百里醌調(diào)控NLRP3 炎癥小體對帕金森病模型神經(jīng)炎癥的抑制作用研究

葛淑麗，董健健，徐陳陳，程 楠

（1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學神經(jīng)病學研究所附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230061）

帕金森病（Parkinson's disease， PD）是一種以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡丟失為基本病理改變的中樞神經(jīng)退行性疾病，臨床上常發(fā)病于中老年人［1］。我國為人口大國，隨著人口老齡化進程的日趨加重，我國帕金森病的患病率正處于急劇上升的階段，給整個社會帶來嚴峻的挑戰(zhàn)［2］。PD 的發(fā)病機制復雜、涉及多種途徑和機制，異常的蛋白質(zhì)動力學、線 粒 體 功 能 障 礙、神 經(jīng) 炎 癥 等 會 促 進PD 發(fā) 展［3，4］。研究發(fā)現(xiàn)PD 神經(jīng)炎性損傷與過度活化的小膠質(zhì)細胞有密切聯(lián)系［5］。激活狀態(tài)下的小膠質(zhì)細胞會產(chǎn)生炎癥因子，這些促炎細胞因子可在神經(jīng)炎癥進程中經(jīng)由受體依賴的細胞凋亡途徑加重神經(jīng)元的損傷［6，7］。

百里醌（thymoquinone， TQ）分離于草本植物黑種草子，并被純化成有效活性的單體，已證實有抗腫瘤、抗炎、抗凋亡等作用［8，9］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TQ 能激活Nrf2 通路上調(diào)抗血紅素加氧酶1蛋白的表達，減輕細胞凋亡，延緩PD 的發(fā)生［10］。但這些研究尚不能闡明TQ 對實驗性PD 神經(jīng)炎性損傷的具體療效機制。該研究用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine， MPTP）誘導PD 小鼠模型和脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）聯(lián)合MPP+構建PD 神經(jīng)炎癥模型，觀察TQ 對NLRP3 炎癥小體的影響和SH-SY5Y 細胞損傷，研究TQ 治療PD 神經(jīng)炎性損傷的作用機制。

1 材料

1.1 動物

由杭州子源實驗動物科技有限公司引進的C57BL/6 小鼠，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0004，在SPF 級實驗動物中心由專人專職負責飼養(yǎng)、傳代繁殖。

環(huán)境溫度25 ℃左右，正常光照，常規(guī)鼠類飼料喂養(yǎng)與自由飲水。實驗所需的實驗小鼠月齡在2～3 月齡。動物實驗由中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院動物倫理委員會（IACUC19001）審核通過。

1.2 細胞與藥物

小膠質(zhì)細胞（BV-2）和人神經(jīng)母細胞瘤（SH-SY5Y）細胞購自合肥苗茁生物科技有限公司；Sigma（美國圣路易斯）公司購買了TQ（純度99%，貨 號MKCC0600）、MPP+（純 度≥98%， 貨 號0000134347）、MPTP（純 度≥98%， 貨 號SLCJ8770）。

1.3 試劑

MEM 培 養(yǎng) 基（ 美 國 Gibco 公 司，貨 號2323185）；F-12 培 養(yǎng) 基（美 國Gibco 公 司，貨 號2277085）；胎 牛 血 清（ 美 國 Gibco，貨 號2305262RP）；ELISA 試劑盒（江萊生物技術股份有限公司，貨號JL18442）。 NLRP3、Caspase-1 抗體（英國 Abcam 公司，貨號分別為ab263899、ab1872），ASC、IL-1β 抗體（成都正能生物技術有限責任公司，貨號分別為340097、511369），Caspase-3（英國 Abcam 公司，貨號ab4051），Bcl-2、Bax 抗體（成都正能生物技術有限責任公司，貨號分別為381702、380709）。酪氨酸羥化酶（TH）、α-突觸核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）抗體（美國CST 公司，貨號分別為2792S、2642S）

