加蘭他敏合成途徑的研究進(jìn)展

周日寶，劉暢宇，彭美晨，王朝暉，劉湘丹*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208）

加蘭他敏合成途徑的研究進(jìn)展

周日寶，劉暢宇，彭美晨，王朝暉，劉湘丹*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410208）

加蘭他敏是一種廣泛用于治療阿爾茨海默氏癥等疾病的藥物，但研究發(fā)現(xiàn)，植物中加蘭他敏含量極少，故科研人員一直致力于加蘭他敏的合成研究。迄今為止，研究工作者已提出多種加蘭他敏化學(xué)合成策略，但因其化學(xué)合成方法存在產(chǎn)率低、成本高、步驟復(fù)雜等諸多缺陷，不利于投入實(shí)際生產(chǎn)，探索其生物合成途徑是目前最有效替代辦法。本文綜述了近年來(lái)加蘭他敏合成的相關(guān)研究，且著重介紹了其生物合成途徑及其相關(guān)酶研究進(jìn)展，并對(duì)其后續(xù)研究進(jìn)行展望。

加蘭他敏；生物合成途徑；關(guān)鍵酶；基因調(diào)控；石蒜

加蘭他敏(galanthamine，C17H21NO3），即雪花蓮胺堿（lycoremine)，又名強(qiáng)肌寧、尼瓦林[1]，具有選擇性和可逆性調(diào)節(jié)煙堿型乙酰膽堿受體及抑制乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）的雙重作用。加蘭他敏易于通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，對(duì)中樞神經(jīng)作用較強(qiáng)[2-3]，主要用于治療記憶和認(rèn)知功能方面疾病，對(duì)輕度或中度阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s disease，AD）有很好的療效，對(duì)早期至中期的AD臨床治愈性達(dá)50～60%，與其他幾種治療AD的乙酰膽堿酯酶抑制劑相比，具有治療范圍廣、毒副作用小、耐受性好等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。自1952年蘇聯(lián)首次從沃氏雪花蓮(Galanthus woronawii Losink)的鱗莖中分離出來(lái)以后，加蘭他敏一直作為藥用價(jià)值較高的有效成分被廣泛研究，1996年，其首次作為AchE抑制劑類(lèi)藥物于奧地利上市，后陸續(xù)作為治療不同程度AD的藥物獲歐盟批準(zhǔn)，并于2001年獲美國(guó)FDA許可治療AD。在目前全球老年人口增多，AD患者人數(shù)呈成倍增長(zhǎng)的趨勢(shì)下，加蘭他敏作為一種療效好、不良反應(yīng)輕微、優(yōu)勢(shì)明顯的中樞膽堿酯酶抑制劑[6-8]，越發(fā)受到重視，并漸漸成為治療AD的首選藥物之一[4-8]。其次，加蘭他敏還可用于治療小兒麻痹后遺癥、重癥肌無(wú)力、閉角形青光眼、腹膜炎和術(shù)后腸肌麻痹等癥，并且對(duì)腫瘤壞死因子的釋放有抑制作用[9-11]。

目前，加蘭他敏主要從石蒜科植物中提取，屬于石蒜科植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，但因長(zhǎng)期過(guò)度采挖，致使石蒜類(lèi)野生資源瀕臨枯竭，且直接從植物中提取加蘭他敏的得率極小。在如今人口老齡化程度日益嚴(yán)重的情況下，僅憑擴(kuò)大石蒜科植物的種植面積、發(fā)展其快速繁殖技術(shù)等方法來(lái)獲取加蘭他敏已難以滿足市場(chǎng)需求[9]，故，開(kāi)展對(duì)加蘭他敏的合成研究很有意義。本文就當(dāng)前加蘭他敏的化學(xué)合成和生物合成研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并對(duì)其今后發(fā)展做出展望。

