氣相色譜法測定清腸栓中樟腦殘留量和冰片含量

潘宇炯，何志高，周 昕，章恒周，楊月紅，黃景山 （.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院, 上海 0003；.上海萬仕誠藥業(yè)有限公司, 上海0507）

清腸栓是由上海市名中醫(yī)馬貴同教授創(chuàng)制的醫(yī)院制劑。該方基于潰瘍性結(jié)腸炎“濕熱瘀互結(jié)腸道”的關(guān)鍵病機(jī)，以清熱化濕、活血止血立法，在錫類散、青黛散治療黏膜潰瘍的基礎(chǔ)上優(yōu)化篩選而來[1-2]。主要由三七和青黛全粉入藥，五倍子和馬齒莧經(jīng)提取后浸膏粉入藥，再加入冰片、羊毛脂，以半合成脂肪酸酯為基質(zhì)制備而成的中藥栓劑。

冰片為一種傳統(tǒng)中藥，清香宣散，具有開竅醒神，清熱敗毒的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冰片具有鎮(zhèn)靜安神、醒腦、促透、抗菌、抗炎等作用[3]。冰片常被用于肛腸外科，可避免藥物的首過效應(yīng)，提高藥物有效性。冰片能開放并透過血腦屏障，有助于其他藥物通過血腦屏障，促進(jìn)療效[4]。

冰片具有揮發(fā)性，龍腦常被作為其主要的質(zhì)量控制指標(biāo)，含量測定方法主要包括氣相色譜法、衍生化高效液相色譜法、薄層色譜法等[5]。2020 年版《中國藥典》中，采用氣相色譜法測定，冰片含龍腦成分不得少于55.0%，樟腦不得超過0.50%[6]。 目前，已有文獻(xiàn)對清腸栓中三七皂苷、人參皂苷、沒食子酸、靛藍(lán)和靛玉紅進(jìn)行含量測定[7-8]，故本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜法對清腸栓中冰片含量進(jìn)行測定，并計(jì)算龍腦、異龍腦的相對含量，為進(jìn)一步提高清腸栓的質(zhì)量控制提供有效依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

7820A 型氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測（FID）（美Agilent 公司）；225D-1CN 型電子分析天平、BSA124S 型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度：十萬分之一）；S450H 型超聲波清洗器（德國Elma）。

1.2 試藥

清腸栓為院內(nèi)制劑室提供（批號：210420-210425、211018、211020、211022、211025、190107、190114、190121、190304、190311、190318、190408、190415、190422、190506、190513 和200302）；樟腦對照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號：2814，純度：95.0%）；龍腦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110881-201709，純度：99.6%）；異龍腦對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111512-201904，純度：98.4%）；水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）；乙酸乙酯（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent7890A 型氣相色譜儀FID 檢測器；DIKMA DM-Wax 聚乙二醇20 000（PEG-20M）毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；檢測器（FID）溫度為250 ℃；柱溫140 ℃；空氣流速為450 ml/min，氫氣燃?xì)饬魉贋?0 ml/min；尾吹氣為25 ml/min；分流比為20:1，進(jìn)樣量為1 μl。理論板數(shù)按龍腦峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2 對照品溶液的制備

稱取樟腦對照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯溶解，制成每1 ml 含樟腦0.1 mg 的對照品溶液。另取龍腦、異龍腦對照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯溶解，制成每1 ml 含龍腦0.3 mg、異龍腦0.2 mg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取清腸栓（批號：200 302）樣品10 粒，研細(xì)，取約60 mg，精密稱定，置10 ml 量瓶中，加乙酸乙酯8 ml，超聲（頻率37 kHz，功率800 w）處理30 min，放冷，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按清腸栓制劑處方比例，配制缺冰片的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 專屬性試驗(yàn)

精密吸取樟腦對照品溶液、龍腦和異龍腦對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各1 μl，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下方法分別進(jìn)樣測定，結(jié)果樟腦、異龍腦和龍腦對照品的理論板數(shù)分別為88 684、107 331、108 387，遠(yuǎn)大于規(guī)定的2 000。供試品溶液色譜圖中，未檢出與樟腦對照品溶液保留時(shí)間相同的色譜峰，陰性對照溶液色譜圖中在與龍腦、異龍腦相同保留時(shí)間處無干擾峰，表明該方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 樟腦對照品(A)、龍腦和異龍腦對照品(B)、陰性對照(C)和供試品溶液(D)

2.5.2 線性關(guān)系

分別精密稱取龍腦對照品14.92 mg、異龍腦對照品10.25 mg、樟腦對照品4.83 mg，置同一10 ml量瓶中，加乙酸乙酯溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml 含龍腦1.492 mg、異龍腦1.025 mg、樟腦0.483 mg 的混合對照品溶液，作為貯備液。

