歐前胡素阻斷Noxs-ROS 通路抑制MKN-45 及HT-29 細(xì)胞增殖活性

雍素云，史先鵬，周楠，周永春，張雪婷

1.陜西省人民醫(yī)院 藥學(xué)部，陜西 西安 710068

2.陜西省人民醫(yī)院 骨科，陜西 西安 710068

3.陜西省人民醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710068

氧化應(yīng)激參與癌癥發(fā)展的所有階段[1]，活性氧（ROS）在惡性腫瘤前期過(guò)程中起著重要的致病作用。一方面，組織中產(chǎn)生的ROS 可以在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)被生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）；另一方面，炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的持續(xù)激活，通常需要大量的ROS的產(chǎn)生來(lái)支持[2-3]。細(xì)胞內(nèi)的ROS 主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（Noxs）產(chǎn)生。Noxs 作為電子供體催化NADPH 產(chǎn)生O2，繼而產(chǎn)生ROS。Noxs 家族有Nox1-5、雙氧化酶1（DUOX1）和DUOX2。Noxs 蛋白本身幾乎沒(méi)有催化活性，需要與多種調(diào)節(jié)亞基結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物才能發(fā)揮催化作用，包括p22Phox、p47Phox（異構(gòu)體Noxo1）、p67Phox（異構(gòu)體Noxa1）和p40Phox[4-5]。不同細(xì)胞中Noxs 的分布及功能也是不同的[6]。大腸腺瘤性息肉使個(gè)體易患結(jié)腸腺癌。Nox1 已被證明在高分化結(jié)腸腺瘤中過(guò)表達(dá)[7]。除結(jié)直腸癌中Nox1 和DUOX2 的上調(diào)以及胰腺癌中DUOX2 的上調(diào)外，還有大量證據(jù)支持幾種人體實(shí)體瘤中Nox4mRNA表達(dá)增強(qiáng)，與未受累的鄰近胃組織相比，胃腺癌中Nox1 和Nox4 顯著增加[8]。

歐前胡素屬于呋喃香豆素類化合物，主要來(lái)源于白芷、當(dāng)歸、名黨參、水芹、福參、防風(fēng)、羌活、蛇床子等，其中在白芷中含量較豐富[9]。研究表明，歐前胡素具有抗炎、抗高血壓、抗過(guò)敏及抗腫瘤等作用[10-11]。近年來(lái)，關(guān)于歐前胡素影響藥物代謝酶活性，影響心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用的研究逐漸增多，針對(duì)其藥理作用的研究領(lǐng)域不斷拓寬。因此，歐前胡素具有廣泛的藥理作用以及巨大的新藥開發(fā)潛力。前期研究中，歐前胡素通過(guò)降低胞內(nèi)ROS 水平發(fā)揮抗炎、抗高血壓等作用[12]。近期研究報(bào)道，歐前胡素可以減少H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞死亡，并減弱了ROS 的形成，但沒(méi)有顯示出細(xì)胞毒性，這表明其可能通過(guò)ROS 清除活性對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷具有細(xì)胞保護(hù)作用，降低癌細(xì)胞的擴(kuò)展[13]。然而歐前胡素對(duì)其他腫瘤細(xì)胞胞內(nèi)ROS 及Noxs 不同亞型的影響作用仍不清楚，本研究通過(guò)歐前胡素對(duì)胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞的ROS 及Noxs 影響作用，揭示其抗腫瘤作用新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人胃癌細(xì)胞MKN-45購(gòu)自武漢華爾納生物科技有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 試劑與儀器

歐前胡素（批號(hào)HY-N0285，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；二苯基氯化碘鹽（DPI，批號(hào)HY-100965）購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)D8371）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；二氫乙錠（DHE，批號(hào)S0063）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔多抗Nox1（批號(hào)DF8684）購(gòu)自Affinity Biosciences Pty Ltd.；兔單抗Nox2（批號(hào)ab129068）購(gòu)自Abcam 公司；兔多抗Nox3（批號(hào)A3677）購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；兔多抗Nox4（批號(hào)DF6924）、兔多抗Nox5（批號(hào)DF4219）購(gòu)自Affinity Biosciences Pty Ltd.；HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（批號(hào)BA1055）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

