自噬在視網(wǎng)膜和眼部疾病中的研究進(jìn)展

曾思雨,杜 磊,邢怡橋

自噬維持細(xì)胞內(nèi)成分降解和再循環(huán)的穩(wěn)態(tài),是一種關(guān)鍵的細(xì)胞質(zhì)量控制機(jī)制。在應(yīng)激反應(yīng)中,自噬促進(jìn)細(xì)胞成分的降解,以提供細(xì)胞代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)和能量。視網(wǎng)膜是眼睛中轉(zhuǎn)導(dǎo)和處理視覺信息的光敏組織,對(duì)物質(zhì)和能量需求極高,基礎(chǔ)水平的自噬對(duì)維持視網(wǎng)膜細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和視覺系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要。本文總結(jié)了自噬途徑參與青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良和視網(wǎng)膜脫離等眼科疾病的最新研究,為未來通過調(diào)控自噬治療眼部疾病提供理論依據(jù)。

?KEYWORDS：autophagy; retina; retinal ganglion cells; photoreceptor

0 引言

自噬是一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)成分降解和再循環(huán)的分解代謝途徑,將受損和衰老的細(xì)胞器和病原體等有害成分運(yùn)送到溶酶體中清除[1]。根據(jù)待降解物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體的方式,自噬分為3種類型:(1)巨自噬:雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)包裹蛋白質(zhì)和細(xì)胞器形成自噬體,自噬體隨后與溶酶體融合,在溶酶體水解酶的作用下進(jìn)行消化和降解;(2)分子伴侶介導(dǎo)的自噬:一種僅存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的選擇性降解物質(zhì)途徑,通過Hsc70伴侶蛋白識(shí)別特異性表達(dá)KFERQ氨基酸序列的靶蛋白;(3)微自噬:待降解物質(zhì)通過溶酶體或內(nèi)體膜內(nèi)陷進(jìn)入溶酶體[2-4]。

自噬發(fā)生在所有類型的細(xì)胞和組織中,正常生理狀態(tài)下處于低水平狀態(tài),有利于物質(zhì)循環(huán)、能量交換和信息傳遞,對(duì)維持生物體的穩(wěn)態(tài)起核心作用[5]。然而,自噬也可以被饑餓、缺氧和感染等應(yīng)激原誘導(dǎo),在這種情況下,自噬介導(dǎo)細(xì)胞成分的降解,以產(chǎn)生維持細(xì)胞代謝所需的能量和營養(yǎng)物質(zhì)[6]。此外,自噬是細(xì)胞內(nèi)主要的質(zhì)量控制途徑之一,主要降解錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器[7]。因此,自噬的缺陷和失調(diào)會(huì)破壞機(jī)體的平衡狀態(tài),導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生,例如癌癥、免疫性疾病和神經(jīng)退行性疾病等[8-9]。

1 自噬過程的調(diào)控

目前研究最多的巨自噬是一個(gè)受到嚴(yán)密調(diào)控的多步驟過程,上游調(diào)節(jié)因子雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)以相反的方式調(diào)控自噬整個(gè)過程[6]。自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes, ATGs)家族成員參與調(diào)節(jié)自噬的各個(gè)階段,轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB, TFEB)是ATGs的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[10-11]。在靜息狀態(tài)下,磷酸化TFEB定位于細(xì)胞質(zhì),而當(dāng)饑餓、感染等應(yīng)激發(fā)生時(shí),TFEB去磷酸化并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中,可直接與啟動(dòng)子序列結(jié)合,增強(qiáng)ATGs和溶酶體相關(guān)基因的表達(dá)[12]。此外,叉頭轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box O, FOXO)也是重要的自噬調(diào)節(jié)因子,在應(yīng)激的誘導(dǎo)下FOXO與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合,激活自噬基因的表達(dá)[8]。而He等[13]的研究表明FOXO的功能可能獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄調(diào)控,通過與細(xì)胞質(zhì)中的ATGs直接相互作用來調(diào)節(jié)自噬。最近一項(xiàng)研究表明,FOXO可以與TFEB形成復(fù)合物,作為組合轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[14]。