1 加蘭他敏的化學(xué)合成途徑

自發(fā)現(xiàn)加蘭他敏以來(lái)，國(guó)內(nèi)外已對(duì)加蘭他敏的化學(xué)合成開(kāi)展了大量研究。1962年，Barton等[12]首次使用氧化偶聯(lián)方法全合成加蘭他敏；1969～1973年間，Kametani[13-15]研究小組一直致力于探索加蘭他敏的合成，并提出三條不同的氧化偶合路線成功合成加蘭他敏，但收率均不高，僅0.94～2.5%，或者直接通過(guò)去甲基加蘭他敏半合成加蘭他敏，盡管收率提高，但原料去甲基加蘭他敏在自然界存在量極少；1988年始，Jerzy小組[16-17]以酪胺和異香草醛作為原料，經(jīng)過(guò)縮合、還原、甲?；寤?、氧化和還原等反應(yīng)得到加蘭他敏，并于后續(xù)研究中首次提出以三仲丁基硼氫化鋰（L.Selectride）作為還原劑立體全合成加蘭他敏，但此途徑具成本高、副產(chǎn)物多且需利用層析柱分離的缺陷；Kita[18]在此基礎(chǔ)上更進(jìn)一步對(duì)合成途徑做出了改善，改用二(三氟乙酸)碘苯（PIFA）為氧化劑合成加蘭他敏，并取得較好的結(jié)果。2001年，Guillou研究小組[19]提出利用分子內(nèi)Heck反應(yīng)全合成加蘭他敏。2004年，Strahil Berkova等[20]研究發(fā)現(xiàn)那維定(narwedine)是加蘭他敏合成的關(guān)鍵中間體，其對(duì)人的皮膚有嚴(yán)重刺激[4,21]。2006～2007年，劉濤等[22]進(jìn)一步優(yōu)化了加蘭他敏的合成條件，利用酪胺和異香草醛經(jīng)過(guò)五步反應(yīng)成功合成外消旋加蘭他敏；此外，該研究小組[23]還采用植物中提取加蘭他敏過(guò)程中的副產(chǎn)品力可拉敏為原料，利用鑭鎳稀土合金催化，使其半合成加蘭他敏，與全合成相比，此路線成本低、路線短，大大地推進(jìn)了加蘭他敏的工業(yè)化進(jìn)程。且利用中間體對(duì)加蘭他敏進(jìn)行半合成制備，更有助于發(fā)展綠色產(chǎn)業(yè)。同時(shí)，張輔民[24]對(duì)加蘭他敏的合成進(jìn)行了新探索，用3-羥基-4-甲氧基芐醇為原料，發(fā)展了一條新的仿生合成路線，避免了中間體那維定對(duì)皮膚等的嚴(yán)重刺激。日本的Ishikawa[25]和美國(guó)的Magnus等[26]也先后發(fā)現(xiàn)了兩條新途徑，前者利用1-(2-芐氧基-3-甲氧基苯基)丙酮，應(yīng)用雙Michael-Clmsen串聯(lián)反應(yīng)合成關(guān)鍵中間體，巧妙利用Michael加成及逆Michael加成，從而得到消旋加蘭他敏。后者先醚化取代酚，再3,3-遷移構(gòu)建加蘭他敏的B環(huán)得中間體，最后進(jìn)行簡(jiǎn)單的亞胺縮合-還原反應(yīng)構(gòu)建D環(huán)，收率可達(dá)63%。近年，徐萍[27]提出了一種新思路，選用價(jià)格便宜的藜蘆醛為起始原料，以硝基為占位基團(tuán)，若此方案成功，將大大縮減合成成本。

綜合分析發(fā)現(xiàn)，盡管?chē)?guó)內(nèi)外已有眾多關(guān)于加蘭他敏化學(xué)合成的報(bào)道，但其中大部分方法都存在不足：起始原料難以獲得、關(guān)鍵中間體那維定對(duì)人的皮膚有嚴(yán)重刺激、加蘭他敏產(chǎn)率低、合成成本高、步驟復(fù)雜等，致使目前加蘭他敏的化學(xué)合成僅適用于實(shí)驗(yàn)室，無(wú)法投入工業(yè)生產(chǎn)。

2 加蘭他敏的生物合成途徑

2.1 加蘭他敏生物合成途徑的預(yù)測(cè)相關(guān)研究

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于加蘭他敏的生物合成途徑報(bào)道尚少，大多是以石蒜科植物為材料，對(duì)加蘭他敏生物合成途徑做出的推測(cè)。

1971年，Jeffs[28]提出了石蒜中加蘭他敏生物合成途徑的一種推測(cè)：因石蒜屬生物堿結(jié)構(gòu)與松葉菊堿相似，根據(jù)非洲番杏Sceletium strictum中松葉菊堿的生物合成途徑，Jeffs推測(cè)加蘭他敏有平行的生物合成途徑，并得出其碳骨架可能由酪氨酸和苯丙氨酸構(gòu)建。

