張家界和湘西地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌菌群多樣性比較分析

陳邵德罡，柯 悅，郭 壯，趙慧君，王玉榮*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽 441053）

鲊廣椒又稱酢辣椒、包谷酸辣子或鲊?yán)苯返?，其主要以玉米面或大米粉和辣椒為原料，加輔料剁碎拌勻經(jīng)密封發(fā)酵15～30 d而成，具有酸、辣和鮮的特點(diǎn)[1]。王玉榮等[2]通過研究發(fā)現(xiàn)湖北省當(dāng)陽地區(qū)鲊廣椒中主要細(xì)菌類群以乳酸桿菌（Lactobacillus）為主，其所在團(tuán)隊(duì)亦對(duì)湖北省秭歸[3]、荊州[4]和洪湖[5]地區(qū)以及貴州省遵義地區(qū)[6]鲊廣椒細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行了解析，亦發(fā)現(xiàn)Lactobacillus為其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。尹小慶等[7]對(duì)鲊廣椒中微生物和風(fēng)味之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了揭示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lactobacillus與47種揮發(fā)性化合物顯著相關(guān)（P＜0.05），且鲊廣椒特征風(fēng)味的形成與乳酸菌類群構(gòu)成息息相關(guān)[8]。由此可見，鲊廣椒中蘊(yùn)含了豐富的乳酸菌資源且其對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)的形成具有積極作用。

CAI W等[9]對(duì)湘西地區(qū)鲊廣椒和糯米酸細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然兩類淀粉質(zhì)發(fā)酵食品均富含乳酸菌，但由于其所使用的原料分別為大米和糯米，因而兩者細(xì)菌類群存在顯著的差異。CAI W等[10]亦發(fā)現(xiàn)，重慶和湖北地區(qū)的鲊廣椒細(xì)菌類群均以乳酸菌為主，但不同地區(qū)的鲊廣椒其乳酸菌類群構(gòu)成存在一定差異。湖南省位于長(zhǎng)江中游，大部分區(qū)域在洞庭湖以南，其中湖南西北部主要包括張家界市和湘西土家苗族自治州，多山地峰林，生態(tài)環(huán)境較好[11]。湘西土家苗族自治州地處低緯度帶，而張家界地處北中緯度，且兩地相差100多km，氣候和環(huán)境均存在一定差異。由此可見，對(duì)采集自張家界和湘西地區(qū)的鲊廣椒細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行比較分析，其研究數(shù)據(jù)不僅可以進(jìn)一步加深研究人員對(duì)鲊廣椒這一特色發(fā)酵食品的了解，亦可以論證地域因素是否會(huì)對(duì)鲊廣椒的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

本研究從湖南省張家界市采集了18份鲊廣椒樣品進(jìn)行了MiSeq測(cè)序，同時(shí)從MGRAST數(shù)據(jù)庫下載了湖南省湘西土族苗族自治州12份鲊廣椒樣品的細(xì)菌MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)2份數(shù)據(jù)進(jìn)行了合并分析，對(duì)2個(gè)地區(qū)鲊廣椒中關(guān)鍵細(xì)菌類群進(jìn)行了揭示，探討了地域因素對(duì)鲊廣椒細(xì)菌類群的影響，通過本研究的開展以期為鲊廣椒細(xì)菌多樣性和功能的研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；引物338F/806R：上海桑尼生物科技有限公司；10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；Axygen清潔試劑盒：康寧生命科學(xué)吳江有限公司；高通量測(cè)序配套試劑：美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Veriti FAST梯度PCR儀：美國(guó)ABI公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Nano Drop公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Fluor Chem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Protein Simple公司；PE300高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)DELL公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集

于2019年10月下旬從湖南省張家界市（E109°40′～111°20′，N28°52′～29°48′）采集鲊廣椒樣品18份，樣品均滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：1）發(fā)酵時(shí)間均為30 d左右；2）無異味及發(fā)霉現(xiàn)象；3）色澤微紅；4）所有原材料均在本地種植或生產(chǎn)。將樣品按照ZZJ1～ZZJ18進(jìn)行編號(hào)后，分別裝入采樣袋中密封保存并在常溫下帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.2 宏基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