自噬過程包括誘導(dǎo)、起始、自噬前體形成、自噬體形成、與溶酶體融合和降解。(1)Unc51樣激酶(unc51-like kinase, ULK)復(fù)合體在自噬的啟動(dòng)中起核心控制作用,由ULK1、ATG13、ATG101和200kD的FLK家族相互作用蛋白(FLK family interacting protein of 200kD, FIP200)組成[15]。自噬啟動(dòng)激酶ULK1在應(yīng)激誘導(dǎo)下磷酸化激活,特異性地積累到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,與液泡分選蛋白15(vacuolar protein sorting, VPS15)、ATG14L和Beclin-1相互作用,增強(qiáng)VPS34復(fù)合物的募集[16]。隨后,活性的VPS34復(fù)合物作為Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)產(chǎn)生磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate, PI3P),促進(jìn)ATGs的募集,從而啟動(dòng)自噬前體形成[11]。(2)自噬體膜延伸是自噬體形成的關(guān)鍵步驟,涉及兩種由ATG7催化的泛素化反應(yīng),一種是形成自噬延伸復(fù)合物ATG5-12/16L1,另一種是微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅰ(microtubule-associated protein light chain3-Ⅰ, LC3-Ⅰ)與磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)偶聯(lián)形成自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ,允許自噬體膜延伸閉合至成熟。(3)自噬體最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體,自噬溶酶體中的貨物被溶酶體酶降解得以循環(huán)利用[17-18]。最新研究表明,自噬實(shí)際上是一個(gè)具有高度選擇性的過程,自噬體靶向降解特定的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)成分[19]。在選擇性自噬中,自噬受體的典型特征是含有LC3結(jié)合區(qū)域(LC3-interacting regions, LIRs),LIRs通過與LC3相互作用將泛素化的貨物連接到自噬體膜,進(jìn)行溶酶體降解[19]。

2 視網(wǎng)膜自噬

視網(wǎng)膜具有非常高的物質(zhì)和能量需求,用于維持神經(jīng)傳遞、光傳導(dǎo)和正常細(xì)胞功能所需的神經(jīng)元興奮性,高水平的基礎(chǔ)自噬對(duì)于視覺系統(tǒng)至關(guān)重要,自噬水平的降低會(huì)影響細(xì)胞代謝產(chǎn)物合成,減弱視網(wǎng)膜細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的調(diào)節(jié)能力[20-22]。自噬缺陷動(dòng)物模型的建立有助于深入探索自噬在各種組織中的作用,研究發(fā)現(xiàn)ATG4B缺陷的小鼠視網(wǎng)膜顯示LC3脂化水平降低和p62表達(dá)增多,證實(shí)視網(wǎng)膜基礎(chǔ)自噬水平降低[23-24]。此外,缺乏ATG5的視網(wǎng)膜在胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)分化減少和軸突發(fā)育缺陷[25]。然而,最新研究發(fā)現(xiàn),在病理情況下,過度激活的自噬可能會(huì)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)由于RGCs軸突部位線粒體降解增加,最終導(dǎo)致神經(jīng)變性[26-27]。這些結(jié)果表明視網(wǎng)膜依賴基礎(chǔ)自噬維持正常的結(jié)構(gòu)和生理功能,任何自噬缺陷或失調(diào)都會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),參與各種視網(wǎng)膜和眼部疾病的發(fā)生[28]。

