益生菌發(fā)酵飼料條件優(yōu)化及營養(yǎng)價值評定

萬 里,吳國芳,2,王 磊*,姚志芳,張志鵬,張俊峰

(1. 青海大學 畜牧獸醫(yī)科學院/青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室,青海 西寧 810016;2. 青海省高原家畜遺傳資源保護及創(chuàng)新利用重點實驗室,青海 西寧 810016)

由于飼料的短缺和新冠疫情的影響,飼料原料價格持續(xù)上漲。如何尋找新型飼料來源以及解決抗生素禁用的問題成為現(xiàn)代養(yǎng)殖的研究熱點[1]。利用微生物對飼料進行發(fā)酵可以使飼料產(chǎn)生較多的微生物代謝小分子[2]。目前使用最多的是固態(tài)發(fā)酵,原料經(jīng)過微生物進行固態(tài)發(fā)酵后,其含有的多糖類化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等一些大分子物質(zhì)被代謝為可以直接吸收運用的小分子物質(zhì),同時可以在一定程度上降低原料中抗營養(yǎng)因子含量,使發(fā)酵后的原料更易被動物機體消化和吸收。

畢赤酵母( Pichia pastoris) 是一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源生長的單細胞真核生物。畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展最為迅速的一種新型外源蛋白真核表達系統(tǒng),被廣泛應用于多種不同領域且成功表達了許多基因工程產(chǎn)品[3]。目前的研究表明,畢赤酵母已在食品以及飼料領域取得了一定的進展,如在食品領域果糖酶成功地被表達[5],在飼料領域植酸酶、木聚糖酶等被成功表達[6]。另外有研究表明,用畢赤酵母菌發(fā)酵豆粕,可以使豆粕產(chǎn)生酸香味,并可提高豆粕中CP的含量、降低NDF、ADF的含量,極大地改善豆粕的品質(zhì)[7]。

由于目前畢赤酵母作為微生態(tài)制劑在畜牧養(yǎng)殖中的報道較少,因此本試驗選用1株畢赤酵母菌對精補料進行發(fā)酵,從發(fā)酵飼料發(fā)酵條件優(yōu)化、發(fā)酵品質(zhì)來評價畢赤酵母菌的發(fā)酵效果,為畢赤酵母菌作為益生菌發(fā)酵飼料提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 畢赤酵母菌(Pichia yeast JZ10,菌種保藏號CCTCC M 2020843)。該菌株由青海大學畜牧獸醫(yī)科學院動物營養(yǎng)與飼料科學試驗室分離保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基(1L):酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、超純水1 000 mL。培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3 飼料配方及營養(yǎng)水平 飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平Table 1 Feed formula and nutritional level

1.1.4 儀器和設備 便攜式pH計、培養(yǎng)箱、電子天平、高壓立式蒸汽滅菌鍋、潔凈工作臺、500 mL絲口試劑瓶、多功能酶標儀、超速離心機、SZC-101脂肪測定儀、SLQ-202半自動粗纖維測定儀、自動凱氏定氮儀。

1.2 方 法

1.2.1 菌種活化 將所篩畢赤酵母菌接入YPD固體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)48 h,挑取單菌落接入20 mL無菌YPD液體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)48 h(一級菌種),取20 mL一級菌種接入2 L無菌YPD液體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)48 h(二級菌種)。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化 使用正交設計3因素3水平進行優(yōu)化,如表2所示。用電子秤稱取2.0 kg精補料,按照正交設計表算出所需酵母菌以及所用水的體積數(shù)(扣除菌液總體積),將菌液倒入水中,搖勻,均勻地灑在精補料上,拌勻之后分別裝入500 mL的絲口試劑瓶中,每組4個重復,壓實、蓋好蓋子,按照正交設計的溫度分別放入到3個對應的培養(yǎng)箱中,發(fā)酵5 d后取出,測定相應指標。以上一步優(yōu)化條件得到的最優(yōu)組合進行最優(yōu)發(fā)酵時間的確定,發(fā)酵時間為:0、1、3、5、7、14 d,分別測定其營養(yǎng)成分和霉菌毒素含量。