每份樣品各取2 g，使用試劑盒進(jìn)行DNA提取，使用加入核苷酸標(biāo)簽（Barcord）的引物338F/806R對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和程序參照向凡舒等[12]的方法。將擴(kuò)增合格的產(chǎn)物置于干冰中寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

參照WANG Y等[13]的方法對(duì)張家界地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群下機(jī)序列進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控合格的序列合并為一個(gè)fna文件。從MGRAST數(shù)據(jù)庫（https：//www.mg-rast.org/）下載CAI W等[9]上傳的湖南省湘西土族苗族自治州12份鲊廣椒MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)編號(hào)為mgp103301，并將其與張家界地區(qū)鲊廣椒測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，合并后的fna文件上傳至QIIME（V1.9.1）平臺(tái)進(jìn)行生物信息學(xué)分析[14]，具體參照HOU Q等[15]的分析流程。首先按照97%相似性對(duì)序列集進(jìn)行劃分獲得操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣，繼而從每個(gè)OTU中選取一條代表性序列使用RDP（ribosomal database project 11.5）和Greengenes 13.5數(shù)據(jù)庫對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，明確其分類學(xué)地位，最后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行α多樣性和β多樣性分析。

1.3.4 鲊廣椒樣品細(xì)菌類群代謝通路的預(yù)測(cè)

基于Greengenes數(shù)據(jù)庫注釋后的代表性序列，使用PICRUSt（phylogeneticinvestigationofcommunitiesbyreconstruction of unobserved states）軟件[16]和蛋白質(zhì)直系同源簇（clusters of orthologous groups of proteins，COG）數(shù)據(jù)庫[17]對(duì)2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群有差異的主要代謝途徑進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

使用Past3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Mann-Whitney檢驗(yàn)對(duì)2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群的α多樣性指標(biāo)、優(yōu)勢(shì)種屬以及基因預(yù)測(cè)指標(biāo)進(jìn)行差異性分析。使用R軟件、Origin2017、GraphPad9.0軟件、STAMP軟件、AI軟件和Excel2016進(jìn)行繪圖及修改。使用Huttenhower實(shí)驗(yàn)室Galaxy Server進(jìn)行線性判別分析效應(yīng)大小（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群α和β多樣性分析

納入本研究的18份張家界鲊廣椒樣品通過MiSeq測(cè)序共獲得703 576條原始序列，經(jīng)質(zhì)控后得到702 540條有效序列，平均每個(gè)樣品包含39 030條序列。通過將其與從數(shù)據(jù)庫中下載的湖南省湘西土族苗族自治州12份鲊廣椒樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行合并分析，本研究計(jì)算了2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群的α多樣性指標(biāo)，結(jié)果見圖1。

圖1 兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒樣品細(xì)菌類群α多樣性指標(biāo)的比較分析Fig.1 Comparative analysis of α-diversity indexes among zha-chili samples collected from 2 regions

由圖1可知，經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、超1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05），由此可見，2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群的豐度和多樣性差異均無明顯差異（P＞0.05）。本研究進(jìn)一步基于加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離對(duì)2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，結(jié)果見圖2。

圖2 基于加權(quán)（A）和非加權(quán)距離（B）的2個(gè)地區(qū)鲊廣椒樣品細(xì)菌類群主成分分析Fig.2 Principal component analysis of bacterial groups in zha-chili samples collected from 2 regions based on weighted (A) and unweighted (B) UniFrac distance

由圖2可知，無論是基于加權(quán)還是非加權(quán)UniFrac距離，在主成分分析得分圖中2個(gè)地區(qū)的鲊廣椒樣品均呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢(shì)，這說明兩者細(xì)菌類群群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異。經(jīng)多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）發(fā)現(xiàn)，兩者差異顯著（P＜0.05）。由此可見，雖然2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌的豐度和多樣性無明顯差異，但其細(xì)菌類群群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。

