吸附樹脂對唾液酸的分離純化

張振，李丹，陳辰，吳菁嵐，應(yīng)漢杰，喬浩

（南京工業(yè)大學(xué)國家生化工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 211816）

唾液酸（sialic acid，SA）是含有9個(gè)碳原子的一類羧基化單糖?；苌锏慕y(tǒng)稱[1-2]。因?yàn)镹-乙酰神經(jīng)氨酸最廣泛存在于自然界，所以通常所說的SA 是指N-乙酰神經(jīng)氨酸，本文中提到的SA 均為N-乙酰神經(jīng)氨酸。N-乙酰神經(jīng)氨酸純品為無色固體，無氣味，易溶于水，在水溶液中不發(fā)生變旋作用，CAS 登記號(hào)為131-48-6，分子式為C11H19NO9，分子量為306.3[3]。同時(shí)N-乙酰神經(jīng)氨酸在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，易溶于水，在甲醇和乙醇中微溶，在乙醚和酯類等溶劑中溶解度較低。SA在動(dòng)物細(xì)胞表面的糖蛋白和糖脂的糖鏈末端上廣泛地分布，能夠在細(xì)胞表面多種生理功能活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[3-4]。SA可以給大腦提供營養(yǎng)，是一種純天然的營養(yǎng)素，對于嬰兒的記憶提升和智力發(fā)育有很大的促進(jìn)作用[5]，因此可以作為嬰幼兒配方奶粉的組成成分。SA 因其本身能作為可被識(shí)別的受體用來掩蓋其他分子，所以被用來遮蓋惡性腫瘤細(xì)胞表面的抗原決定簇，增強(qiáng)機(jī)體自身的免疫力。與此同時(shí)SA及其衍生物因其重要價(jià)值，在治療流感、神經(jīng)性疾病、炎癥、腫瘤等方面也發(fā)揮著重要的作用[6-8]。

目前制備SA 的方法主要有：化學(xué)合成法，該方法用N-乙酰甘露糖胺和二叔丁基氧代丁二酸的鉀鹽縮合，在堿的催化下經(jīng)脫羧反應(yīng)可生成N-乙酰神經(jīng)氨酸[9]，缺點(diǎn)是反應(yīng)條件苛刻；酶法合成法，該方法利用N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸鈉和ATP 在SA 醛縮酶的催化下合成N-乙酰神經(jīng)氨酸[10-11]，缺點(diǎn)是合成原料價(jià)格昂貴；天然物抽提法，Juneja等[12]從禽蛋的蛋黃膜和系帶中提取SA已獲成功并已應(yīng)用于生產(chǎn)，Whitehouse 等[13]從牛乳乳清中提取SA，Schauer 等[14]報(bào)道了用熱乙醇法從血清中提取SA，該方法缺點(diǎn)是過程復(fù)雜，收率較低。目前被廣泛應(yīng)用的SA 制備方法為生物轉(zhuǎn)化法，該方法主要是以N-乙酰葡萄糖胺和過量的丙酮酸鈉為底物，以N-乙酰甘露糖胺為中間產(chǎn)物，通過生物合成的方法得到SA[15]。生物轉(zhuǎn)化法具有成本低廉、操作簡單的優(yōu)勢，為后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)SA 提供了可能。目前從轉(zhuǎn)化液中分離回收SA 主要通過強(qiáng)甲酸型的堿樹脂吸附SA，以甲酸作為洗脫劑[16]。甲酸屬于危險(xiǎn)化學(xué)品，腐蝕性大，會(huì)導(dǎo)致對SA 產(chǎn)品二次污染；且樹脂預(yù)處理步驟和后續(xù)再生過程比較復(fù)雜，造成SA的分離成本高。

本文采用一種實(shí)驗(yàn)室自制的新型吸附樹脂RH-1來分離回收轉(zhuǎn)化液中的SA，僅用水就可實(shí)現(xiàn)高效洗脫，研究了SA 在樹脂上的吸附平衡和吸附動(dòng)力學(xué)以及不同工藝條件下的柱動(dòng)態(tài)吸附和解吸的過程。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

唾液酸轉(zhuǎn)化液，由南京工業(yè)大學(xué)國家生化中心提供，以N-乙酰葡萄糖胺和過量的丙酮酸鈉為底物混合培養(yǎng)催化合成SA，最終轉(zhuǎn)化液中SA含量為20～35g/L。