1998年，Eichhorn[29]等以夏雪片蓮（Leucojum amaestivum）為材料，通過(guò)放射性同位素標(biāo)記法，確認(rèn)加蘭他敏直接由去甲基加蘭他敏生成，并推斷4'-O-甲基降孤挺花啶是石蒜屬生物堿（如加蘭他敏、文殊蘭胺、石蒜堿等）的通用前體，推測(cè)加蘭他敏的生物合成途徑可能有五個(gè)步驟，兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)先將降孤挺花啶(norbelladine)催化成4'-氧-甲基降孤挺花啶，再發(fā)生一系列反應(yīng)得到加蘭他敏。其中COMT的表達(dá)與豐度可能對(duì)植物中加蘭他敏含量產(chǎn)生極大影響[30]。但因合成加蘭他敏的直接前體去甲孤挺花啶難以得到，而加蘭他敏屬于異喹啉類(lèi)生物堿，按照生物合成途徑劃分，是屬于苯丙氨酸和酪氨酸系生物堿；Dewick等[31]補(bǔ)充推測(cè)降孤挺花啶是由來(lái)源于酪氨酸的酪胺和來(lái)源于苯丙氨酸的3,4-二羥基苯甲醛（原兒茶醛）合成；因此，3,4-二羥基苯甲醛和酪胺可看作是加蘭他敏合成的較近前體物質(zhì)[32]。故，推測(cè)植物體內(nèi)加蘭他敏生物合成途徑主要分為六個(gè)步驟，即：原兒茶醛+酪胺→降孤挺花啶4-氧-甲基降孤挺花啶→N-去甲那維定→N-去甲加蘭他敏→加蘭他敏?那維定，如圖1所示。

圖1 加蘭他敏可能生物合成途徑

2014年，MB Kilgore研究小組[33]對(duì)加蘭他敏生物合成途徑取得了重大突破，其成功組裝了黃水仙（Narcissus pseudonarcissus L.）轉(zhuǎn)錄組，并對(duì)轉(zhuǎn)錄組中氧-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因序列進(jìn)行了識(shí)別并表達(dá)，分離純化得到一個(gè)蛋白酶NpN4OMT，并證實(shí)其在加蘭他敏生物合成中過(guò)程中，具催化降孤挺花啶產(chǎn)生4'-氧-甲基降孤挺花啶的作用；其后，該研究小組通過(guò)比對(duì)黃水仙、雪花蓮、大雪片蓮等轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了對(duì)位C-C苯酚耦合細(xì)胞色素P450-CYP96T1[34]，具催化4'-氧-甲基降孤挺花啶產(chǎn)生N-去甲那維定的作用；2015年12月，Kutchan,Toni M.等[35]對(duì)其申請(qǐng)國(guó)家專(zhuān)利，公開(kāi)試驗(yàn)中石蒜科生物堿（含加蘭他敏）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶鑒定及關(guān)于加蘭他敏等石蒜堿轉(zhuǎn)基因生物工程等有關(guān)發(fā)現(xiàn)，并且對(duì)涉及于加蘭他敏生物合成途徑中的降孤挺花啶4'-氧-甲基轉(zhuǎn)移酶、CYP96T1-3、以及降孤挺花啶合酶/還原酶進(jìn)行編碼。石蒜科主要生物堿合成可能途徑如圖2所示。

對(duì)于加蘭他敏的生物合成，除上述途徑，目前還有另一條可能途徑：即利用莽草酸途徑產(chǎn)生苯丙氨酸，通過(guò)苯丙烷代謝等得到原兒茶醛等中間產(chǎn)物，最后得到加蘭他敏等生物堿，其中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyas,PAL）是苯丙氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶[9,36]，但目前對(duì)于此途徑的研究尚少。