2.2 兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群比較分析

經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，張家界和湘西2個(gè)地區(qū)共30份鲊廣椒樣品中的細(xì)菌類群劃分為24個(gè)門和397個(gè)屬?；陂T和屬水平，2個(gè)地區(qū)平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌類群比較分析見圖3。

圖3 基于門（A）和屬（B）水平2個(gè)地區(qū)鲊廣椒樣品細(xì)菌類群比較分析Fig.3 Comparative analysis of bacterial groups in zha-chili samples collected from 2 regions at the phylum (A) and genus level(B)

由圖3A可知，張家界地區(qū)鲊廣椒中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門主要為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），平均相對(duì)含量分別為95.59%和3.94%，而湘西地區(qū)鲊廣椒中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門主要為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），平均相對(duì)含量分別為66.08%、27.12%和6.45%。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)細(xì)菌門在2個(gè)地區(qū)鲊廣椒中差異均非常顯著（P＜0.01）。由圖3B可知，張家界地區(qū)鲊廣椒中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌屬主要為乳酸桿菌（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas），平均相對(duì)含量分別為93.04%和1.78%，而湘西地區(qū)鲊廣椒中平均相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌屬為乳酸桿菌（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、腸桿菌屬（Enterobacter）和科薩克氏菌屬（Kosakonia），平均相對(duì)含量分別為57.89%、19.26%、6.09%、2.82%、2.45%、2.08%和1.10%。張家界地區(qū)鲊廣椒中Lactobacillus和Pseudomonas相對(duì)含量顯著偏高（P＜0.05），而Acetobacter、Corynebacterium、Staphylococcus、Weissella、Enterobacter和Kosakonia等含量顯著偏低（P＜0.05）。

研究表明，乳酸桿菌是產(chǎn)自中國(guó)[18]、土耳其[19]和韓國(guó)[20]地區(qū)泡菜的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，鲊廣椒發(fā)酵原料中亦含有辣椒等蔬菜制品，且發(fā)酵方式亦為厭氧發(fā)酵。由此可見，由于發(fā)酵原料和發(fā)酵方式的相似性使得鲊廣椒和泡菜均蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源。雖然張家界和湘西地區(qū)相距僅100多公里，但本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌菌群多樣性存在顯著的差異，這可能與其生產(chǎn)工藝、使用原料和生態(tài)環(huán)境不同有關(guān)[21]。本研究團(tuán)隊(duì)從鲊廣椒中發(fā)現(xiàn)并命名了“恩施乳桿菌（L.enshiensis）”[22]、“鲊廣椒乳桿菌（L.zhachilii）”[23]、“安琪乳桿菌（Secundilactobacillus angeliisp.nov.）”[24]、“土家乳桿菌（Levilactobacillus tujiaesp.nov.）”[24]和“宜都促生乳桿菌（L.yiduensissp.nov.）”[25]共5個(gè)乳酸桿菌新物種，這表明鲊廣椒中乳酸菌類群的構(gòu)成具有一定的獨(dú)特性，本研究亦揭示了不同地區(qū)鲊廣椒的細(xì)菌多樣性存在差異，因而在后續(xù)研究中對(duì)華中乃至西南地區(qū)鲊廣椒中蘊(yùn)含的乳酸菌資源進(jìn)行挖掘保護(hù)是極為必要的。

2.3 兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒共有細(xì)菌類群分析

本研究進(jìn)一步對(duì)在2個(gè)地區(qū)30份鲊廣椒樣品中均存在的OTU進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖4。

圖4 兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒樣品共有細(xì)菌類群分析Fig.4 Core bacterial groups in zha-chili samples collected from 2 regions