轉(zhuǎn)化液的預(yù)處理：首先通過離心去除發(fā)酵液中的微生物細(xì)胞及其殘片等（4000r/min，20min），之后得到的上清液通過超濾進(jìn)一步地去除雜蛋白和色素等雜質(zhì)，即可得到包含目標(biāo)產(chǎn)物SA的清液。

樹脂的預(yù)處理：吸附樹脂RH-1由南京工業(yè)大學(xué)國家生化中心提供，實(shí)驗(yàn)前將樹脂先在無水乙醇中充分浸泡并不斷用玻璃棒攪拌，將樹脂中不溶于水的化合物充分洗出，浸泡完畢后用純水將樹脂上的乙醇沖凈以便備用。

1.2 SA檢測方法

SA分析方法由文獻(xiàn)[17]改進(jìn)得到。使用安捷倫高效液相色譜法（安捷倫1260型示差檢測器），固定相為a Bio-Rad Aminex HPX-87H column（300mm×7.8mm）、流動(dòng)相為10mmol/L H2SO4、流速為0.4 mL/min、柱溫為55℃、進(jìn)樣量為20μL。

1.3 SA吸附等溫線實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過預(yù)處理之后的樹脂，通過抽濾抽干水分，準(zhǔn)確稱取4g濕樹脂放入50mL的錐形瓶中。接著加入20mL 的SA 溶液，緊接著使用封口膜將錐形瓶密封完好，將密封完好的錐形瓶放入恒溫?fù)u床以120r/min 的速度振蕩10h，振蕩至溶液和樹脂充分平衡后，取上清液測定溶液中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度，計(jì)算交換容量。樹脂的靜態(tài)吸附容量見式(1)。

式中，qe為樹脂平衡吸附量，mg/g；c0為溶液初始濃度，g/L；ce為溶液達(dá)到吸附平衡時(shí)溶質(zhì)的平衡濃度，g/L；m為樹脂的質(zhì)量，g；V為溶液體積，mL。

1.4 SA吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

把三口燒瓶置于恒溫水浴中攪拌預(yù)熱至所需溫度后，準(zhǔn)確地稱取40g濕樹脂，將其放入三口燒瓶中，并且加入240mL的料液，以200r/min的攪拌速率進(jìn)行攪拌。立即攪拌計(jì)時(shí)，間隔一定時(shí)間取溶液測定SA 濃度。以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，樹脂吸附的SA濃度為縱坐標(biāo)作出SA的動(dòng)力學(xué)曲線。

1.5 SA動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

將初始濃度c0的目標(biāo)產(chǎn)物溶液，用蠕動(dòng)泵以一定的進(jìn)樣流量輸入裝滿樹脂的帶夾套的玻璃離子交換柱中，玻璃柱內(nèi)部直徑2cm，長度27cm，夾套內(nèi)通入用來保持恒溫環(huán)境的循環(huán)水。在柱的出口處用分布收集器定量收集樣品流出液，流出液每隔5min 收集一次，檢測其中的SA 濃度，直到流出液中SA 的濃度與進(jìn)料液中的濃度相等，說明此時(shí)的樹脂吸附達(dá)飽和。以流出液的體積為橫坐標(biāo)，SA流出液濃度與初始溶液濃度的比值c/c0為縱坐標(biāo)作圖。考察溫度、流速、高徑比、進(jìn)樣濃度對SA 動(dòng)態(tài)吸附的影響，得到不同條件下的穿透曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 SA在樹脂上的靜態(tài)吸附結(jié)果

2.1.1 SA在樹脂上的吸附等溫線模型

考察了在不同溫度（10℃、30℃、50℃）下，SA 在RH-1 上的吸附行為，并用Henry 模型[18-19]進(jìn)行擬合。

Henry吸附等溫線模型如式(2)所示。

式中，qe為樹脂達(dá)到吸附平衡時(shí)的平衡吸附量，mg/g；kL為Henry吸附等溫線Henry常數(shù)；ce為達(dá)到吸附平衡時(shí)溶液中的溶質(zhì)的質(zhì)量濃度，g/L。

