加蘭他敏介導(dǎo)Nrf2/HO-1 信號通路對慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

米娜瓦爾·哈帕爾，地力努爾·吐爾遜江，滿爾哈巴·海如拉

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830001

2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830001

青光眼是由多因素引起的一種進(jìn)行性視神經(jīng)病變，是僅次于白內(nèi)障的第二大常見致盲疾病[1]。視神經(jīng)萎縮、視野缺損、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）丟失是青光眼的主要病理特征，病理性眼壓升高是青光眼發(fā)生、發(fā)展最重要的危險因素之一，病理性眼壓升高引起的不可逆神經(jīng)損傷也是青光眼致盲的主要原因[2-3]。因此，青光眼的臨床治療主要集中在使用藥物或手術(shù)方法降低病理性眼壓[4]，但由于慢性高眼壓直接或間接誘導(dǎo)了RGCs 損傷，使得降低病理性眼壓治療并不能完全阻止青光眼神經(jīng)變性的不可逆病程[5]。當(dāng)前，探索預(yù)防和緩解RGCs 損傷的新靶點和新療法，降低疾病進(jìn)展已成為青光眼治療研究的重要方向。加蘭他敏是一種小分子乙酰膽堿酯酶抑制劑和煙堿受體激動劑，其與煙堿受體變構(gòu)位點相互結(jié)合，可提高乙酰膽堿內(nèi)在作用，同時能夠增強大腦膽堿能系統(tǒng)活性，因此，加蘭他敏在臨床上被用于改善阿爾茨海默病患者的認(rèn)知缺陷[6]。研究表明，加蘭他敏具有神經(jīng)保護(hù)作用，可改善神經(jīng)毒劑誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)和生化變化[7]。Naguib 等[8]研究報道，加蘭他敏在爆炸誘導(dǎo)的間接創(chuàng)傷性視神經(jīng)病變小鼠模型中可減輕視神經(jīng)軸突變性減少以及視覺功能缺陷。加蘭他敏可能是視神經(jīng)病變的潛在有效治療藥物。然而，加蘭他敏是否在青光眼相關(guān)的慢性高眼壓所致RGCs 損傷中發(fā)揮保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究以慢性高眼壓大鼠模型為研究對象，探討加蘭他敏對慢性高眼壓大鼠RGCs 損傷的影響作用及相關(guān)分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，6～8 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（新）2018-0002。飼養(yǎng)條件為通風(fēng)良好，室溫20～25 ℃，相對濕度55%～75%，12 h/12 h 光暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水。本實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)后實施（審批號K202209-04）。

1.2 試劑和儀器

加蘭他敏（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號G125955-100 mg）購自上海阿拉丁生化科技公司；核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶-1（HO-1）信號通路抑制劑ML385（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號SML1833-25 MG）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、增強型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（批號HZ2144、HZ0164）購自上海滬震實業(yè)有限公司；TUNEL 染色試劑盒（批號CA1040）購自北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒（批號 BLL100304E、BLL100322E、BLLX8426J）購自上海佰利萊生物科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒（批號FT-P91144T）購自上海梵態(tài)生物科技有限公司；Nrf2、HO-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（批號ab62352、ab305290、ab8245）以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 二抗（批號ab150077）均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

ICARETONOVET 型便攜式動物眼壓計（上海弗安企業(yè)發(fā)展有限公司）；WFL-200Z 型光學(xué)顯微鏡（深圳微特視界科技有限公司）；MF53-M 型倒置熒光生物顯微鏡（山東千司科學(xué)儀器有限公司）；YKSY96A 型多功能酶標(biāo)儀（山東云科智能科技有限公司）；WD-9413C 型多功能凝膠成像系統(tǒng)（山東歐萊博醫(yī)療器械有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 慢性高眼壓大鼠模型的建立 大鼠飼養(yǎng)1 周適應(yīng)環(huán)境后，將右眼定為實驗眼，參照文獻(xiàn)報道，采用鞏膜上靜脈烙閉法造模[9]：ip 3%戊巴比妥鈉對大鼠進(jìn)行全身麻醉，并用0.5 %鹽酸丙美卡因滴眼液行右眼表面麻醉。撐開大鼠右眼上下眼瞼及顳側(cè)眼瞼，在距角鞏膜緣約1 mm 處，于11 點方向剪開球結(jié)膜，鈍性分離筋膜，將角鞏膜緣后3～4 mm 處發(fā)現(xiàn)的3 支叢狀、色暗紅、較粗的鞏膜靜脈用止血器依次進(jìn)行烙閉。近角鞏膜緣段血管充血怒張，遠(yuǎn)角鞏膜緣段血管血流消失，血管無連接點，且無新鮮出血，表明烙閉成功。術(shù)后檢測大鼠的眼壓超過22 mm Hg（1 mm Hg＝133 Pa）即表示造模成功。術(shù)后用生理鹽水沖洗術(shù)眼結(jié)膜囊，平復(fù)球結(jié)膜，用左氧氟沙星滴術(shù)眼，大鼠麻醉蘇醒后入籠。術(shù)后1周以左氧氟沙星滴術(shù)眼，2 次/d。左眼不作處理。

