移，減少Nrf2出核，使其在細胞核內與ARE 結合，進而誘導一系列抗氧化酶如HO-1、NQO-1 等的表達，對機體發(fā)揮抗氧化應激作用[16-17]。本研究結果顯示，白虎加人參湯加減方能夠明顯上調T2DM 大鼠胰腺組織中p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β 蛋白表達，下調n-Fyn 蛋白表達，從而使下游分子n-Nrf2、HO-1蛋白表達明顯上調。因此，初步推測白虎加人參湯加減方可能是通過調控AKT/GSK-3β/Nrf2 通路來發(fā)揮對T2DM 大鼠的抗氧化應激作用（見圖5）。

圖5 白虎加人參湯調控AKT/GSK-3β/Nrf2 通路對2 型糖尿病大鼠的抗氧化應激作用機制示意圖Figure 5 Schematic diagram of anti-oxidative stress mechanism of AKT/GSK-3β/Nrf2 pathway regulated by Modified Baihu Plus Renshen Decoction on T2DM rats

綜上所述，白虎加人參湯加減方可以降低T2DM大鼠的FBG、HbAlc、HOMA-IR 水平，促進INS 分泌，改善IR，可能與其上調骨骼肌GLUT4 表達密切相關；白虎加人參湯加減方還能夠提高T2DM大鼠胰腺組織中SOD、GSH-Px 及CAT 水平，降低MDA 水平，可能通過調控AKT/GSK-3β/Nrf2 通路來發(fā)揮抗氧化應激作用。但其緩解IR的作用是否與PI3K/AKT信號通路有關，有待進一步探討。