2.1.2 溫度對SA吸附等溫線的影響

采用Henry 模型對SA 的吸附等溫線實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖1所示，擬合得到的結(jié)果列于表1中。由擬合得到的結(jié)果可以看出不同溫度下SA 在RH-1 樹脂上的吸附均滿足Henry 模型（R2=0.998），表現(xiàn)出了線性吸附行為。

表1 SA在RH-1樹脂上的吸附平衡參數(shù)

圖1 不同溫度下SA在RH-1樹脂上的吸附等溫線

由圖1 可知，SA 在RH-1 樹脂上的Henry 系數(shù)隨著溫度的升高而降低，這說明SA 在樹脂上的吸附過程是一個(gè)放熱的過程[20-21]，降低溫度有助于吸附，升高溫度有助于解吸。

2.2 樹脂吸附SA動(dòng)力學(xué)

2.2.1 表面擴(kuò)散模型

利用表面擴(kuò)散模型[22]研究RH-1樹脂吸附SA的動(dòng)力學(xué)，考察吸附時(shí)間t與樹脂吸附量之間的關(guān)系。表面擴(kuò)散模型可以模擬RH-1 樹脂吸附SA 的動(dòng)力學(xué)過程，也可以模擬SA 在樹脂RH-1 顆粒表面的擴(kuò)散過程。通過表面擴(kuò)散模型對不同初始濃度條件下SA吸附動(dòng)力學(xué)曲線進(jìn)行擬合。

表面擴(kuò)散模型如式(3)所示。

式中，r為樹脂的半徑，m；t為吸附時(shí)間，s；De為有效擴(kuò)散系數(shù)；Q為體積濃度，g/L。

當(dāng)邊界和初始條件為0時(shí)：

當(dāng)r=0時(shí)，= 0，Q=0，t=0

當(dāng)Q=q時(shí)，r=rP，t=無窮大

式中，q為實(shí)際進(jìn)樣濃度，g/L；rP為實(shí)際所用樹脂半徑，m。

平均絕對偏差D（%）如式(4)所示。

式中，cexp為實(shí)驗(yàn)濃度；cpred為根據(jù)擬合模型的濃度預(yù)測值。當(dāng)D值最小時(shí)，就表明該模型能很好地描述該動(dòng)力學(xué)過程。

2.2.2 初始濃度對SA吸附動(dòng)力學(xué)的影響

據(jù)初始條件溫度30℃，攪拌速率200r/min，分別選擇SA 初始濃度為10g/L、26.5g/L、60g/L 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表面擴(kuò)散模型進(jìn)行擬合，考察不同的初始濃度對其影響。以吸附時(shí)間t為橫坐標(biāo)，樹脂吸附量為縱坐標(biāo)，實(shí)驗(yàn)與擬合結(jié)果如圖2所示，模型的參數(shù)與其相關(guān)聯(lián)的平均偏差列于表2中。

表2 不同操作條件下表面擴(kuò)散模型參數(shù)

圖2 不同初始濃度條件下SA在RH-1樹脂上吸附動(dòng)力學(xué)

由圖2可以看出，SA在10min左右在樹脂上達(dá)到吸附平衡，說明SA 在樹脂上的傳質(zhì)速率較快。隨著SA 初始濃度的增加，樹脂對其吸附量也在增加。

由表2 可知，在同一溫度下，不同SA 的初始濃度，其De值一直保持穩(wěn)定，表明物質(zhì)的表面擴(kuò)散能力并不隨著溶液初始濃度的改變而改變。平均絕對偏差較小，表明表面擴(kuò)散模型能夠很好地?cái)M合SA在RH-1樹脂上的動(dòng)力學(xué)過程。

2.3 SA的動(dòng)態(tài)吸附與解吸行為

2.3.1 不同溫度下SA在RH-1上的穿透曲線

考慮在不同的溫度下，SA在RH-1樹脂上的穿透曲線，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著溫度的升高，SA 的穿透曲線提前[23]，其原因是該吸附過程為放熱過程，溫度升高使得SA 在樹脂上的吸附量下降，從而導(dǎo)致了SA 穿透曲線的提前，這與測定的吸附等溫線結(jié)果一致。由此可見，高溫更有利于SA在樹脂上的洗脫。隨著溫度的升高，SA在樹脂上的傳質(zhì)速率增大，能更快地達(dá)到吸附平衡。