1.3.2 實驗分組和給藥干預(yù) 48 只SD 大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、加蘭他敏組、加蘭他敏＋ML385 組，每組12 只。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行與造模同樣的操作但不烙閉鞏膜靜脈。模型組、加蘭他敏組、加蘭他敏＋ML385 組大鼠均建立慢性高眼壓模型。造模成功后，參照文獻(xiàn)報道[10]并結(jié)合預(yù)試驗結(jié)果進(jìn)行給藥干預(yù)，加蘭他敏組大鼠ip 4 mg/kg 加蘭他敏溶液；加蘭他敏＋ML385 組大鼠ip 4 mg/kg 加蘭他敏溶液和30 mg/kg ML385；假手術(shù)組和模型組大鼠均ip 等體積的生理鹽水，1 次/d，均連續(xù)給藥14 d。

1.3.3 大鼠眼壓測定 大鼠清醒狀態(tài)下采用便攜式動物眼壓計測定大鼠眼壓，眼壓為3 次測試結(jié)果的平均值。分別測定造模前3 d、造模后30 min、造模后1、7、14 d 大鼠眼壓，測量時間為每天上午10:00～11:00。

1.3.4 樣本采集 給藥結(jié)束后，對大鼠實施安樂死，完整取出眼球，每組分別取6 只大鼠眼球置于4%多聚甲醛溶液固定，6 只大鼠眼球在顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜組織，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.5 HE 染色 HE 染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)及RGCs 數(shù)量。取固定后的大鼠眼球進(jìn)行石蠟包埋，沿大鼠眼球視神經(jīng)長軸方向行連續(xù)切片，切片厚度為5 μm。切片在60 ℃烘烤2 h 后，脫蠟至水，用蘇木精染色10 min，自來水洗滌1 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水洗滌后，1%伊紅染液染色5 min，常規(guī)透明、封片，顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)以及大鼠RGCs 數(shù)量。

1.3.6 TUNEL 染色檢測RGCs 凋亡 切片脫蠟、水化后，用蛋白酶K 溶液于37 ℃處理15 min，清洗，置于0.3%過氧化氫溶液中室溫孵育30 min，清洗切片，滴加50 μL TUNEL 混合液，37 ℃避光孵育60 min，清洗后，加入50 μL 鏈轉(zhuǎn)化POD 于37 ℃孵育30 min，滴加DAB 顯色液孵育10 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，在熒光顯微鏡下拍照。計算RGCs 凋亡率。

RGCs 凋亡率＝RGCs 凋亡細(xì)胞數(shù)/RGCs 總細(xì)胞數(shù)

1.3.7 大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平檢測 取大鼠視網(wǎng)膜組織制成組織勻漿液，離心收集上清液，按照試劑盒說明書檢測視網(wǎng)膜組織中SOD、CAT、MDA水平。

1.3.8 Western blotting 法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2/HO-1 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 從大鼠視網(wǎng)膜中提取總蛋白，用BCA 蛋白測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。取定量蛋白質(zhì)由SDS-PAGE 分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜在含5%脫脂干奶的阻斷緩沖液中阻斷1 h，用PBST 緩沖液清洗，并與Nrf2（1∶500）、HO-1（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）一抗在4 ℃下孵育1 h，用PBST 清洗膜，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，用PBST 清洗膜，以ECL 試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH 為內(nèi)參對照，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白與GAPDH 的灰度值之比表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 加蘭他敏對大鼠眼壓的影響

造模后30 min 和造模后1 d，模型組、加蘭他敏組、加蘭他敏＋ML385 組大鼠眼壓較假手術(shù)組均顯著升高（P＜0.05），造模后7、14 d，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠眼壓顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，加蘭他敏組大鼠眼壓顯著降低（P＜0.05）；與加蘭他敏組相比，加蘭他敏＋ML385 組大鼠眼壓顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 加蘭他敏對大鼠眼壓的影響（，n=12）Table 1 Effect of galanthamine on Intraocular pressure in rats (,n=12)