3 自噬與眼部疾病

3.1青光眼青光眼是一種以RGCs不可逆丟失為特征的神經(jīng)退行性疾病,目前已成為世界上第二大致盲因素[29]。RGCs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中將視網(wǎng)膜視覺信息傳遞到大腦的神經(jīng)元,由于RGCs的不可替代性,通過有效的手段來逆轉(zhuǎn)RGCs損傷和視神經(jīng)萎縮至關(guān)重要[30-31]。利用小鼠視神經(jīng)橫斷模型,首次在體內(nèi)證實(shí)自噬對(duì)RGCs的保護(hù)作用,Rodríguez-Muela等[24]發(fā)現(xiàn)雷帕霉素誘導(dǎo)自噬使RGCs數(shù)量增加了40%,而特異性敲除小鼠ATG5基因后,RGCs存活率下降33%。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),在自噬缺陷的情況下,Ambra1+/gt小鼠RGCs對(duì)視神經(jīng)鉗夾損傷的易感性隨著年齡的增長而增加,表明自噬激活具有神經(jīng)保護(hù)作用[32]。

眼壓是青光眼發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素,由房水循環(huán)系統(tǒng)調(diào)節(jié),而小梁網(wǎng)作為房水的主要流出途徑,負(fù)責(zé)維持正常的眼壓水平,既往研究證實(shí)青光眼中存在小梁網(wǎng)的自噬失調(diào)[33-34]。Nettesheim等[35]的研究發(fā)現(xiàn),沉默ATG5和ATG7促進(jìn)了轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導(dǎo)的小梁網(wǎng)纖維化,導(dǎo)致房水外流減少,眼壓升高。而Zhu等[36]證明雷帕霉素可通過激活自噬減輕糖皮質(zhì)激素引起的眼壓升高、小梁網(wǎng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變和RGCs損傷。此外,在激光光凝誘導(dǎo)鞏膜外流道損傷模型中,Ⅲ型PI3K抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)使自噬流受阻,加重了高眼壓引起的軸突變性,相反,雷帕霉素表現(xiàn)出明顯的視神經(jīng)軸突保護(hù)作用[37]。因此,自噬調(diào)節(jié)可能成為改善青光眼RGCs變性的新治療靶點(diǎn)。

目前已經(jīng)在多種不同的青光眼模型中證實(shí)氧化應(yīng)激水平的增加,線粒體是細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要來源,高眼壓誘導(dǎo)線粒體裂變以及視網(wǎng)膜缺血均會(huì)刺激ROS的產(chǎn)生,過量的ROS對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成損傷,而RGCs由于耗氧量大對(duì)氧化損傷尤其敏感[21,38]。研究發(fā)現(xiàn),自噬缺陷動(dòng)物的細(xì)胞ROS水平升高,可能是由于自噬受損導(dǎo)致氧化細(xì)胞產(chǎn)物的清除障礙,通過誘導(dǎo)自噬減少氧化應(yīng)激損傷可能是青光眼治療的理想選擇[39]。

3.2年齡相關(guān)性黃斑變性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, ARMD)是一種累及黃斑的神經(jīng)退行性視網(wǎng)膜病變,視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigmented epithelium, RPE)變性是ARMD的早期病理標(biāo)志[40]。RPE細(xì)胞負(fù)責(zé)吞噬、降解和回收在視覺循環(huán)中脫落的光感受器外節(jié)(photoreceptor outer segments, POSs),維持光感受器的穩(wěn)態(tài),而既往研究證實(shí)RPE細(xì)胞中ATG5的缺陷會(huì)損害RPE細(xì)胞降解POSs的能力[5,41]。隨著時(shí)間的推移,未完全消化的POSs成分在RPE細(xì)胞溶酶體中逐漸積累,稱為脂褐素[42]。脂褐素是一種衰老的生物標(biāo)志物,主要成分是N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺(N-retinyl-N-retinylidene ethanolamine, A2E),抑制溶酶體水解酶活性的同時(shí)阻止其降解,對(duì)溶酶體功能造成障礙,所有ARMD相關(guān)事件中都可以觀察到自噬流和POSs降解的阻斷[20,43]。此外,研究發(fā)現(xiàn)衰老與自噬活性的下調(diào)密切相關(guān),證實(shí)自噬受損參與ARMD的病程進(jìn)展,自噬流障礙引起的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡是神經(jīng)退行性變的發(fā)病機(jī)制之一,提示刺激自噬可作為ARMD潛在的治療手段[16]。