2.2 生物合成途徑相關(guān)酶的克隆及相關(guān)研究

2003年，謝峻等[37]對(duì)石蒜屬次生代謝產(chǎn)物加蘭他敏的生物合成提出了新思路，即通過(guò)基因改造，以構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法來(lái)解決加蘭他敏的來(lái)源。陳斌等[36]于2008年以忽地笑嫩葉為原料，采用RACE技術(shù)成功克隆了忽地笑中生物堿上游關(guān)鍵酶PAL基因核心片段和3'端片段，為忽地笑中PAL基因的全長(zhǎng)基因克隆奠定了基礎(chǔ)。梁麗建等[30]采用同源克隆與RACE相結(jié)合的方法，首次從石蒜葉片中克隆到可能與加蘭他敏生物合成相關(guān)的COMT基因（COMT是一種S-腺苷-L-甲硫胺酸依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶，目前在煙草、玉米、唐松草和粟等多種植物中被克隆[38]。），并命名為L(zhǎng)rCOMT，為加蘭他敏基因調(diào)控技術(shù)提供研究基礎(chǔ)。因研究者發(fā)現(xiàn)，石蒜類(lèi)植物不同部位加蘭他敏含量差異明顯[39-41]，推測(cè)其可能為不同部位基因存在差異，唐金鳳等[9,42]借助mRNA差異顯示技術(shù)（DD-PCR），對(duì)忽地笑中加蘭他敏含量最高的花蕊及含量最低的花葶進(jìn)行差異基因篩選并成功克隆其差異片段，確認(rèn)了2個(gè)與忽地笑加蘭他敏合成相關(guān)和1個(gè)可能與加蘭他敏運(yùn)輸代謝調(diào)控有關(guān)的條帶；桂柳姿等[43]通過(guò)RACE技術(shù)成功克隆出忽地笑加蘭他敏合成途徑中的COMT酶基因（La-COMT），并通過(guò)與煙草、唐松草、玉米和罌粟的COMT基因進(jìn)行同源性比對(duì)，確認(rèn)該序列是COMT序列，與梁麗建等[30]克隆的石蒜COMT(LrCOMT)基因編碼相比，基因編碼的氨基酸數(shù)目一致，但氨基酸序列有所不同。2015年，伍美慧[1]對(duì)上述桂柳姿等[43]獲得的COMT基因片段成功構(gòu)建pET-COMT重組質(zhì)粒，并于大腸桿菌中高效表達(dá)出預(yù)期蛋白條帶，為進(jìn)一步研究加蘭他敏生物合成代謝途徑中關(guān)鍵酶提供基礎(chǔ)。與此同時(shí)，別慶玲等[44]克隆得到一個(gè)新的忽地笑氧-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT)基因（LaOMT），其在忽地笑鱗莖、根、葉和花中均有表達(dá)，但與桂柳姿等[32]得到的忽地笑COMT基因（LaCOMT）在堿基數(shù)目和序列上均存在一定差異，目前，LaOMT基因是否與忽地笑加蘭他敏的合成相關(guān)尚有待證實(shí)。

3 其他生物技術(shù)生產(chǎn)加蘭他敏的研究

除上述利用基因工程方法合成加蘭他敏外，國(guó)內(nèi)外亦有其他生物技術(shù)生產(chǎn)加蘭他敏的研究。2008年，彭菲實(shí)驗(yàn)小組[45]發(fā)現(xiàn)忽地笑的不定根培養(yǎng)品中有加蘭他敏的存在，推測(cè)離體培養(yǎng)忽地笑的不定根，可能成為合成加蘭他敏的一條新途徑。趙志敏等[32,46]以忽地笑鱗莖為材料，通過(guò)內(nèi)生菌分離發(fā)酵的方法，從中檢測(cè)出1株鑒定為半知菌綱青霉屬的真菌能夠產(chǎn)生加蘭他敏，推測(cè)忽地笑內(nèi)生真菌有望成為生產(chǎn)加蘭他敏的新資源。此外，研究發(fā)現(xiàn)，在忽地笑培養(yǎng)過(guò)程中，添加酪胺等苯丙氨酸前體物對(duì)加蘭他敏的合成起促進(jìn)作用，而水楊酸、絡(luò)氨酸等則不利于加蘭他敏的積累，另外，植物激素對(duì)加蘭他敏的積累也存在一定影響，有研究成果表明：高濃度的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）促進(jìn)加蘭他敏的合成，2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和濃度高于0.5 mg/L的1-萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）抑制加蘭他敏的合成[47-49]，這些研究也為加蘭他敏合成代謝途徑可能是通過(guò)苯丙烷代謝途徑完成的提供佐證。