1.4 實驗儀器

超凈臺（型號SW-CJ-1F）：蘇州凈化設備公司；CO2培養(yǎng)箱（型號GOLD-SIMW200IR）：美國SIM公司；曠場實驗視頻分析系統(tǒng)（荷蘭Noldus 公司）；小動物轉棒JLBehv-RRT（上海吉量軟件技術有限公司）；酶標儀（型號Bio Tek Epoch2）：美國伯騰儀器（Biotek ）有限公司；電泳儀（型號 Pow-erpac Basic）：美 國 伯 樂（Bio-Rad）公 司；純 水 機（型 號FBZ2001-UP-P）：青島富勒姆科技有限公司。

2 方法

2.1 PD 小鼠模型的構建

采用30 mg/kg-MPTP 連續(xù)5 d 皮下注射C57BL/6 小鼠建立PD 小鼠模型［11］。

2.1 分組及給藥方法

將雄性C57BL/6 小鼠喂養(yǎng)7 d 后，隨機分為對照組、對照+TQ 組、模型組、模型+TQ 組。（1）對照組C57BL/6J 小鼠予等體積生理鹽水腹腔注射，每天1次，連續(xù)5 d；（2）對照+TQ 組：C57BL/6J 小鼠腹腔注射百里醌（10 mg·kg-1·d-1），持續(xù)5 d。（3）模型組：C57BL/6J 小鼠皮下注射30 mg/kg 的MPTP，持續(xù)5 d。（4）模 型+TQ 組：MPTP 給 藥 前60 min，C57BL/6J 小鼠在腹腔內(nèi)注射TQ （10 mg·kg-1·d-1），持續(xù)5 d。

2.2 行為學檢測小鼠運動功能

（1）曠場實驗：評估小鼠的自主行為。實驗開始時，室內(nèi)保持安靜，實驗小鼠的行為結果要盡量避免受到人為因素的影響。將小鼠放入觀察箱中，在安靜的環(huán)境下連續(xù)錄像10 min，訓練3 d。第4 天進行測試，記錄其曠場內(nèi)中央路程與中央時間及邊上路程與邊上時間。

（2）轉棒實驗：評價小鼠的四肢運動協(xié)調(diào)能力，實驗前將小鼠在轉棒上以5～10 r/min 的速度訓練5 min，使小鼠能夠在轉軸上爬行。根據(jù)預實驗的結果設定速度30 r/min 檢測5 min。訓練3 d，第4天記錄小鼠在棒時間。每只小鼠進行3 次試驗，每兩次試驗間隔1 h，取3 次成績的平均值，記入本次試驗成績。

2.3 細胞培養(yǎng)及傳代

在5%CO2， 37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)BV-2 和SH-SY5Y 細胞，細胞生長至密度約為80%傳代，每2～3 天傳代1 次。

2.4 細胞條件培養(yǎng)

根據(jù)相關文獻采用細胞條件培養(yǎng)［12］。將BV-2細胞分為對照組、模型組、模型+TQ 組、陽性對照組MCC950［13］。對照組不做處理；模型組以0.1 μg/mL LPS［14］誘導3 h，置換含100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)8 h，建立PD 神經(jīng)炎性模型。TQ 組先以含LPS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h，置換含0.25 μmol/L， 0.5 μmol/L TQ 的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，棄培養(yǎng)液用含100 μmol/L MPP+的培養(yǎng)作用8 h。陽性對照組以含LPS 的培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h，置換含0.1 μmol/L MCC950 的培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h，棄培養(yǎng)液用含MPP+的培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h。各組干預后用MEM/F12 完全培養(yǎng)液置換原培養(yǎng)液，作用24 h，收集各組細胞上清作用SH-SY5Y 細胞24 h。

2.5 MTT 檢測MPP+和TQ 對BV-2、SH-SY5Y 細胞增殖的影響

將BV-2、SH-SY5Y 細胞分別鋪板于96 孔板，密度為2×104個/孔。當細胞生長至70%時，每組加入所需培養(yǎng)液100 μL，作用時間結束后，每孔加入MTT 溶液20 μL（避光操作），放于CO2恒溫培養(yǎng)箱的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h 后，每孔加入150 μL DMSO溶液作用5 min（避光操作），450 nm 吸光度OD 值用酶標儀測定。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗

對狀態(tài)良好的BV-2 細胞進行消化收集傳代，設對照組、模型組、模型+TQ 組，放于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當細胞長至90%進行干預，正常組加MEM 培養(yǎng)液，模型組加入100 μmol/L MPP+，TQ組加入0.25 μmol/L、0.5 μmol/L TQ 培養(yǎng)液處理12 h 后加入100 μmol/L MPP+作用8 h。按照說明書進行ELISA 操作。吸光度OD（450 nm）值由酶標儀測定。

2.7 TUNEL 法檢測條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞的凋亡情況

按5×105個/mL 的密度將SH-SY5Y 細胞鋪板于置有爬片的6 孔板內(nèi)，分為對照組、模型組、模型+TQ 組、陽性對照組進行干預。干預結束PBS 洗滌，多聚甲醛室溫固定20 min。按試劑盒說明書進行TUNEL 染色，采用Image J 軟件對圖像進行定量分析。

2.8 Western blot 法檢測蛋白表達水平

提取小鼠中腦組織和消化收集各組細胞，加入RIPA 裂解液和PMSF 混合液，每隔10 min 在冰浴搖床上進行30 min 的裂解混合。 4 ℃， 12 000 r/min 離心30 min，取上清，加入蛋白上樣緩沖液后，立即采用100 ℃水浴加熱8 min， -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。電泳后將蛋白轉移到NC 膜上?？焖俜忾]液封閉25 min，加入TH、α-Syn、NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、Caspase-3、Bcl-2、Bax 一抗4℃孵育過夜（均按1∶1 000 稀釋），PBST 搖床漂洗6 次，5 min/次。二抗液中放入NC 膜（1∶10 000），37 ℃溫育1.5 h，PBST 搖床漂洗6 次，5 min/次。A、B 液在顯影工作液中1∶1 配比，NC 膜放在顯影儀器倉內(nèi)曝光，通過ImageJ 軟件進行圖像掃描運算處理。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，每項實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 TQ 對PD 小鼠模型行為學的影響

曠場實驗結果顯示：與對照組相比，模型組中央路程與中央時間減少，邊上路程與邊上時間增加（P＜0.01）；與模型組相比，模型+TQ 組中央路程與中央時間增加，邊上路程與邊上時間顯著減少（P＜0.05）。見表1。轉棒結果顯示：與對照組相比，模型組小鼠在棒時間明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，模型+TQ 組能顯著提高小鼠的在棒時間（P＜0.01）。見表2。

表1 曠場實驗 （n=10）Tab 1 Open field（n=10）

表2 轉棒實驗（n=10）Tab 2 Rotarod experiments（n=10）

3.2 TQ 對PD 小鼠模型多巴胺能神經(jīng)元缺失的影響

觀察TQ 對MPTP 誘導的DA 能神經(jīng)元損傷的影響，Western Blot 檢測TH、α-Syn 蛋白表達。結果顯示：模型組小鼠TH 的表達水平顯著降低（P＜0.01），模型+TQ 組可恢復TH 的蛋白水平（P＜0.01）；模型組小鼠α-Syn 表達顯著增加（P＜0.01）；而模型+TQ 組α-Syn 表達顯著減少（P＜0.01）。見圖1、表3。

圖1 小鼠中腦TH， α-synuclein 蛋白的表達（n=6）Fig 1 TH and α-synuclein protein expression in mouse midbrain （n=6）

表3 各組小鼠TH、α-synuclein 表達比較（n=6，±s）Tab 3 Comparison of TH and α-synuclein expression in mice of each group（n=6，±s）

表3 各組小鼠TH、α-synuclein 表達比較（n=6，±s）Tab 3 Comparison of TH and α-synuclein expression in mice of each group（n=6，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別對照組對照+TQ 組模型組模型+TQ 組FP TH/Tubulin 0.785 4±0.007 8 0.569 5±0.016 9 0.398 0±0.007 2**0.590 8±0.011 6##569.311＜0.001 α-Syn/Tubulin 0.299 0±0.013 1 0.353 8±0.008 4 0.752 4±0.012 9**0.437 8±0.004 9##1 138.166＜0.001