目前,ARMD的大多數(shù)研究使用的是ARPE-19細(xì)胞系,ARPE-19細(xì)胞表達(dá)特征性的RPE標(biāo)記物[44-46]。最近,Fernandez-Godino等[47]通過基因編輯使ARPE-19細(xì)胞突變產(chǎn)生異常的細(xì)胞外基質(zhì),激活RPE細(xì)胞補(bǔ)體系統(tǒng),形成基底沉積物。研究發(fā)現(xiàn),使用A2E培養(yǎng)RPE細(xì)胞在早期誘導(dǎo)自噬,雷帕霉素通過mTOR通路增強(qiáng)自噬,改善A2E引起的細(xì)胞死亡,減少炎性因子和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)生成,發(fā)揮保護(hù)作用[48]。另外,Sun等[49]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,谷胱甘肽耗竭誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激升高RPE細(xì)胞自噬流水平,并引起衰老相關(guān)基因的表達(dá)增加,而雷帕霉素通過刺激自噬顯著改善細(xì)胞早衰,抑制自噬則產(chǎn)生相反的結(jié)果。Chan等[50]也報(bào)道了使用3-MA抑制自噬后,碘酸鈉誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞死亡和視網(wǎng)膜變性加重,表明自噬在ARMD早期階段保護(hù)RPE細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷,并為ARMD的靶向治療提供了新的思路。

3.3糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常見的眼部微血管并發(fā)癥,長期的高血糖誘發(fā)視網(wǎng)膜早期炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙和氧化損傷,周細(xì)胞丟失是DR早期標(biāo)志之一[51-53]。自噬在DR中的作用具有雙重性,早期DR中的自噬反應(yīng)一般由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo),促進(jìn)周細(xì)胞存活和受損蛋白的降解,然而當(dāng)處于長時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí),自噬加重周細(xì)胞死亡[54]。此外,血管外氧化和糖基化修飾的脂蛋白進(jìn)入視網(wǎng)膜后表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性,抑制細(xì)胞活性,加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的RPE損傷[55]。最近一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)暴露于高糖條件下的ARPE-19細(xì)胞自噬激活,使用3-MA抑制自噬后,細(xì)胞活性顯著下降,促進(jìn)ROS積累和炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β, IL-1β)的分泌,并激活NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體,提示自噬在DR中的細(xì)胞保護(hù)作用,可能成為預(yù)防DR發(fā)展和進(jìn)展的治療靶點(diǎn)[56]。

目前,越來越多的報(bào)道強(qiáng)調(diào)了視神經(jīng)變性在DR早期階段的重要性[20,52]。Amato等[57]發(fā)現(xiàn)用高糖處理的小鼠視網(wǎng)膜外植體中,神經(jīng)元細(xì)胞凋亡顯著增加,同時(shí)自噬通量顯著降低,奧曲肽通過抑制mTOR通路激活自噬,改善細(xì)胞凋亡,而用氯喹阻斷自噬后則消除了奧曲肽的抗凋亡作用,表明自噬和細(xì)胞凋亡之間的平衡對(duì)神經(jīng)元存活十分重要。Park等[58]也報(bào)道在DR中AMPK通路上調(diào)誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)RGCs的存活,而抑制自噬RGCs凋亡顯著增加。上述研究證實(shí)激活A(yù)MPK和抑制mTOR誘導(dǎo)自噬通量可以顯著改善視網(wǎng)膜變性,在DR中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

3.4視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良是一組遺傳異質(zhì)性視網(wǎng)膜疾病,主要由于光感受器功能障礙和死亡而導(dǎo)致不可逆的視力喪失[59]。視網(wǎng)膜色素變性是最常見的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良,其特征是早期階段視桿細(xì)胞的進(jìn)行性變性。導(dǎo)致各種炎癥因子以及ROS的釋放,改變光感受器穩(wěn)態(tài),進(jìn)而影響視錐細(xì)胞的存活[60]。