4 結(jié)論與展望

自發(fā)現(xiàn)加蘭他敏對(duì)AD等中樞疾病的優(yōu)良藥用價(jià)值后，加蘭他敏的提取和合成一直備受關(guān)注。目前生產(chǎn)加蘭他敏的方法主要為化學(xué)合成法和植物提取法。前者的成本與從天然植物中直接提取相比相差無(wú)幾甚至略高，而后者也因?yàn)檫^(guò)程繁瑣，勞動(dòng)強(qiáng)度大且產(chǎn)量極低，皆不利于大規(guī)模生產(chǎn)。為從根本上解決加蘭他敏供不應(yīng)求的現(xiàn)狀，研究者需要另辟蹊徑，運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)，探索加蘭他敏的生物合成途徑，通過(guò)基因工程等手段，以獲得加蘭他敏高表達(dá)的植株。因石蒜科植物是提取加蘭他敏的主要來(lái)源，探索石蒜科植物中加蘭他敏的生物合成途徑已成為研究熱點(diǎn)，前景非常廣闊。

目前，關(guān)于加蘭他敏的生物合成途徑仍不完善，需進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究驗(yàn)證。其中關(guān)鍵酶COMT的成功克隆，無(wú)疑為加蘭他敏生物合成工業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)了新希望。但植物的次生代謝是在多種酶的共同作用下完成的，受多因素影響，加蘭他敏生物合成途徑中尚有許多相關(guān)酶未得到深入研究。

隨著加蘭他敏生物合成途徑研究的深入，研究者們需要選擇合適的材料和方法來(lái)進(jìn)一步對(duì)加蘭他敏合成途徑中的前體進(jìn)行驗(yàn)證，找出途徑中其他相關(guān)酶并探究酶之間的協(xié)同性，從而構(gòu)建加蘭他敏高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物模型。與其他石蒜科植物相比，忽地笑具加蘭他敏含量相對(duì)較高、分布地域較廣、便于采集等優(yōu)勢(shì)，后續(xù)研究中可選擇忽地笑（黃花石蒜Lycoris aurea(L'Her.)Herb.）為研究材料，通過(guò)RACE和PCR等克隆技術(shù)，得到加蘭他敏合成途徑中相關(guān)酶基因，并進(jìn)一步深入探索其生物合成途徑及潛在酶，從基因水平上進(jìn)行調(diào)控改造，達(dá)到其高表達(dá)目的，最終經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化、發(fā)根培養(yǎng)等得到目的轉(zhuǎn)基因植物。若設(shè)想實(shí)現(xiàn)，加蘭他敏的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)將會(huì)成為現(xiàn)實(shí)，經(jīng)濟(jì)效益也將十分可觀。

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[49]李明凱.石蒜生物堿分析方法的建立及其生物合成的研究[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

（本文編輯 蘇 維）

Advances in the Synthesis Pathways of Galanthamine

ZHOU Ribao,LIU Changyu,PENG Meichen,WANG Zhaohui,LIU Xiangdan*
(School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Galanthamine is a drug that is widely used in the treatment of Alzheimer's disease and etc.But according to the studies,the extraction yield of galanthamine in natural plants is very limited,researchers have studied on the synthesis of galanthamine.So far,a variety of chemical synthesis strategies were proposed.However,due to the defects of the current chemical synthesis,such as low yield,high cost,complicated steps and etc,the methods are not conducive to practical production,at present,the most effective alternative is to explore the biosynthetic methods for galanthamine.The review summarizes the research advances in the synthesis of galantamine,and emphatically introduces the biosynthesis and synthesisrelated enzymes of galantamine,the further study prospects of galantamine's synthesis are expected.

galanthamine;biosynthetic pathway;key enzyme;gene control;Lycoris radiata(L'Her.)Herb.

R914

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.12.021

2016-07-06

湖南省科技廳（2015SK2015）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局“藥用植物學(xué)”重點(diǎn)學(xué)科資助（國(guó)中醫(yī)藥發(fā)[2009]30號(hào)）；湖南省科技廳（2015NK2153）；湖南省“中藥學(xué)”重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助（湘教通[2011]76號(hào)）；湖湘中藥資源保護(hù)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心（湘教通[2015]351號(hào)）。

周日寶，男，博士，教授，主要從事中藥資源質(zhì)量與開(kāi)發(fā)研究。

*劉湘丹，女，博士，副教授，E-mail:paeonia_dd@126.com。