EW-7197對TGF-β1誘導(dǎo)人Tenon囊成纖維細胞增殖和遷移的影響及機制

溫佳敏,鄭 磊,艾偉鵬

目的:探討ALK5抑制劑EW-7197對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的人Tenon囊成纖維細胞(HTFs)增殖和遷移的影響及其機制。

方法:采用MTS法檢測細胞增殖率,并摸索EW-7197最佳的作用濃度和作用時間。之后將細胞分為3個組,分別為正常對照組、TGF-β1誘導(dǎo)組和TGF-β1+EW-7197處理組,采用Transwell小室觀察各組細胞遷移情況,采用Western blot檢測各組細胞Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3的蛋白表達水平。

結(jié)果:MTS結(jié)果顯示,不同處理條件的EW-7197以6.0μmol/L作用24h的細胞增殖率最低(均P<0.01)。Transwell小室實驗結(jié)果顯示,TGF-β1誘導(dǎo)組的細胞遷移數(shù)量為228.0±17.0個/視野,明顯高于正常對照組(149.0±15.0個/視野)和TGF-β1+EW-7197處理組(46.0±8.0個/視野)(均P<0.01)。Western blot檢測結(jié)果顯示,TGF-β1誘導(dǎo)組細胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3相對表達量高于正常對照組和TGF-β1+EW-7197處理組(均P<0.001)。

結(jié)論:EW-7197能夠通過TGF-β/Smad信號通路抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HTFs增殖和遷移。

?KEYWORDS：glaucoma; EW-7197; Tenon fibroblasts; transforming growth factor-β1 (TGF-β1); scarring

0 引言

青光眼是一組由于病理性眼壓升高而導(dǎo)致視神經(jīng)損傷和不可逆視功能損害的眼病,預(yù)計2040年全球青光眼患病人數(shù)將達到1.2億[1-2]。小梁切除術(shù)是降低青光眼患者眼壓的經(jīng)典手術(shù)方式,但濾過通道瘢痕化嚴(yán)重影響了手術(shù)成功率[3]。盡管聯(lián)合使用5氟尿嘧啶或絲裂霉素C有助于抑制術(shù)后纖維細胞增生降低瘢痕化,但由于缺乏靶向性,這些藥物具有誘發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥的潛在風(fēng)險[4]。因此探索濾過通道瘢痕化的發(fā)病機制以及研發(fā)更安全有效的藥物具有重要的科學(xué)意義。國內(nèi)外大量研究證實,轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)/Smad通路的異常活化參與誘導(dǎo)了人Tenon囊成纖維細胞(human Tenon fibroblasts, HTFs)向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化,增加細胞外基質(zhì)合成,是青光眼濾過手術(shù)后的組織纖維化和瘢痕收縮的重要機制之一[5]。EW-7197是一種TGF-β Ⅰ型受體(TGF-βR Ⅰ,又稱為ALK5)小分子抑制劑,可以靶向拮抗TGF-β介導(dǎo)的信號傳導(dǎo),發(fā)揮抑癌效應(yīng)[6]。近年研究發(fā)現(xiàn),EW-7197還可以在肝臟、腎臟和肺等多器官纖維化動物模型中發(fā)揮拮抗纖維化的作用[7],但目前尚缺乏EW-7197拮抗結(jié)膜組織瘢痕化的研究。本研究擬探討EW-7197對TGF-β1誘導(dǎo)的HTFs增殖和遷移的影響及相關(guān)機制,為抑制青光眼濾過術(shù)后瘢痕化提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料人Tenon囊成纖維細胞系(HTFs)購自上海聯(lián)組生物科技有限公司(#C529);DMEM/F12培養(yǎng)基、青-鏈霉素、2.5g/L胰蛋白酶(美國Gibco公司);胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(中美合資蘭州民海生物);TGF-β1(美國Peprotech公司);MTS、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)(美國Sigma公司);EW-7197(美國MedChemexpress公司);Transwell小室(美國Corning公司);兔抗人Fibronectin(ab2413)、鼠抗人α-SMA(ab5694)(美國Abcam公司);p-Smad2(#18338)、p-Smad3(#9520)單克隆抗體(美國CST公司);羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG熒光二抗(美國Licor公司);Odyssey雙色紅外成像系統(tǒng)(美國Licor公司)。