3.3 TQ 對PD 小鼠模型NLRP3 炎癥小體相關蛋白表達的影響

結果顯示，模型組小鼠NLRP3、 ASC、 Caspase1、 IL-1β 蛋白表達水平顯著升高，與模型組比較，模型+TQ 組NLRP3 炎癥小體蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。見圖2、表4。

圖2 小鼠中腦NLRP3、ASC、caspase-1 和IL-1β 蛋白的表達（n=6）Fig 2 Protein expression of NLRP3， ASC， caspase-1 and IL-1β in mouse midbrain （n=6）

表4 小鼠中腦NLRP3、ASC、Caspase-1 和IL-1β 蛋白的表達（n=6，±s）Tab 4 Expression of NLRP3， ASC， Caspase-1 and IL-1β proteins in mouse midbrain（n=6，±s）

表4 小鼠中腦NLRP3、ASC、Caspase-1 和IL-1β 蛋白的表達（n=6，±s）Tab 4 Expression of NLRP3， ASC， Caspase-1 and IL-1β proteins in mouse midbrain（n=6，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別對照組對照+TQ 組模型組模型+TQ 組FP NLRP3/Tubulin 0.058 2±0.000 3 0.134 1±0.004 5 0.750 9±0.021 4**0.281 6±0.006 2##2 244.538 ASC/Tubulin 0.412 6±0.011 4 0.206 2±0.000 8 1.481 8±0.056 1**0.163 6±0.012 0##1 348.206 IL-1β/Tubulin 0.296 6±0.010 9 0.135 8±0.006 7 0.821 6±0.012 9**0.114 7±0.005 8##3 572.197＜0.001＜0.001＜0.001 Caspase-1/Tubulin 0.487 0±0.001 8 0.536 8±0.006 2 0.740 1±0.012 4**0.386 5±0.009 7##916.856＜0.001

3.4 MPP+對BV-2 細胞活化的影響

未任何干預BV-2 細胞處于未活化狀態(tài)，軸突清晰可見，貼壁良好。加入不同濃度MPP+后，BV-2 細胞表面突起逐漸收縮，并呈現(xiàn)出胞體增大、突起變短、細胞形態(tài)呈圓形的活化狀態(tài)。見圖3。

圖3 倒置顯微鏡下BV-2 細胞的形態(tài)變化（×200）Fig 3 Morphological changes of BV-2 cells under an inverted microscope （×200）

3.5 MPP+誘導BV-2 細胞活化間接對SH-SY5Y細胞損傷的影響

為檢測MPP+是否在激活BV-2 細胞所需的劑量下引起的SH-SY5Y 細胞損傷，觀察MPP+對SH-SY5Y 細胞活力的影響。MTT 結果顯示，MPP+在1～400 μmol/L 濃度范圍內(nèi)未引起顯著的SH-SY5Y 細胞死亡（P＞0.05）。當MPP+濃度為100 μmol/L 時，BV-2 細胞大量活化。見圖3、表5。

表5 MPP+對BV-2 細胞和SH-SY5Y 細胞活力的影響（n=3，±s，%）Tab 5 Effect of MPP+ on the viability of BV-2 cells and SH-SY5Y cells（n=3，±s，%）

表5 MPP+對BV-2 細胞和SH-SY5Y 細胞活力的影響（n=3，±s，%）Tab 5 Effect of MPP+ on the viability of BV-2 cells and SH-SY5Y cells（n=3，±s，%）

注：與對照組比較,**P＜0.01。

組別對照組模型組質(zhì)量濃度（μmol/L）25 BV-2 細胞存活率98.879 0±5.028 0 100.394 0±3.745 6 SH-SY5Y 細胞存活率102.619 9±1.892 3 120.780 4±9.745 0 50 75 100 200 400 800 99.746 5±8.348 6 96.281 7±6.334 8 115.316 3±14.793 9 84.639 2±4.369 4**63.847 9±8.877 2**54.383 4±6.804 2**110.058 1±10.266 0 104.360 2±11.170 2 122.534 0±11.954 8 132.993 3±4.963 4 114.746 2±12.237 4 87.228 3±4.693 3**F P 19.668 7.185＜0.001＜0.001