表2 L9(34)正交表Table 2 Orthogonal test design of L9(34)

1.2.3 指標測定 氨態(tài)氮(NH3-N)、可溶性糖(SS)、淀粉(ST)(氨態(tài)氮、可溶性糖、淀粉含量檢測試劑盒,購自北京索萊寶科技有限公司),pH(便攜式pH計)。黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮毒素(ZEN)(ELISA檢測試劑盒,購自眾美生物),CP含量測定采用凱氏定氮法[8],NDF、ADF含量測定采用范氏分析法[9],EE含量測定采用索氏抽提法[10]。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 正交設計結(jié)果采用極差分析法,飼料成分指標數(shù)據(jù)先用Excel 2010初步整理,然后使用SPSS 24.0軟件中的Anova程序?qū)?shù)據(jù)進行單因素方差分析,用Duncan法進行多重比較,顯著水平為0.05,結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示。文章中的圖片使用Origin 2018繪制而成。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設計參數(shù)結(jié)果

從表3中通過極差分析,pH、NH3-N、SS受因素的影響程度為B>C>A,ST為C>B>A,即pH、NH3-N、SS受因素B的影響最大,ST受因素C的影響最大,pH在B3水平下較低,因此pH的優(yōu)化組為F3、F9,ST在C1水平下較高,因此ST的優(yōu)化組為F1,NH3-N在B1、B2水平下較低,因此NH3-N的優(yōu)化組為F1、F5,SS在B1水平下較高,因此SS的優(yōu)化組為F1、F4,此時比較F1、F3、F4、F5、F9組,F1組pH太高,F3、F4、F9組NH3-N含量太高,均不符合要求,而F5組只有SS含量較低,其余指標都符合要求,因此最優(yōu)組為F5組。

表3 正交結(jié)果表Table 3 Orthogonal result table

2.2 發(fā)酵天數(shù)對飼料指標的影響

2.2.1 對飼料常規(guī)養(yǎng)分的影響 如圖1所示,飼料中CP含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加均顯著高于第0天(P<0.05),其余天數(shù)之間蛋白含量差異不顯著(P>0.05);發(fā)酵天數(shù)對EE的含量影響差異不顯著(P>0.05);NDF、ADF的含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加而顯著降低(P<0.05),以第7天最低。

圖1 發(fā)酵天數(shù)對飼料CP、EE、NDF、ADF含量的影響Fig. 1 The effect of fermentation days on the content of CP, EE, NDF and ADF in feed

2.2.2 對飼料NH3-N、SS、ST及pH的影響 如圖2所示,飼料NH3-N的含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加,除第1d外,均顯著高于第0天(P<0.05),第1、3、5、7天之間兩兩差異顯著(P<0.05),以第7天最高,第1天最低,第14天含量與第7天差異不顯著(P>0.05);ST、SS含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加均顯著高于第0天(P<0.05),以第5天最高,隨后開始下降;pH除發(fā)酵第1天外,均顯著低于第0天(P<0.05),第5天時達到最低,隨后趨于穩(wěn)定。

圖2 發(fā)酵天數(shù)對飼料NH3-N、ST、SS含量及pH的影響Fig. 2 The effect of fermentation days on feed NH3-N, ST, SS content and pH

2.2.3 對飼料霉菌毒素的影響 如圖3所示,AFB1的含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加,與第0天相比,除第1天差異不顯著(P>0.05),其余天數(shù)含量都顯著降低(P<0.05),以第5天含量最低;DON、ZEN的含量均隨發(fā)酵天數(shù)的增加而顯著降低(P<0.05),其中DON含量以第5天最低,ZEN含量以第7天最低。

圖3 發(fā)酵天數(shù)對飼料霉菌毒素含量的影響Fig. 3 The effect of fermentation days on feed mycotoxin content