1.2方法

1.2.1 HTFs培養(yǎng)及分組常規(guī)培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基(含有10% FBS和1%青-鏈霉素)內(nèi),每3d傳代1次,取對數(shù)期生長的細胞進行實驗,培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃,CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。將細胞分為正常對照組、TGF-β1誘導(dǎo)組和TGF-β1+不同濃度EW-7197處理組。正常對照組為細胞培養(yǎng)液中添加終濃度0.5% DMSO,TGF-β1誘導(dǎo)組為培養(yǎng)基中添加終濃度0.5% DMSO和1μL TGF-β1(終末濃度為10μg/mL)。為了篩選出EW-7197的最佳作用濃度和時間,各EW-7197處理組用混合有10μg/mL TGF-β1以及不同濃度的EW-7197(1.5、3.0、6.0、8.0μmol/L)的培養(yǎng)基分別作用不同時間點(6、12、24h),檢測細胞增殖情況。

1.2.2 MTS法測定細胞增殖率取生長狀態(tài)良好的HTFs,制成細胞懸液,計數(shù),以1×105個/毫升接種于96孔板。為了篩選最佳藥物濃度及作用時間,按照1.2.1分組方案加入200毫升/孔進行培養(yǎng);加入MTS 20μL,置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h;以加入MTS溶液20微升/孔作為空白孔。采用酶標(biāo)儀于490nm波長處檢測各孔的吸光度值(absorbance,A值)。計算細胞增殖率=(各組A值-空白孔A值)/(正常對照組A值-空白孔A值)×100%。所有實驗均獨立重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell小室檢測細胞遷移取對數(shù)期生長的HTFs,制成細胞懸液,計數(shù),以1×105個/孔鋪于6孔板中;待細胞貼壁后,根據(jù)摸索出的EW-7197最佳作用濃度和時間分為3組:正常對照組為細胞培養(yǎng)液中添加終濃度0.5% DMSO培養(yǎng)24h,TGF-β1誘導(dǎo)組為細胞培養(yǎng)液中添加終濃度0.5% DMSO及10μg/mL TGF-β1處理24h,TGF-β1+EW-7197處理組為細胞培養(yǎng)液中添加10μg/mL TGF-β1以及6.0μmol/L EW-7197的混合液處理24h;去除原培養(yǎng)基,PBS清洗1次,取少量胰酶消化并收集細胞;PBS清洗細胞3次,計數(shù),重懸于無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中;在Transwell小室上室中加入100μL密度為1×105個/毫升的細胞懸液,下室加入500μL含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)基,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h;棄去培養(yǎng)基,取出小室,用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞,遷移至下室的細胞用4%多聚甲醛固定5min,0.2%結(jié)晶紫染色8min,清水洗去多余結(jié)晶紫,晾干后,置于倒置顯微鏡下隨機選取3個視野拍照,并計數(shù)發(fā)生遷移的細胞數(shù)目。所有實驗均獨立重復(fù)3次。