BV-2 細胞與SH-SY5Y 細胞條件培養(yǎng)下，100 μmol/L MPP+可顯著降低SH-SY5Y 細胞存活率（P＜0.01），見表6。

表6 MPP+對條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞活力的影響（±s，%）Tab 6 Effect of MPP+ on the viability of conditioned SH-SY5Y cells（±s，%）

表6 MPP+對條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞活力的影響（±s，%）Tab 6 Effect of MPP+ on the viability of conditioned SH-SY5Y cells（±s，%）

注：與對照組比較,**P＜0.01。

組別對照組條件培養(yǎng)組100 μmol MPP+細胞存活率(%)99.998 2±3.919 5 35.986 0±6.933 6**88.230 5±10.263 9 F P 61.903＜0.001

然而，等量的MPP+（不經(jīng)過BV-2 細胞調(diào)節(jié)）直接添加到SH-SY5Y 細胞培養(yǎng)液中，并未降低SH-SY5Y 細胞活性。根據(jù)MTT 結果以100 μmol/L MPP+進行后續(xù)實驗。

3.6 TQ 對條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞損傷的影響

條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞24 h 后，結果顯示，0.25 μmol/L 及0.5 μmol/L TQ 可 明 顯 減 輕 條 件 培養(yǎng)液誘導的SH-SY5Y 細胞死亡（P＜0.01）。見表7。以0.25 μmol/L 及0.5 μmol/L TQ 進 行 后 續(xù)實驗。

表7 TQ 對MPP+介導的條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞活力的影響（n=3，±s，% ）Tab 7 Effect of TQ on the Activity of MPP+Mediated Conditional Culture SH-SY5Y Cells（n=3，±s，% ）

表7 TQ 對MPP+介導的條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞活力的影響（n=3，±s，% ）Tab 7 Effect of TQ on the Activity of MPP+Mediated Conditional Culture SH-SY5Y Cells（n=3，±s，% ）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 質(zhì)量濃度(μmol/L)細胞存活率105.821 9±3.395 9 78.621 0±1.711 2**87.885 8±4.426 5#98.441 6±6.917 1##101.180 4±5.355 5##82.314 1±1.540 8#91.014 8±2.989 2##17.413＜0.001對照組模型組模型+TQ 組陽性對照組100 0.1 0.25 0.5 0.75 0.1 F P

3.7 百里醌對條件培養(yǎng)SH-SY5Y細胞凋亡率的影響

結果顯示，模型組凋亡細胞數(shù)量顯著增多（P＜0.01），而模型+TQ 組和陽性對照組凋亡陽性細胞 顯著減少（P＜0.01）。見圖4、表8。

圖4 TQ 對條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞凋亡的抑制作用（n=3；比例尺：200 μm）Fig 4 Inhibition of TQ on apoptosis in conditioned SH-SY5Y cells （n=3；scale bar： 200 μm）

表8 TQ 對MPP+條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞凋亡率的影響（n=3，±s，% ）Tab 8 Effect of TQ on apoptosis rate of SH-SY5Y cells cultured under MPP+ conditions（n=3，±s，% ）

表8 TQ 對MPP+條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞凋亡率的影響（n=3，±s，% ）Tab 8 Effect of TQ on apoptosis rate of SH-SY5Y cells cultured under MPP+ conditions（n=3，±s，% ）

注：與對照組比較, **P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

組別 質(zhì)量濃度(μmol/L)細胞凋亡率對照組模型組模型+TQ 組陽性對照組1.516 3±0.131 6 13.699 7±0.532 71**3.816 3±0.330 8##1.838 0±0.154 4##4.743 0±0.183 3##795.032＜0.001 100 0.25 0.5 0.1 F P

3.8 TQ 對條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞凋亡相關蛋白的影響

MPP+后Bcl-2/Bax 比值表達顯著下調(diào)，而TQ可以促進Bcl-2/Bax 比值的表達（P＜0.01）。同時，MPP+促進了凋亡關鍵調(diào)控蛋白Caspase-3 的表達（P＜0.01）提示激活的BV-2 細胞對SH-SY5Y 細胞的損傷作用，而TQ 干預后顯著抑制MPP+誘導的Caspase-3 的增加（P＜0.01）。提示TQ 通過干預BV-2 細胞的激活，減輕SH-SY5Y 細胞凋亡。見圖5 及表9。