由圖4可知，在張家界和湘西地區(qū)鲊廣椒中均存在的OTU有3個(gè)，分別為OTU11050、OTU21819和OTU7199，相對(duì)含量分別為5.38%、12.47%和7.04%，三者累計(jì)相對(duì)含量為24.89%。本研究在每個(gè)OTU中選取一條代表性序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其均隸屬于乳酸桿菌（Lactobacillus）。由此可見，雖然2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群存在顯著的差異，但亦共有部分乳酸桿菌類群，因而乳酸桿菌對(duì)鲊廣椒品質(zhì)的形成可能具有積極的作用。

2.4 兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒關(guān)鍵細(xì)菌類群的甄別

基于LEfSe分析兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒關(guān)鍵細(xì)菌類群的水平條形圖見圖5。由圖5可知，LEfSe的線性判別得分為3.0時(shí)，可篩選出22個(gè)豐度差異明顯的類群，其中9個(gè)類群在張家界地區(qū)鲊廣椒中明顯偏高，在屬水平上主要為乳酸桿菌（Lactobacillus）和假單胞菌（Pseudomonas），13個(gè)類群在湘西地區(qū)鲊廣椒中明顯偏高，在屬水平上主要為異桿菌屬（Allobaculum）、寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、產(chǎn)丙酸單孢菌屬（Propionicimonas）、藤黃單孢菌屬（Luteimonas）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）。值得一提的是，異桿菌屬（Allobaculum）、寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、產(chǎn)丙酸單孢菌屬（Propionicimonas）和藤黃單孢菌屬（Luteimonas）在2個(gè)地區(qū)30份鲊廣椒中的含量均偏低，平均相對(duì)含量分別為0.000 3%、0.005 2%、0.000 6%和0.001 4%。由此可見，Lactobacillus和Pseudomonas可作為張家界地區(qū)鲊廣椒中的生物標(biāo)志物，而醋酸桿菌屬（Acetobacter）可作為湘西地區(qū)鲊廣椒中的生物標(biāo)志物。

圖5 基于LEfSe分析兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒樣品關(guān)鍵細(xì)菌類群的水平條形圖Fig.5 Horizontal bar chart of key bacterial groups in zha-chili samples collected from 2 regions based on LEfSe analysis

2.5 兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群差異性代謝通路的預(yù)測(cè)

本研究使用PICRUSt分析了2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群的代謝途徑，共注釋到4 793個(gè)同源蛋白簇，獲得了8個(gè)存在顯著差異的代謝途徑，結(jié)果見圖6。

圖6 兩個(gè)地區(qū)鲊廣椒樣品細(xì)菌類群差異性代謝通路的預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of differential metabolic pathways in zha-chili samples collected from 2 regions

由圖6可知，代謝途徑R（一般功能預(yù)測(cè)）、S（功能未知）、E（氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝）和K（轉(zhuǎn)錄）在張家界地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群中顯著高表達(dá)（P＜0.05），而代謝途徑U（細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸）、C（能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換）、O（翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴隨蛋白）和L（復(fù)制、重組和修復(fù)）顯著低表達(dá)（P＜0.05），這說明張家界地區(qū)鲊廣椒中細(xì)菌類群對(duì)原料中的蛋白質(zhì)潛在利用率更高。

3 結(jié)論

張家界地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群以乳酸桿菌（Lactobacillus）和假單胞菌（Pseudomonas）為主。較之湘西地區(qū)鲊廣椒，雖2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌的豐度和多樣性無明顯差異，但其細(xì)菌類群群落結(jié)構(gòu)存在明顯的差異。Lactobacillus和Pseudomonas可作為張家界地區(qū)鲊廣椒中的生物標(biāo)志物，而醋酸桿菌屬（Acetobacter）可作為湘西地區(qū)鲊廣椒中的生物標(biāo)志物。此外，代謝途徑R（一般功能預(yù)測(cè)）、S（功能未知）、E（氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝）和K（轉(zhuǎn)錄）在張家界地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群中顯著高表達(dá)。由此可見，2個(gè)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類群和功能存在明顯差異。