1.2.4 Westernblot分析相關(guān)蛋白表達收集1.2.3分組方案中的各組細胞,用PBS洗滌,加入RIPA裂解緩沖液溶解細胞,離心半徑8cm,13 000r/min離心10min,收集上清液蛋白,采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜。將PVDF膜置于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉中室溫封閉1h,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% BSA稀釋的Fibronectin(1∶1000)、α-SMA(1∶1000)、p-Smad2(1∶1000)、p-Smad3(1∶1000)、Actin(1∶1000)抗體,搖床上室溫孵育30min,4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,每次5min;加入相應(yīng)IRDye 680CW或IRDye 800CW熒光二抗(均1∶1000),室溫避光孵育1h,使用LICOR-Odyssey系統(tǒng)顯影分析。以Actin為內(nèi)參照,計算各目的蛋白相對表達量。所有實驗均獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 EW-7197對TGF-β1誘導(dǎo)HTFs細胞增殖的影響MTS實驗結(jié)果表明,正常對照組、TGF-β1誘導(dǎo)組和TGF-β1+不同濃度EW-7197處理組在處理后不同時間點細胞增殖率總體比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。TGF-β1誘導(dǎo)組的細胞增殖率較正常對照組均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在EW-7197不同處理條件中,以6.0μmol/L EW-7197處理24h細胞增殖率最低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見表1。因此在后續(xù)實驗中選擇該藥物濃度和作用時間。

2.2 EW-7197對TGF-β1誘導(dǎo)HTFs細胞遷移的影響Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,正常對照組、TGF-β1誘導(dǎo)組、TGF-β1+EW-7197處理組細胞遷移數(shù)量分別為149.0±15.0、228.0±17.0、46.0±8.0個/視野,總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=68.091,P=0.001),其中TGF-β1誘導(dǎo)組細胞遷移數(shù)量較正常對照組明顯增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);TGF-β1+EW-7197處理組細胞遷移數(shù)量較TGF-β1誘導(dǎo)組明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,圖1)。

2.3 EW-7197對HTFs中TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白表達的影響Western blot檢測結(jié)果顯示,正常對照組、TGF-β1誘導(dǎo)組、TGF-β1+EW-7197處理組細胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3蛋白相對表達量總體比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與正常對照組相比,TGF-β1誘導(dǎo)組中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3蛋白的相對表達量明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與TGF-β1誘導(dǎo)組相比,EW-7197處理組細胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3蛋白的相對表達量明顯減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖2。

3討論

青光眼是一組通常由于房水引流障礙導(dǎo)致眼內(nèi)壓增高引起特征性視神經(jīng)萎縮和視野缺損的疾病。無論是何種類型的青光眼,積極降低眼壓達到靶眼壓、改善視網(wǎng)膜視神經(jīng)血液循環(huán)、減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的損害是青光眼治療的目標(biāo)[8]。小梁切除術(shù)是通過人為地開創(chuàng)一條濾過通道,將房水引流至鞏膜瓣和結(jié)膜瓣下,以期降低眼壓。但濾過泡的瘢痕化導(dǎo)致小梁切除術(shù)后1a的手術(shù)失敗率在9.35%～17.3%,這也一直困擾著手術(shù)醫(yī)生和患者[3]。迄今為止,廣譜抗代謝藥物5氟尿嘧啶或絲裂霉素C仍然在臨床上被用作拮抗術(shù)后濾過通道瘢痕化,但這類藥物存在一定的毒性或副作用,可能會引起角膜損害、低眼壓綜合征、眼內(nèi)炎等[9]。因此,探尋毒性更低、具有靶向性抑制術(shù)后濾過通道瘢痕化的藥物一直是青光眼領(lǐng)域研究的熱點,而其中涉及揭示術(shù)后結(jié)膜組織瘢痕化的潛在機制至關(guān)重要。