顯影定影試劑盒購(gòu)自天津市漢中攝影材料廠；CCK8 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、1640 培養(yǎng)基、MEM 均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自依科賽生物科技（太倉(cāng)）有限公司；氨芐西林購(gòu)自阿拉丁公司；硫酸鏈霉素購(gòu)自阿拉丁公司；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；RIPA 強(qiáng)效組織裂解液購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司。

細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)康寧CORNING 公司；電子天平購(gòu)自上海博通公司；96孔培養(yǎng)板購(gòu)自奈斯生物科技有限公司；電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；微量移液器購(gòu)自ThermoFisher 公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；低速離心機(jī)購(gòu)自湖南可成儀器設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自日本ASONE 公司；FlexStation 3 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自Molecular Devices 公司；CO2 恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO 公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司。

1.3 方法

1.3.1 受試物配制 歐前胡素及DPI 用DMSO 配制成50 mg/mL 母液，-20 ℃溫度保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)，用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.3.2 細(xì)胞處理 MKN-45 及HT-29 細(xì)胞置于含10% FBS、100 μg 青霉素-鏈霉素雙抗溶液和高糖DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)按1∶3 比例對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MKN-45、HT-29 細(xì)胞，分為對(duì)照組（加入新鮮等體積培養(yǎng)基）及歐前胡素3、10、30、100 μmol/L 組，用0.25%胰蛋白酶溶液消化MKN-45、HT-29 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔接入96 孔板；另設(shè)空白組細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜（在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL 無(wú)菌PBS）。每種藥物及濃度均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，吸棄各孔培養(yǎng)基，各組細(xì)胞依次加入不同濃度歐前胡素培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的各孔吸光度（A450），實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率＝（A給藥－A空白）/（A對(duì)照－A空白）

1.3.4 胞內(nèi)ROS 水平檢測(cè) 取培養(yǎng)好的MKN-45、HT-29 細(xì)胞分別分為3 組，即對(duì)照組（加入新鮮等體積培養(yǎng)基）、歐前胡素組（加入歐前胡素100 μmol/L干預(yù)24 h）[14]、陽(yáng)性對(duì)照（DPI）組（加入DPI 0.05 μmol/L 干預(yù)24 h）。用1640 完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到2.5×105/mL，接入6 孔板，每孔2 mL細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。歐前胡素100 μmol/L 及DPI 0.05 μmol/L 孵育24 h，孵育完畢后，使用PBS 漂洗3 次，加入20 mL DHE熒光探針染料工作液孵育1 h，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image Pro-plus 軟件計(jì)算每組胞內(nèi)ROS 水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)9 次。

1.3.5 Noxs 相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 分組同1.3.4 項(xiàng)下，歐前胡素及DPI 干預(yù)24 h 后，棄掉培養(yǎng)液，加入蛋白提取液（PMSF 與RIPA 比例為1︰100）冰上裂解，離心后使用BCA 法提取總蛋白，定量后的樣品上樣，每孔上樣量為20 μL，電泳并轉(zhuǎn)膜后封閉2 h，加入一抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，一抗抗體分別為GAPDH（1︰1 000）、Nox1（1︰1 000）、Nox2（1︰5 000）、Nox3（1︰1 000）、Nox4（1︰1 000），次日TBST 洗膜3 次后，根據(jù)一抗加入二抗，使用HRP 標(biāo)記二抗（1︰10 000 稀釋），室溫?fù)u床孵育2 h。使用TBST 洗膜3 次后，將ECL 試劑盒中A 液與B 液按1︰1 比例混勻，將工作液均勻滴加于膜上反應(yīng)，于凝膠成像儀器下顯色，膠片掃描后，用BandScan 分析膠片灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)9 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用Graphpad Prism 9.0 軟件作圖并分析，各組數(shù)據(jù)之間差異采用單因素方差分析（ANOVA）處理，分析結(jié)果采用表示。

2 結(jié)果

2.1 歐前胡素對(duì)MKN-45 及HT-29 細(xì)胞增殖活性的影響

如圖1 所示，與對(duì)照組比較，歐前胡素組MKN-45 及HT-29 細(xì)胞增殖活性均下降，且呈濃度相關(guān)性；30、100 μmol/L 歐前胡素可使MKN-45 細(xì)胞增殖率呈極顯著性下降（P＜0.001）；10、30、100 μmol/L 歐前胡素可使HT-29 細(xì)胞增殖率呈極顯著性下降（P＜0.01、0.001）。