3 討 論

3.1 最佳發(fā)酵條件的確定

接種量、溫度、濕度及發(fā)酵時間是影響益生菌發(fā)酵效果的重要因素[11]。接種量通過改變益生菌的生長代謝來影響其發(fā)酵效果,適宜的益生菌接種量是發(fā)酵充分完全的前提條件,過多或過少均會降低益生菌發(fā)酵效果。接種量過多會使微生物在一定量的培養(yǎng)基中產(chǎn)生過多代謝物,導致環(huán)境內(nèi)溶氧不足,發(fā)酵不充分,嚴重降低益生菌發(fā)酵效果;但接種量過少會因為微生物量小使培養(yǎng)基營養(yǎng)底物利用不完全,浪費部分營養(yǎng)底物,發(fā)酵不充分完全,降低發(fā)酵效果,升高發(fā)酵成本。因此,適宜的接種量是提高發(fā)酵效果的重要因素[12]。溫度是益生菌生長過程中影響一系列酶和化學反應的主要因素,菌株來源和菌株種類不同則其最適生長溫度有差異,在一定范圍內(nèi),菌株生長繁殖速度會隨溫度的升高而加快。益生菌發(fā)酵時高溫條件會提高酶促反應速率,增強呼吸強度,使益生菌生長代謝加快,但若提供過高的發(fā)酵溫度,同時隨著發(fā)酵過程不斷產(chǎn)熱,尤其在代謝旺盛期可能導致酶失活,酶促反應停滯,發(fā)酵周期隨著縮短,降低最終發(fā)酵效果;反之,若溫度過低,使酶促反應速率過慢,延長發(fā)酵周期,升高發(fā)酵成本[13]。因此,尋找益生菌適宜的發(fā)酵溫度才能使菌株發(fā)酵達到最佳狀態(tài),提高發(fā)酵效果。

濕度也是在飼料發(fā)酵過程中具有重要影響地位的因素之一。過低的水分含量會導致發(fā)酵底物溶解性和底物膨脹程度較低,降低微生物對底物營養(yǎng)物質(zhì)的利用率,影響微生物的生長代謝,使得發(fā)酵不充分;而過高的水分含量抑制發(fā)酵環(huán)境內(nèi)氧氣的流動性,影響微生物代謝,降低發(fā)酵效果,因此選擇適宜的發(fā)酵濕度是提高發(fā)酵效果的重要方法[14]。發(fā)酵時間是益生菌發(fā)酵飼料過程中至關重要的影響因素。發(fā)酵時間與發(fā)酵菌株的生長特性密切相關,發(fā)酵時間過短會導致發(fā)酵進行的不完全,浪費發(fā)酵底物營養(yǎng)物質(zhì);而發(fā)酵時間太長致使微生物達到衰退期,其代謝物的堆積使后期發(fā)酵過慢且產(chǎn)生無用的副產(chǎn)物消耗培養(yǎng)基營養(yǎng)成分,造成不必要的浪費,同時隨時間過長,雜菌生長的可能性增加,也浪費時間成本,降低發(fā)酵效果。因此,適宜的發(fā)酵條件是保證優(yōu)良發(fā)酵效果的根本保證[15]。

飼料中可溶性糖、淀粉含量較高為宜,NH3-N、pH、霉菌毒素含量較低為宜。影響指標的主次序與極差的大小呈正相關,結(jié)合極差分析的結(jié)果可得到F5組最符合要求,即接種量10%,溫度25 ℃,水料比1∶1。吝常華等[16]用芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母發(fā)酵豆粕時,得到最優(yōu)條件為:接種量15%、水料比1∶1、溫度31 ℃,用枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵時最優(yōu)條件為:接種量10%、水料比1.2∶1、溫度40 ℃。劉政等[17]研究表明:用酵母菌發(fā)酵豆粕的最佳條件為接種量11%、水料比1.25∶1、溫度30 ℃。本實驗所得到的條件部分與上述研究相一致,部分有差別,可能與測定指標、菌種不一致有關。