圖5 各組條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達比較（n=3）Fig 5 Bcl-2， Bax， and caspase-3 protein expression in SH-SY5Y cells under conditions in each group（n=3）

表9 各組條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達比較（n=3，±s）Tab 9 Bcl-2， Bax and Caspase-3 protein expression in SH-SY5Y cells cultured under conditions in each group（n=3，±s）

表9 各組條件培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達比較（n=3，±s）Tab 9 Bcl-2， Bax and Caspase-3 protein expression in SH-SY5Y cells cultured under conditions in each group（n=3，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別對照組模型組模型+TQ 組質(zhì)量濃度(μmol/L)陽性對照組100 0.25 0.5 0.1 FP Bcl-2/Tubulin 1.184 9±0.003 0 0.694 6±0.001 9**0.614 6±0.003 1##1.123 6±0.010 5##0.661 3±0.000 2##8 450.052 Bax/Tubulin 0.472 4±0.001 2 0.807 7±0.002 8**0.511 7±0.002 2##0.506 0±0.004 5##0.499 9±0.002 8##7 017.984 Caspase3/Tubulin 0.337 1±0.003 3 0.905 5±0.002 9**0.690 0±0.004 4##0.532 3±0.006 4##0.484 5±0.003 7##7 580.833＜0.001＜0.001＜0.001

3.9 TQ 對BV-2 細胞炎癥因子分泌的影響

ELISA 結 果 顯 示，100 μmol/L MPP+作 用BV-2 細 胞8 h 后，IL-1β 表 達 量 較 對 照 組 顯 著 增 加（P＜0.01）；0.25 μmol/L 及 0.5 μmol/L TQ 預處理后，可降低IL-1β 水平。見表10。

表10 各組BV-2 細胞IL-1β 含量比較（n=3，±s）Tab 10 IL-1β content in BV-2 cells of each group（n=3，±s，pg/mL）

表10 各組BV-2 細胞IL-1β 含量比較（n=3，±s）Tab 10 IL-1β content in BV-2 cells of each group（n=3，±s，pg/mL）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別 質(zhì)量濃度(μmol/L)IL-1β對照組模型組模型+TQ 組2.300 0±1.419 3 20.877 8±1.003 5**9.000 0±0.351 1##11.633 3±0.655 7##198.783＜0.001 100 0.25 0.5 FP

3.10 TQ 對BV-2 細胞NLRP3 炎癥小體相關蛋白表達的影響

研究結果發(fā)現(xiàn)，MPP+誘導BV-2 細胞NLRP3、ASC、Caspase-1、 IL-1β 炎癥信號通路水平顯著升高，NLRP3、 ASC、 Caspase-1、 IL-1β 炎癥信號通路均在0.25 μmol/L， 0.5 μmol/L TQ 干預后得到顯著的抑制（P＜0.01）。見圖6 及表11。

圖6 各組BV-2 細胞NLRP3、ASC、caspase-1 和IL-1β 表達比較（n=3）Fig 6 NLRP3， ASC， caspase-1 and IL-1β expression in BV-2 cells of each group （n=3）

表11 各組BV-2 細胞NLRP3、ASC、Caspase-1 和IL-1β 表達比較（n=3，±s）Tab 11 NLRP3， ASC， Caspase-1 and IL-1β expression in BV-2 cells of each group（n=3，±s）