圖1 歐前胡素對(duì)MKN-45 及HT-29 細(xì)胞增殖活性的抑制作用（，n=6）Fig.1 Imperatorin inhibited the proliferative activity of MKN-45 and HT-29 cells (,n=6)

2.2 歐前胡素對(duì)MKN-45 及HT-29 細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平的影響

如圖2、3 所示，與對(duì)照組比較，歐前胡素組MKN-45 及HT-29 細(xì)胞胞內(nèi)ROS 水平均顯著下降（P＜0.05），DPI 組也可使MKN-45 及HT-29 細(xì)胞ROS 水平顯著下降（P＜0.01、0.001）。

圖2 歐前胡素對(duì)MKN-45 和HT-29 細(xì)胞胞內(nèi)ROS 熒光染色圖Fig.2 Fluorescence staining images of imperatorin effected on the ROS level of MKN-45 and HT-29 cells

圖3 歐前胡素對(duì)MKN-45 及HT-29 細(xì)胞胞內(nèi)ROS 水平的抑制作用（，n=9）Fig.3 Imperatorin inhibited the ROS level of MKN-45 and HT-29 cells (,n=9)

2.3 歐前胡素對(duì)MKN-45 及HT-29 細(xì)胞Noxs 蛋白表達(dá)水平的影響

如圖4、5 所示，與對(duì)照組比較，歐前胡素組MKN-45 細(xì)胞Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）；歐前胡素組HT-29 細(xì)胞Nox1 和Nox2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），但對(duì)Nox3、Nox4、Nox5 蛋白表達(dá)水平雖有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。

圖4 歐前胡素對(duì)MKN-45 細(xì)胞Noxs 蛋白表達(dá)水平的影響（，n=9）Fig.4 Imperatorin inhibited the Noxs protein expression level of MKN-45 cells (,n=9)

圖5 歐前胡素對(duì)HT-29 細(xì)胞Noxs 蛋白表達(dá)水平的影響（，n=9）Fig.5 Imperatorin inhibited the Noxs protein expression level of HT-29 cells (,n=9)

3 討論

在大多數(shù)細(xì)胞和組織中，Nox-依賴性ROS 的產(chǎn)生與生物信號(hào)和病理生理功能有關(guān)[15]，例如心血管[16-17]、神經(jīng)退行性[18-19]、癌癥[20-21]和代謝性疾病等[22-23]。這是由于氧化應(yīng)激與癌癥細(xì)胞的細(xì)胞代謝密切相關(guān)。此外，氧化還原平衡的改變和被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志，并與惡性進(jìn)展和藥物治療耐藥性有關(guān)。因此，針對(duì)ROS 與腫瘤相關(guān)聯(lián)的研究將有一定的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的天然化合物歐前胡素，在抑制胃癌MKN-45 細(xì)胞及結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞的增殖率的同時(shí)，可以降低胞內(nèi)的ROS水平，這說(shuō)明其抗腫瘤作用可能與ROS 相關(guān)。

代謝和微環(huán)境相關(guān)改變產(chǎn)生的高活性氧水平有助于調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞代謝[24]，而Noxs 酶在這一過(guò)程中起著關(guān)鍵作用?；谕ㄓ每寡趸肿釉谌梭w試驗(yàn)中的應(yīng)用的治療方法引起了人們的廣泛關(guān)注，但仍缺乏選擇性靶向氧化途徑的特定藥理學(xué)策略[25]。因此，由于Nox 同源物主要由增強(qiáng)的表達(dá)和/或激活機(jī)制調(diào)節(jié)，因此調(diào)節(jié)Nox 表達(dá)及其活性被認(rèn)為是新的有前途的治療方法。一些Nox 成員在不同的癌癥模型中被發(fā)現(xiàn)失調(diào)，其中Nox1、Nox2、Nox4 是表達(dá)最頻繁的成員。

