香煙誘導(dǎo)支氣管上皮細胞外泌體釋放miR-34a 靶向CASP2 促進肺成纖維細胞增殖

李思廣，林凌桑，陳 潔，趙 潔，丁毅鵬，3

（1.海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院，海南 ?？?570311；2.海南省人民醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570311；3.海南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，海南 海口 570311）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease， COPD）是一種持續(xù)性的、對呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生負面影響的疾病［1］。預(yù)計到2030 年，COPD 將成為全球第三大導(dǎo)致死亡的疾病，對公眾的呼吸健康構(gòu)成了嚴重的威脅［2］。吸煙被視為COPD 的主要觸發(fā)因素，煙草煙霧對氣道持續(xù)性惡化的影響已經(jīng)得到了廣泛的研究［3］。其中，肺成纖維細胞在此過程中發(fā)揮重要作用［4］。COPD 患者的肺成纖維細胞過度增生，可能是導(dǎo)致肺功能衰退的主要因素之一［5］。

外泌體（Exosomes）可將多種物質(zhì)如脂質(zhì)、蛋白和核酸等，通過多囊體腔排出細胞外。這種納米級別的細胞外囊泡通過細胞間的信號分子傳遞的方式，影響受體細胞的生理活動［6］。如果沒有這些微囊泡轉(zhuǎn)運的組織化功能，細胞將處于無序狀態(tài)。已有報道，外泌體 miRNA（exo-miRNAs）可介導(dǎo) miRNAs 的轉(zhuǎn)運和表達，進而促進細胞遷移、凋亡、增殖、自噬等，調(diào)控受體細胞功能［7］。大量研究指出，exo-miRNA 被發(fā)現(xiàn)可能有助于COPD 的診斷，并且可能是有效的預(yù)后生物標志物，甚至可能成為臨床治療靶標［8］。exo-miRNAs 在 COPD 發(fā)病中的作用日益受到關(guān)注，但其在COPD 發(fā)病中的作用尚不明確。其中，miR-34a 有望成為新的干預(yù)靶點，并有望在COPD 及其它氧化應(yīng)激相關(guān)的老年性疾病中發(fā)揮重要作用［9］。

CASP2 是一種半胱氨酸類半胱氨酸蛋白酶，也稱為Caspase-2，其作為腫瘤抑制因子參與多種癌基因驅(qū)動的過程［10］。CASP2 是一種在外界或外界因素刺激下被活化的蛋白，通過激活CASP2，引起一系列的細胞凋亡［11］。與此同時，CASP2 還可以通過調(diào)節(jié)免疫細胞的活化和炎性信號的傳遞，來產(chǎn)生炎癥效應(yīng)［12］。早期的研究揭示了miR-34a 能夠通過降低CASP2 的表達，提高神經(jīng)細胞的存活率，并減輕由Aβ 沉積引發(fā)的神經(jīng)細胞損傷［13］。而在肺癌細胞中，miR-494 則是通過靶向CASP2 來促進非小細胞肺癌細胞的增殖［14］。

本研究通過探討經(jīng)香煙模擬物（CES）處理支氣管上皮細胞16 HBE 后外泌體中miR-34a 表達，以及外泌體與miR-34a 模擬物對肺成纖維細胞MRC-5 增殖凋亡的影響，進一步確認miR-34a 與CASP2 之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，香煙刺激后，miR-34a 表 達 明 顯 升 高，且exosomes 中miR-34a 可靶向下調(diào)CASP2，并促進MRC-5 的增殖。據(jù)此，得出結(jié)論香煙誘導(dǎo)下，支氣管上皮細胞釋放的 exosomalmiR-34a，通過其介導(dǎo)的肺成纖維細胞異常增生參與COPD 發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩種細胞：由中國科學(xué)院（China Science of Cell）上海細胞學(xué)研究所（Chiari Science of Chiari Science）購得的人支氣管上皮細胞（16 HBE）和ATCC?CCL-171 ?胚胎肺臟成纖維細胞系（MRC-5）。培養(yǎng)基：由美國 Gibco 公司購得的FBS、MEM 和DMEM 培養(yǎng)基?；蛞铮簃iR-34a引 物、miR-34a mimic 和mimic negative control（NC）由上海吉瑪公司合成?？贵w：CASP2 抗體（ab179520）、GAPDH（ab8245）抗體從abcam 公司購買。試劑盒：RNA 提取試劑盒從天根生化科技（北京）有限公司購買，CCK-8 試劑盒從武漢華美公司購買，雙熒光素酶試劑盒從Promega 公司購買。儀器設(shè)備：透射電子顯微鏡使用的是美國FEI 品牌，CO2培養(yǎng)箱（3111）從Thermo Fisher 公司購買。其他：Lipo-2000（L3000015）從Thermo Fisher 公 司購買。

1.2 制備香煙模擬物

將20 支市售黃金葉牌香煙經(jīng)過完全燃燒，然后將產(chǎn)生的煙霧溶解于20 mL 無血清DMEM 培養(yǎng)基中，用 0.22 μm 濾膜（EMDMillipore，Billerica，MA）對該培養(yǎng)基進行滅菌過濾，以去除懸浮的微粒和細菌，得到含CSE 的DMEM 母液。將所述提取物（定義為100%CSE）稀釋至規(guī)定的濃度，并在制備后10 min 內(nèi)使用。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與CES 的處理 16HBE 細胞和MRC-5 細胞維持于含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素和100 U/mL 青霉素（Sigma，Poole，UK）的DMED 和MEM 中，在5% CO2、37 °C 的環(huán)境中培養(yǎng)至50%～60%細胞密度。將16HBE 細胞分組進行處理，設(shè)置實驗組加入20%濃度的CES，不加CES為空白對照組。培養(yǎng)48 h 后，從每個組的培養(yǎng)基中收集上清外泌體（含有細胞外膜囊泡），將從16HBE細胞采集到的外泌體用于MRC-5 細胞的處理。