3.2 發(fā)酵天數(shù)對飼料營養(yǎng)成分的影響

飼料中的NDF、ADF 和 CP 含量是評價飼料品質(zhì)最重要的指標,NDF 和 ADF 含量越低,CP 含量越高,表明飼料品質(zhì)越好[18]。本試驗中發(fā)酵到第7天,粗蛋白、粗脂肪含量最高,NDF、ADF含量最低,說明發(fā)酵7 d,飼料的常規(guī)品質(zhì)較好。NDF、ADF含量降低的原因可能與發(fā)酵過程中產(chǎn)生分解纖維的酶類將植物細胞壁中的纖維降解為水溶性碳水化合物有關[19]。蛋白質(zhì)含量升高可能是因為發(fā)酵初期,畢赤酵母菌作為兼性厭氧菌消耗大量氧氣,使得乳酸菌大量繁殖,抑制了有害微生物的繁殖, 減少了發(fā)酵初期植物呼吸作用對蛋白質(zhì)的水解[20]。淀粉含量較高的原因可能是由于加入的是酵母菌,飼料內(nèi)部乳酸菌的數(shù)目較少,同型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵前期快速產(chǎn)酸不需要消耗太多能量來維持自身生長,發(fā)酵過程中較少淀粉被利用[21]。本試驗中氨態(tài)氮含量升高的原因可能是酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了少量乳酸菌,乳酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸也抑制了酵母菌等其他微生物的活動,pH維持在較高水平而使得蛋白酶活性部分受到抑制,從而氨態(tài)氮的含量較高[22]?？扇苄蕴呛可呖赡芘c發(fā)酵期間乳酸菌數(shù)目較少有關,活動不夠旺盛,消耗的可溶性糖較少。pH降低的原因是酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸導致酸度增加。益生菌發(fā)酵也可有效提高母豬配合飼料中粗蛋白的含量,顯著降低粗纖維含量[23]。研究表明,酵母菌在發(fā)酵飼料時可顯著增加飼料中CP和EE含量[24]。王小平等[25]用酵母菌和乳酸菌的復合菌劑對玉米青貯發(fā)酵,結(jié)果顯示玉米青貯的CP含量顯著升高、NDF、ADF含量顯著下降。孫培利等[26]采用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌復合菌種進行青稞發(fā)酵,結(jié)果淀粉含量整體提高。本試驗中,所篩畢赤酵母菌JZ10發(fā)酵飼料時顯著提升了飼料CP、EE、NH3-N、ST、SS含量,降低了NDF和ADF的含量,與前人研究結(jié)果相一致,因此可以說明該酵母菌可提高飼料營養(yǎng)價值。

3.3 發(fā)酵天數(shù)對飼料霉菌毒素的影響

飼料在制備的過程中不可避免地會感染到少數(shù)霉菌,這些霉菌通過代謝會分泌霉菌毒素,如AFB1、ZEN、DON等,動物進食飼料后健康遭受危害。已有研究表明,益生菌發(fā)酵可以降低飼料中霉菌毒素含量[27]。發(fā)酵過程中酵母菌通過消耗氧氣使得乳酸菌大量繁殖,通過消耗營養(yǎng)物質(zhì)使得酵母菌生長變慢。與乳酸菌不同的是,酵母菌的吸附產(chǎn)物更穩(wěn)定,不太可能再次釋放毒素,其原因是毒素與酵母菌細胞壁上的甘露糖形成了特定的互補結(jié)構[28]。研究結(jié)果表明,酵母菌吸附ZEA是因為其細胞壁中的功能性碳水化合物(葡甘聚糖聚合物)[29]。張麗霞[30]研究了釀酒酵母細胞壁中β-d-葡聚糖含量與霉菌毒素結(jié)合能力的關系,發(fā)現(xiàn)β-d-葡聚糖在ZEA吸附中起主要作用。Wang等[30-31]發(fā)現(xiàn),釀酒酵母能降解ZEN。Repeckiene等[32]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母對DON有良好的吸附能力,產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵飼料時降低了飼料原料中96%的AFB1[33],利用芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵可使豆渣生物飼料中嘔吐毒素含量符合國家飼料衛(wèi)生的限量標準[34]。本試驗中發(fā)酵到第5天AFB1、DON含量降低,發(fā)酵到第7天ZEN含量降低,符合上述研究,因此可認為畢赤酵母菌可降低霉菌毒素的含量。

4 結(jié) 論

畢赤酵母菌JZ10發(fā)酵全價料的最佳條件為:接種量10%,溫度25 ℃,水料比1∶1,發(fā)酵時間5～7 d,可提高飼料的營養(yǎng)成分,降低霉菌毒素的含量。