表1 加蘭他敏對大鼠眼壓的影響（，n=12）Table 1 Effect of galanthamine on Intraocular pressure in rats (,n=12)

與假手術(shù)組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與加蘭他敏組比較：&P＜0.05（1 mm Hg＝133 Pa）*P <0.05 vs sham operation group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs galanthamine group（1 mm Hg＝133 Pa）

2.2 加蘭他敏對大鼠視網(wǎng)膜病理形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，細(xì)胞排列整齊，RGCs 呈規(guī)則的圓形或橢圓形；模型組大鼠視網(wǎng)膜明顯變薄，結(jié)構(gòu)紊亂，RGCs 數(shù)目減少，形態(tài)不規(guī)則、且排列錯亂，可見部分細(xì)胞核裂解、變性，內(nèi)外核層排列疏松。加蘭他敏組大鼠視網(wǎng)膜各層次結(jié)構(gòu)較為規(guī)整，層次清晰，RGCs 形態(tài)大致正常，排列規(guī)則，內(nèi)外核層排列稍紊亂，視網(wǎng)膜病理損傷較模型組明顯減輕；加蘭他敏＋ML385組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較紊亂，RGCs 形態(tài)不規(guī)則，排列較錯亂，內(nèi)外核層排列疏松，視網(wǎng)膜病理損傷較加蘭他敏組明顯加重，見圖1。

圖1 加蘭他敏對大鼠視網(wǎng)膜病理形態(tài)的影響（HE，×200）Fig.1 Effect of galanthamine on pathological morphology of retina in rats (HE staining,×200)

2.3 加蘭他敏對大鼠RGCs 數(shù)量的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠RGCs 數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，加蘭他敏組大鼠RGCs 數(shù)量顯著增多（P＜0.05）；與加蘭他敏組相比，加蘭他敏＋ML385 組大鼠RGCs 數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖2。

圖2 加蘭他敏對大鼠RGCs 數(shù)量的影響（，n=12）Fig.2 Effect of galanthamine on the number of RGCs in rats (,n=12)

2.4 加蘭他敏對大鼠RGCs 凋亡的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠RGCs 凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，加蘭他敏組大鼠RGCs 凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與加蘭他敏組相比，加蘭他敏＋ML385 組大鼠RGCs 凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖3、4。

圖3 加蘭他敏對大鼠RGCs 凋亡的影響（TUNEL 染色，×400）Fig.3 Effect of galanthamine on apoptosis of RGCs in rats(TUNEL staining,×400)

圖4 加蘭他敏對大鼠RGCs 凋亡率的影響（，n=12）Fig.4 Effect of galanthamine on apoptosis rate of RGCs in rats (,n=12)

2.5 加蘭他敏對大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、CAT 活性均顯著降低，MDA 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，加蘭他敏組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、CAT 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低（P＜0.05）；與加蘭他敏組相比，加蘭他敏＋ML385 組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、CAT 活性均顯著降低，MDA 含量顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 加蘭他敏對大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激水平的影響（，n=12）Table 2 Effects of galanthamine on oxidative stress in retinal tissue of rats (,n=12)

表2 加蘭他敏對大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激水平的影響（，n=12）Table 2 Effects of galanthamine on oxidative stress in retinal tissue of rats (,n=12)

與假手術(shù)組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與加蘭他敏組比較：&P＜0.05*P <0.05 vs sham operation group;#P <0.05 vs model group;&P <0.05 vs galanthamine group

2.6 加蘭他敏對大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2/HO-1 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，加蘭他敏組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與加蘭他敏組相比，加蘭他敏＋ML385 組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