表11 各組BV-2 細胞NLRP3、ASC、Caspase-1 和IL-1β 表達比較（n=3，±s）Tab 11 NLRP3， ASC， Caspase-1 and IL-1β expression in BV-2 cells of each group（n=3，±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別 質(zhì)量濃度(μmol/L)NLRP3/Tubulin ASC/Tubulin Caspase-1/Tubulin IL-1β/Tubulin對照組模型組模型+TQ 組陽性對照組0.879 6±0.031 1 1.606 5±0.006 8**0.892 1±0.013 1##1.132 8±0.031 5##1.195 4±0.026 5##455.846＜0.001 100 0.25 0.5 0.1 F P 0.050 8±0.001 8 1.385 7±0.005 7**0.365 3±0.003 8##0.391 3±0.011 9##0.506 7±0.000 9##19 593.593＜0.001 0.139 9±0.005 1 0.860 7±0.001 2**0.252 4±0.004 4##0.559 1±0.006 2##0.645 5±0.004 2##12 539.373＜0.001 0.253 4±0.002 2 0.767 0±0.0 04 1**0.508 3±0.002 0##0.666 9±0.015 2##0.455 1±0.003 6##2 188.170＜0.001

4 討論

PD 與神經(jīng)免疫炎癥有密切聯(lián)系，激活的小膠質(zhì)細胞釋放的炎癥細胞因子TNF-α 能夠與神經(jīng)元上的TNF 受體結合，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）依賴的級聯(lián)反應并伴隨Toll 樣受體和核苷酸結合寡聚化樣受體的激活，此過程使神經(jīng)炎癥加重，導致神經(jīng)元凋亡［15，16］。研究顯示［17，18］，PD 患者和PD 動物模型黑質(zhì)區(qū)NLRP3 炎癥小體活化，證實NLRP3 炎癥小體抑制劑能顯著緩解多巴胺能神經(jīng)元的缺失，改善PD 小鼠運動功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)PD 的發(fā)展進程中，病理性α-syn 也會引起NLRP3炎癥小體的激活，導致DA 神經(jīng)元損傷［19］。TQ 可通過自由基清除、增加基因轉錄的作用，可產(chǎn)生大量天然的抗氧化劑［20］。TQ 通過抑制凋亡前蛋白Caspase -3、Caspase -9 的表達，有效減輕神經(jīng)元損傷［21］。TQ 還通過抑制LPS 誘導的IL-6 和誘生型一氧化氮炎癥因子表現(xiàn)出抗炎活性［22］。

體外實驗結果顯示，TQ 可明顯改善PD 小鼠行為障礙，降低PD 小鼠α-Syn 的水平和NLRP3 炎癥小體相關蛋白的表達，促進DA 能神經(jīng)元表面特征性抗體-TH 蛋白的表達。體內(nèi)實驗以LPS 聯(lián)合MPP+刺激BV-2 細胞模擬PD 病理環(huán)境，并給予TQ 干預。Bax 作為Bcl-2 家族中常見凋亡基因，與Bcl-2 結合形成異源二聚體，調(diào)控Bcl-2 的活性，當Bax 表達增多的時候，Bax/Bcl-2 上調(diào)，整體處于促進凋亡的狀態(tài)，可促進Caspase-3 的表達［23，24］。實驗結果顯示，在PD 模型中Bax 表達明顯上調(diào)，Bcl-2 表達下調(diào)，TQ 處理可以抑制Bax 的上調(diào)，促進Bcl-2的表達。并且，TQ 也可以抑制Caspase-3 促凋亡蛋白表達水平的上調(diào)。TQ 處理后可降低炎癥因子IL-1β 水平和NLRP3 炎癥小體相關蛋白的表達。提示MPP+激活BV-2 細胞后炎性細胞因子大量釋放，促進NLRP3 炎性小體釋放進而激活Bax 凋亡蛋白，導致SH-SY5Y 細胞的凋亡。TQ 通過抑制NLRP3炎癥小體激活，減輕PD 神經(jīng)炎性損傷，進而保護SH-SY5Y 細胞。

綜上所述，TQ 能夠減輕PD 小鼠模型DA 能神經(jīng)元的損傷；TQ 可減少MPP+干預引起的BV-2 細胞NLRP3 炎癥小體的表達和炎癥因子釋放，減輕炎癥反應，改善多巴胺能神經(jīng)元損傷，在PD 神經(jīng)炎癥方面具有保護作用。

作者貢獻度說明：

葛淑麗：設計實驗、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；程楠：對論文提出指導意見；董健健、徐陳陳：參與動物造模及實驗指標檢測。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。