圖3 溫度對SA在RH-1樹脂上穿透曲線的影響

2.3.2 不同初始濃度下SA在RH-1上的穿透曲線

分別測定不同初始質(zhì)量濃度（10g/L、30g/L 和50g/L）條件下SA 在RH-1 樹脂柱上的穿透曲線，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，不同初始濃度的SA在達(dá)到吸附平衡時(shí)所用時(shí)間相同，隨著SA 初始濃度提高，穿透時(shí)間不變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樹脂吸附容量隨著SA濃度的提升而增大。

圖4 初始濃度對SA在RH-1樹脂上穿透曲線的影響

2.3.3 不同流速下SA在RH-1上的穿透曲線

考察在不同流速（1mL/min、1.5mL/min 和2mL/min）條件下SA在樹脂柱上的穿透曲線，其結(jié)果如圖5所示，由圖5可知，在溫度和進(jìn)樣濃度相同的條件下，流量對穿透曲線的影響是隨著流速的增加，SA 穿透時(shí)間提前。由于吸附量是由其吸附等溫線決定，所以流速對SA 在樹脂上的吸附量沒有影響[24]。隨著流速的增大，唾液酸來不及在樹脂上達(dá)到吸附平衡，就開始流出，因此穿透時(shí)間提前。在較低的流速下，有利于唾液酸在RH-1樹脂上的吸附。但在較低的流速下，分離所需的時(shí)間也相應(yīng)較長。因此將傳質(zhì)效率與生產(chǎn)效率結(jié)合在一起考慮，流速選擇在1mL/min時(shí)較為合適。

圖5 流速對SA在RH-1樹脂上穿透曲線的影響

2.3.4 不同高徑比下SA在RH-1上的穿透曲線

隨著樹脂柱的高徑比增加，代表其理論塔板數(shù)增加，如果分離多組分物質(zhì)，每個(gè)組分之間的分離度也會(huì)隨其增加；但是增加高徑比也會(huì)導(dǎo)致物質(zhì)分離時(shí)間增加，柱壓增大，導(dǎo)致耗能增加，降低生產(chǎn)效率。因此在不同高徑比（6.5∶1、10∶1和13.5∶1）的條件下考察了SA在RH-1樹脂柱中的穿透曲線，結(jié)果如圖6。

圖6 高徑比對SA在RH-1樹脂上穿透曲線的影響

由圖6 可知，SA 的穿透時(shí)間隨著高徑比的增加而延長，吸附平衡時(shí)間增加，導(dǎo)致所需SA 進(jìn)樣量增加。為實(shí)現(xiàn)多組分的高效分離，因此可以選擇較大的高徑比。

2.3.5 SA在RH-1樹脂上的動(dòng)態(tài)吸附-解吸曲線

圖7 是在溫度30℃、流速為1mL/min、進(jìn)樣的質(zhì)量濃度為35g/L、進(jìn)樣量為0.1BV（1BV=11.2mL）、高徑比為13.5∶1的條件下SA在樹脂上的吸附-洗脫曲線。由圖7可知，采用水為洗脫劑，可以很快地把吸附在樹脂上的SA給洗脫下來，最終經(jīng)計(jì)算SA收率達(dá)到了99.8%。

圖7 SA在RH-1樹脂中的動(dòng)態(tài)吸附-脫附曲線

3 結(jié)論

選用了一種實(shí)驗(yàn)室自制的吸附樹脂RH-1用于SA的吸附分離，結(jié)論如下。

（1）靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)說明，Henry 模型能夠很好地?cái)M合SA 的吸附等溫線，隨著溫度升高，樹脂對SA 的吸附量減??；動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)說明，SA 在RH-1樹脂上的吸附動(dòng)力學(xué)曲線符合表面擴(kuò)散模型，且SA在樹脂上的吸附速率較快，10min內(nèi)即可達(dá)到吸附平衡。

（2）研究了溫度、進(jìn)樣料液濃度、上樣流速、高徑比對樹脂RH-1 吸附SA 的穿透曲線的影響，獲得了較佳動(dòng)態(tài)吸附工藝條件：溫度30℃，流速1mL/min，料液濃度35g/L，高徑比13.5∶1。經(jīng)純水洗脫后，SA收率為99.8%。