表1 不同濃度EW-7197對TGF-β1誘導(dǎo)HTFs細胞后不同時間點細胞增殖率比較

研究發(fā)現(xiàn),青光眼濾過術(shù)后HTFs會發(fā)生向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化,表現(xiàn)為細胞增殖和遷移能力增強,濾泡區(qū)域內(nèi)細胞外基質(zhì)大量合成堆積導(dǎo)致瘢痕形成[10]。在這一病理過程中,TGF-β信號通路的異?；罨徽J(rèn)為發(fā)揮著重要的作用[11]。TGF-β是生物體內(nèi)重要的細胞因子,由其介導(dǎo)的信號通路廣泛參與細胞增殖、分化、遷移等過程,而該信號通路的異常激活已經(jīng)被證實與人體多器官的纖維化存在關(guān)聯(lián)性,也參與了青光眼濾過術(shù)后瘢痕化的形成[12]。在我們的研究中證實,使用外源性TGF-β1刺激HTFs后會顯著增加后者的增殖和遷移能力,佐證了這一觀點。因此,理論上靶向阻斷TGF-β通路傳導(dǎo)被認(rèn)為可以抑制濾過術(shù)后纖維化的發(fā)生。而既往研究中應(yīng)用的一些TGF-β通路抑制劑已經(jīng)被證實可以減少青光眼濾過手術(shù)動物模型中濾過通道瘢痕化的面積,有利于降低術(shù)后眼壓[13-17]。

EW-7197是一種新型的TGF-β通路小分子抑制劑,作用靶點是TGF-βR I(又稱為ALK5),通過競爭性結(jié)合于ALK5胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點產(chǎn)生激酶抑制活性,從而能夠阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2/Smad3蛋白磷酸化及入核,減少TGF-β通路下游與組織纖維化及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關(guān)靶基因的表達[18]。EW-7197起初被發(fā)現(xiàn)可以抑制腫瘤細胞的侵襲、遷移以及EMT過程,近年來還被證實具有拮抗肝臟、腎臟、肺等器官動物模型纖維化的作用。諸如Park等[7]研究發(fā)現(xiàn),EW-7197可以通過阻斷TGF-β1/Smad2/3信號傳導(dǎo),降低不同器官纖維化小鼠模型中組織內(nèi)膠原蛋白、α-SMA、纖連蛋白等的表達,從而發(fā)揮抗纖維化作用,延長動物模型的生存周期。Binabaj等[19]則證實,EW-7197在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中可以發(fā)揮拮抗結(jié)直腸組織纖維化的作用,其機制與靶向抑制TGF-β1/Smad2/3通路,下調(diào)促纖維化基因表達,減少膠原組織在結(jié)直腸中的過度沉積有關(guān)。雖然在上述器官中,EW-7197展現(xiàn)了較好的抗纖維化效應(yīng),但目前尚缺乏其在眼部拮抗組織纖維化的研究。在本研究中,我們將EW-7197添加至TGF-β1誘導(dǎo)后的HTFs培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)可以呈濃度和時間梯度降低HTFs的細胞增殖能力。此外,使用6.0μmol/L作用濃度的EW-7197還可以顯著減弱HTFs的細胞遷移能力,初步在細胞實驗水平證實了EW-7197可能具有抑制青光眼濾過術(shù)后瘢痕化的作用。

為了更好地揭示EW-7197的作用機制,我們探索了該藥物對HTFs中TGF-β/Smad信號通路的影響,發(fā)現(xiàn)EW-7197可以降低p-Smad2、p-Smad3的蛋白表達水平,這與既往EW-7197在其他器官抗纖維化的作用機制一致[7,19],證實了EW-7197具有高度的特異性和靶向性。此外,我們還發(fā)現(xiàn)EW-7197可以明顯降低TGF-β/Smad下游重要靶點Fibronectin和α-SMA的蛋白表達水平,后二者均屬于細胞外基質(zhì)的重要組成成分[20],它們的表達減弱可能導(dǎo)致了HTFs的遷移能力降低。此外,Fibronectin和α-SMA也是HTFs向肌纖維細胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志[21],EW-7197對它們的抑制表達作用可能有助于減少HTFs在TGF-β1誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)分化。

綜上所述,本研究通過細胞實驗初步證實了EW-7197具有抑制TGF-β1誘導(dǎo)HTFs增殖和遷移的能力,可能與下調(diào)p-Smad2、p-Smad3的蛋白,阻斷TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)有關(guān)。接下來我們將進一步通過動物模型驗證EW-7197拮抗青光眼濾過術(shù)后瘢痕化的作用,以期為探尋青光眼術(shù)后濾過通道瘢痕化的機制和藥物研究提供一點參考。