Nox1 亞型在多種組織中表達(dá)[26]，但在結(jié)腸、前列腺和血管細(xì)胞中占主導(dǎo)地位[27]，其表達(dá)可由多種條件誘導(dǎo)。然而，Nox1 的異常激活和/或表達(dá)通過(guò)細(xì)胞代謝的放松調(diào)節(jié)參與了越來(lái)越多的疾病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、炎癥和癌癥[26]。Nox1 在一些腫瘤中上調(diào)，并作為癌基因發(fā)揮作用[28-29]。這種上調(diào)對(duì)糖酵解升高至關(guān)重要，并在線粒體功能障礙的癌癥細(xì)胞中提供額外的NAD+[29-31]。在因致癌Ras激活或p53 缺失而導(dǎo)致線粒體功能受損的癌癥細(xì)胞和原發(fā)性胰腺癌組織中也觀察到Nox1 上調(diào)。Nox1功能的阻斷選擇性地?fù)p害具有線粒體功能障礙的癌癥細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞糖酵解減少，細(xì)胞活力喪失，并抑制體內(nèi)癌癥生長(zhǎng)，這表明Nox1 是癌癥治療的潛在新靶點(diǎn)[28]。Nox2 衍生的ROS 產(chǎn)生增強(qiáng)是氧化微環(huán)境的原因，該微環(huán)境對(duì)腫瘤發(fā)生、腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞增殖[32]和細(xì)胞代謝[33]產(chǎn)生深刻影響。Nox2 依賴的ROS 生成誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）的激活，從而刺激HIF 相關(guān)的癌癥事件[32]。迄今為止，已觀察到Nox4 參與多種惡性腫瘤，包括肺癌、腎細(xì)胞癌癥、結(jié)直腸癌、胃癌。Nox4 衍生的ROS 在幾種組織和細(xì)胞類型的不同病理生理過(guò)程中控制與細(xì)胞增殖、遷移、存活、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞代謝和代謝重編程有關(guān)的各種細(xì)胞過(guò)程。與Nox2 類似，Nox4衍生的ROS 參與HIFα 的激活。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，異常的Nox4 依賴性ROS 生成通過(guò)介導(dǎo)HIF1α穩(wěn)定來(lái)影響叉頭框蛋白M1（FOXM1）的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）介導(dǎo)Nox4 上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生、生長(zhǎng)、存活、缺氧和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的血管生成。在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y 細(xì)胞中也觀察到Nox4 依賴性HIFα 的穩(wěn)定，其中Nox4 的表達(dá)在缺氧條件下上調(diào)。在Nox4 敲除的癌癥細(xì)胞中，HIF1α 靶向基因（如編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的SLC2A1）的表達(dá)被阻止，從而支持Nox4 介導(dǎo)的代謝重編程的相關(guān)作用[34]。

在人類的淋巴組織、睪丸和血管中已經(jīng)檢測(cè)到Nox5 的表達(dá)[35]。研究表明，Nox5 有助于血管和腎臟病理[36]。最近的一項(xiàng)研究表明，Nox5 在兔中對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有潛在的保護(hù)作用[37]。Nox3 分布在內(nèi)耳中，它對(duì)耳蝸的形成至關(guān)重要，前庭中的碳酸鈣晶體負(fù)責(zé)檢測(cè)線性加速度、重力和聽覺(jué)[38]。此外，DUOX1 和DUOX2 在甲狀腺中表達(dá)，對(duì)甲狀腺激素合成至關(guān)重要[39]。但考慮到安全性和效益，應(yīng)該盡量避免對(duì)DUOX1 和DUOX2 的藥理抑制，以避免甲狀腺功能減退和腸炎癥[40]。因此，本研究深入探索了歐前胡素對(duì)2 種癌細(xì)胞MKN-45 及HT-29 的不同Noxs 亞型的影響。

本研究中，歐前胡素可以降低MKN-45 細(xì)胞中5 種Noxs，但是對(duì)不同Noxs 的抑制程度稍有不同，其中對(duì)Nox1 的抑制作用最強(qiáng)（P＜0.001），對(duì)Nox2及Nox4 的抑制作用強(qiáng)于對(duì)Nox3 及Nox5 的作用。在HT-29 細(xì)胞中，歐前胡素可以明顯降低Nox1 及Nox2 蛋白表達(dá)水平（P＜0.05、0.01），對(duì)Nox3、Nox4、Nox5 蛋白表達(dá)水平有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明歐前胡素對(duì)不同Noxs 的影響存在差異性，可能對(duì)Nox1 及Nox2 的作用相對(duì)較強(qiáng)，與其抗腫瘤作用存在相關(guān)性。

綜上所述，歐前胡素抗腫瘤作用可能與阻斷Noxs-ROS 信號(hào)通路有關(guān)，新作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為抗腫瘤提供了新的治療思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突