3 討論

青光眼是全球不可逆失明的主要原因，其特征是RGCs 的逐漸喪失。有研究估計，目前全球約有60 萬人患有青光眼，隨著人口老齡化的快速增長，青光眼發(fā)病率呈持續(xù)升高趨勢[11]。病理性眼壓升高被認(rèn)為是青光眼的關(guān)鍵危險因素，因此許多學(xué)者通常選擇誘導(dǎo)病理性眼壓升高來構(gòu)建青光眼動物模型，以了解其潛在病理[12-13]。本研究參照文獻(xiàn)方法建立了慢性高眼壓大鼠模型，檢測發(fā)現(xiàn)大鼠眼壓升高、RGCs 丟失、視網(wǎng)膜組織可見明顯病理損傷，說明慢性高眼壓模型建立成功，可以模擬青光眼RGCs 病理性損傷的過程。研究表明，加蘭他敏在血管認(rèn)知障礙[14]、脊髓損傷[15]、創(chuàng)傷性腦損傷[16]等神經(jīng)疾病的動物模型中可能具有神經(jīng)元或神經(jīng)保護(hù)作用。RGCs 是存在于視網(wǎng)膜內(nèi)的主要細(xì)胞，有助于視覺的產(chǎn)生和傳輸。由于RGCs 不能再生，RGCs 的丟失會產(chǎn)生視覺缺陷，包括不可逆的失明。RGCs 進(jìn)行性變性是包括青光眼在內(nèi)的視網(wǎng)膜退行性疾病的一個標(biāo)志[17]。本研究探索加蘭他敏在青光眼進(jìn)展過程中對RGCs 的影響作用，結(jié)果顯示，加蘭他敏干預(yù)模型大鼠后，大鼠眼壓明顯降低，視網(wǎng)膜組織病理損傷顯著減輕，RGCs 數(shù)量明顯增多。此外，本研究檢測RGCs 的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)加蘭他敏明顯減少RGCs 凋亡。表明加蘭他敏在慢性高眼壓誘導(dǎo)的RGCs 損傷中提供保護(hù)作用。

視網(wǎng)膜中的氧化應(yīng)激，由衰老、谷氨酸興奮性毒性、高血糖和缺血引起，是青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病的觸發(fā)因素，視覺系統(tǒng)中光感受器、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元等對氧化損傷特別敏感[18]。研究發(fā)現(xiàn)[19]，病理性眼壓升高誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是RGCs 凋亡、死亡或軸突再生過程中的關(guān)鍵組成部分。因此，調(diào)控視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激可能是保護(hù)RGCs免受病理性眼壓升高所致?lián)p傷的有效途徑。Sangaleti 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，加蘭他敏能夠通過提高抗氧化酶SOD、CAT 和谷胱甘肽過氧化物酶活性減輕代謝綜合征受試者的氧化應(yīng)激。此外，Kandil 等[21]報道，鼻內(nèi)加蘭他敏/殼聚糖復(fù)合物納米顆粒通過降低MDA 含量、增強谷胱甘肽和SOD 活性的抗氧化作用在大鼠大腦中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)潛力。本研究中，慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、CAT 活性均降低，MDA 含量升高，存在顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng)，加蘭他敏干預(yù)明顯升高了SOD、CAT 活性，降低了MDA 含量。提示加蘭他敏可能通過抗氧化作用減輕慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜組織損傷和RGCs 損傷。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 是細(xì)胞響應(yīng)氧化應(yīng)激的中樞調(diào)節(jié)因子，正常情況下，Nrf2 與kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合，在細(xì)胞質(zhì)中以無活性的異源二聚體存在。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時，異源二聚體復(fù)合物被破壞，Nrf2 被釋放并轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中，激活HO-1 蛋白等一系列下游基因，在氧化應(yīng)激下調(diào)節(jié)細(xì)胞防御[22-23]。大量證據(jù)表明，Nrf2 信號通路在青光眼進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。有報道稱，抗氧化劑曲美他嗪通過Nrf2/HO-1 途徑抑制急性青光眼小鼠RGCs 的凋亡[24]。Wang 等[25]研究揭示，Nrf2/HO-1 信號通路的激活顯著降低了青光眼慢性高眼壓大鼠RGCs 的凋亡和損傷，是預(yù)防青光眼RGCs 變性的潛在靶點。本研究檢測結(jié)果顯示，慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平較正常大鼠明顯降低，提示慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2/HO-1 信號通路處于抑制狀態(tài)，在加蘭他敏干預(yù)后大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高。該結(jié)果表明加蘭他敏激活了慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2/HO-1 信號通路。ML385 是一種新型特異性Nrf2 抑制劑，本研究使用ML385作為Nrf2/HO-1 通路的抑制劑來驗證加蘭他敏對慢性高眼壓大鼠RGCs 損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，ML385 的干預(yù)明顯減弱了加蘭他敏對慢性高眼壓大鼠RGCs 損傷的改善作用。這表明加蘭他敏可能通過激活Nrf2/HO-1 信號通路來減輕慢性高眼壓大鼠RGCs 損傷。

綜上所述，加蘭他敏能夠減輕慢性高眼壓所致RGCs 損傷，對實驗性青光眼具有神經(jīng)保護(hù)作用。加蘭他敏的RGCs 保護(hù)作用可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突