既往研究證實(shí),適當(dāng)?shù)淖允墒蔷S持光感受器穩(wěn)態(tài)所必需的,自噬缺陷引起視紫紅質(zhì)和轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的異常積累,導(dǎo)致光感受器死亡[61-62]。rd10小鼠是一種廣泛使用的視網(wǎng)膜色素變性模型,由于磷酸二酯酶β亞基突變導(dǎo)致酶功能異常,環(huán)鳥甘酸水平升高,引發(fā)視桿細(xì)胞變性和繼發(fā)性視錐細(xì)胞死亡[63]。Yang等[64]發(fā)現(xiàn)敲除Sigma-1受體的rd10小鼠早期激活視網(wǎng)膜自噬,保護(hù)視桿細(xì)胞免受損傷,隨著視桿細(xì)胞死亡加劇,細(xì)胞內(nèi)Ca2+大量積累誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,自噬流減少,引起壞死性凋亡和視錐細(xì)胞死亡。然而,過度激活的自噬在某些情況下可能會(huì)加劇光感受器變性,相反,適當(dāng)阻斷自噬促進(jìn)蛋白酶體的激活,加速錯(cuò)誤折疊的視紫紅質(zhì)降解,促進(jìn)光感受器存活[65]。上述研究表明自噬對(duì)于視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的存活十分重要,未來可能成為光感受器退行性病變的治療靶點(diǎn)。

3.5視網(wǎng)膜脫離視網(wǎng)膜脫離是指神經(jīng)上皮層與RPE的分離,由于光感受器失去RPE的營養(yǎng)供給和代謝支持,引起光感受器缺氧、營養(yǎng)剝奪和細(xì)胞死亡[66]。視網(wǎng)膜脫離早期誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞自噬的激活,阻斷自噬后光感受器細(xì)胞凋亡增加,隨著脫離的時(shí)間延長,自噬通量降低,光感受器細(xì)胞由存活轉(zhuǎn)變?yōu)樗劳鯷67]。Xiao等[68]也發(fā)現(xiàn)ATG5基因敲除小鼠視網(wǎng)膜脫離后視桿細(xì)胞凋亡和程序性壞死增加,自噬促進(jìn)光感受器內(nèi)蛋白質(zhì)的降解,抵抗其細(xì)胞毒性作用。此外,Ding等[69]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷帕霉素自噬在視網(wǎng)膜脫離過程對(duì)光感受器細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用,自噬的激活抑制ROS生成和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放,減少光感受器細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。因此,誘導(dǎo)自噬延長光感受器的存活時(shí)間是視網(wǎng)膜脫離的關(guān)鍵治療策略。

4 小結(jié)

本文總結(jié)了自噬在視網(wǎng)膜和眼部疾病中的重要作用,視網(wǎng)膜依賴基礎(chǔ)自噬維持正常的結(jié)構(gòu)和生理功能,任何自噬缺陷或失調(diào)都會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),因此,自噬-溶酶體途徑的改變與許多常見的眼部疾病高度相關(guān),自噬在病理情況下主要用于維持RGCs和軸突的穩(wěn)態(tài),并促進(jìn)POSs降解和視覺循環(huán)以保護(hù)光感受器和視網(wǎng)膜功能,然而,過度激活的自噬也可能會(huì)產(chǎn)生有害作用。促進(jìn)自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和增強(qiáng)溶酶體活性有望用于治療眼部疾病和其他神經(jīng)退行性疾病,在特定條件下,一些自噬誘導(dǎo)劑已被證實(shí)可以顯著抑制眼部疾病的進(jìn)展,減輕視力喪失。然而,由于自噬在不同疾病類型和階段的作用機(jī)制可能不同,未來需要更多的研究了解自噬是如何特異性調(diào)節(jié)各種視網(wǎng)膜細(xì)胞。綜上所述,通過調(diào)控自噬治療眼部疾病已成為一種可行的思路,進(jìn)一步的研究有助于我們了解以自噬和溶酶體途徑為靶點(diǎn)的治療策略在臨床應(yīng)用中的潛力。