精密吸取5 份貯備液各1 ml，加乙酸乙酯分別稀釋50 倍、20 倍、5 倍、2 倍、1 倍；分別精密吸取5 個(gè)不同濃度的龍腦、異龍腦、樟腦混合對照品溶液，分別進(jìn)樣1 μl，按按“2.1 色譜條件”項(xiàng)下的方法測定，以進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程分別為：Y1=283.4X1+1.320（r=1.000，n=5） ；Y2=283.5X2+0.859 7（r=1.000，n=5）；Y3=276.9X3+0.544 4（r=1.000，n=5）。線性范圍分別為 0.0299～1.497μg、 0.0205～1.025μg、0.0097～0.4830μg。

2.5.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.1 ”項(xiàng)的方法測定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。結(jié)果龍腦、異龍腦、樟腦峰面積RSD 分別為0.3%、0.4%、0.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（批號：200 302），室溫下分別放置0、4、8、12、16、20、24 h，按“2.1 色譜條件”項(xiàng)下的方法測定，記錄峰面積。結(jié)果樟腦未檢出，龍腦與異龍腦峰面積的RSD 分別為1.6%和1.5%，表明供試品溶液在室溫下放置24h 穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取清腸栓樣品粉末60 mg（批號：200302），精密稱定，平行稱取6 份，按“2.3 供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)方法測定，結(jié)果均未檢出樟腦，龍腦和異龍腦平均含量的RSD分別為0.8%和1.1%（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn)

稱取清腸栓樣品粉末30 mg（批號：200302），精密稱定，平行稱取6 份，分別精密加入龍腦、異龍腦、樟腦對照品溶液，按“2.3” 項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)方法測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 龍腦回收率試驗(yàn)(n=6)

2.6 樣品含量測定

取清腸栓制劑2019、2021 年共20 個(gè)批次的樣品，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)方法測定，20 個(gè)批次均未檢出樟腦。樣品中龍腦和異龍腦含量見表2（表中1～10 為2019 年樣品，11～20 為2021 年樣品）。

表2 清腸栓樣品含量實(shí)驗(yàn)

3 討論

3.1 提取方式的考察

乙酸乙酯對冰片具有較好的溶解性，并且樣品中其他干擾成分的溶出較少，故選擇其作為提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取時(shí)間（15 min、30 min、45 min）對樣品提取效果的影響，觀察比較不同條件處理后供試品溶液色譜情況，根據(jù)含量結(jié)果選擇提取時(shí)間為30 min。最終以乙酸乙酯為提取溶劑，超聲處理30 min 作為供試品制備時(shí)的提取方式。

3.2 色譜條件的選擇

柱溫的選擇：由于2020 年版《中國藥典》中冰片含量測定選擇的注溫為140 ℃，而查閱文獻(xiàn)，部分實(shí)驗(yàn)者選擇的柱溫為160 ℃[9]，因此，我們分別選擇140 ℃和160 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)出峰時(shí)間及峰形比較，最終選擇140 ℃作為實(shí)驗(yàn)條件。色譜柱的選擇：實(shí)驗(yàn)研究使用的兩種色譜柱分別為DIKMA DM-Wax（PEG-20M）毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；Agilent HP-INNOWAX（PEG-20M）毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），比較兩種色譜柱的塔板數(shù)，實(shí)驗(yàn)顯示色譜峰分離度良好，說明色譜柱對樣品的測定結(jié)果影響較小，此方法具有普遍性，故最終選擇本實(shí)驗(yàn)室常用的DIKMA DM-Wax 色譜柱。樟腦檢出限和定量限確定：檢測限及定量限采用信噪比法確認(rèn)，當(dāng)信噪比（S/N）為3∶1 時(shí)，樟腦檢出限為1.4 μg/g；當(dāng)信噪比（S/N）為10∶1 時(shí)，其定量限為4.6 μg/g。

3.3 檢測指標(biāo)的選擇

2020 年版《中國藥典》中，冰片的描述為冰片（合成龍腦），其中對樟腦的檢測要求為不得超過0.50%。本次實(shí)驗(yàn)，通過查閱文獻(xiàn)，參考其它含冰片制劑中對樟腦殘留的檢測方法[10]，對清腸栓樣品進(jìn)行樟腦含量測定，發(fā)現(xiàn)成品栓劑中均未檢測到樟腦，證明我院制劑室所用冰片符合藥典的相關(guān)規(guī)定。

2020 年版《中國藥典》是以龍腦作為冰片的含量測定指標(biāo)，但通過查閱文獻(xiàn)可知，近年對冰片的含量測定中，多以龍腦與異龍腦總量來計(jì)算冰片的含量，[11-14]?？紤]到本次實(shí)驗(yàn)是完善清腸栓的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，提高制劑的穩(wěn)定性，故本實(shí)驗(yàn)以龍腦和異龍腦的總量來計(jì)算冰片的含量。

綜上所述，本方法為冰片中龍腦、異龍腦的含量測定和樟腦限度檢查制定提供參考，操作簡單、重復(fù)性良好、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于清腸栓中冰片的質(zhì)量控制。