1.3.2 分離外泌體 外泌體從正常或CES 處理的16HBE 細胞的培養(yǎng)基中分離出來。收集16HBE 細胞上清，置于常溫離心機中離心，離心力為3 000g，離心時間為15 min。離心結(jié)束后用0.22 μm PVDF過濾器進行過濾，過濾的上清移至新試管中，加入1∶5 比例的Exoquick-TC Solution 外泌體沉淀液（System Biosciences），混合后于4 ℃環(huán)境下冷藏12 h 以上。第二次離心，離心力為1 500g，離心時間為30 min。離心結(jié)束后棄去上清液。第三次離心，離心結(jié)束后5 min，將剩余的液體移出。隨后將含外泌體的沉淀物重新懸浮在去核酸酶的水中。使用ZetaView 微粒追蹤器（ParticleMetrix，Germen）對外泌體進行納米顆粒跟蹤分析，以研究其粒徑分布和濃度。

1.3.3 透射電子顯微鏡（TEM） 將獲取到的外泌體進行以下預(yù)處理：用PBS 緩沖液稀釋至適當濃度（50 μg/mL），取20 μL 的外泌體懸浮液加入到預(yù)先制 備 好 的 聚 乙 二 醇（polyethylene glycol，PEG-8000）溶液（2.0%體積比），充分混合后放置室溫下，靜置30 min 進行沉淀。去除上清液并用0.1 mol/L PBS 緩沖液將沉淀物重新懸浮。將適量懸浮液滴在碳膜和支撐膜的銅網(wǎng)格上，輕輕吸去多余懸浮液，讓其在自然通風(fēng)處干燥20 min 左右。

使用透射電子顯微鏡（JEM-1200EX， JEOL Ltd， Japan）對制備的樣品進行檢測觀察。將電子束設(shè)置為100 kV，先在低倍數(shù)下定位樣品位置，然后切換到高倍觀察以獲得更高分辨率的圖像。通過閃爍屏幕將圖像曝光并轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。使用圖像軟件分析照片，計算外泌體的大小和數(shù)量。

1.3.4 提取外泌體RNA 進行RT-PCR 檢測 首先，使用外泌體RNA 提取試劑盒（美國System Biosciences）提取exosome 中的全部RNA，隨后檢測所提取的RNA 濃度和完整性，檢測工具采用Bioanalyzer 2100 儀器（美國安捷倫）。然后，利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（18057018；賽默飛世爾）和隨機引物，基于 EasyBlue 試劑（Laboratory Technology）對 RNA進行反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 的 PCR 擴增。GAPDH被用作mRNA 加載對照。所得到的PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，并通過10%溴化乙啶凝膠體系（Daihan， WGD30）進行可視化。最后，使用SYBR Green PCR Master Mix（北京索萊寶科技有 限 公 司，SR1110），miR-34a和CASP2特 異 性 引物和探針進行RT-PCR。通過同時檢測內(nèi)參基因U6 和miR-34a 的 相 對 表 達 量，并 采 用2-ΔΔct法 比 較CES 處理組和正常對照組的表達差異。用于擴增miR-34a和CASP2的引物序列如下：miR-34a：（上游引物） 5′-GGCTCGAGTAGTTGCCTGGGCTGGTCTT-3′和（下 游 引 物）5′-GGGCGGCCGCCCTGTGCCTTTTTCCTTCC-3′；CASP2：（ 上 游 引 物） 5′-CAGTTACCTGCACACCGAGT-3′和（下游引物） 5′-CAGTTACCTGCACACCGAGT-3′。

1.3.5 CCK-8 檢測MRC-5 細胞增殖 使用CCK-8細胞計數(shù)試劑盒（ck04，Dojindo，中國），將100 μL 的細胞懸液加入96 孔板，每組設(shè)有3 個孔，每孔細胞密度為1×104個細胞。然后將板置于37 °C、5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜。在細胞培養(yǎng)的第24、48、72和96 h 時，將10% CCK-8 試 劑 的100 μL 培 養(yǎng) 液 加入到每孔中，孵育2 h 后，使用酶標儀（BioTek，美國）檢測450 nm 處的光密度（OD）值。x 軸表示檢測時間t，y 軸表示OD 值，收集相關(guān)數(shù)據(jù)并繪制細胞生長曲線，以展示MRC-5 細胞的生長和增殖能力。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因檢測 采用Targetscan數(shù)據(jù)庫（http：//www.targetscan.org/）預(yù)測miR-34a與Caspase-2的結(jié)合位點。為了建立一個用于檢測miRNA-mRNA相互作用的模型，分別將miR-34a、CASP2結(jié)合部位的野生型（WT）、突變型（MUT）序列插入到螢火蟲熒光素酶基因下游，得到表達載體。接下來，將miR-34a mimics與pmirGLO-CASP2-WT和MUT 重組質(zhì)?；旌?，在對照組中加入miRNA-NC與CASP2 的WT 和MUT 重組質(zhì)粒混合，并與Lipo-2000 脂質(zhì)體一起轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，轉(zhuǎn)染48 h。最后根據(jù)試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.3.7 Western blot 檢測 從每組細胞中提取細胞裂解液來獲得總蛋白，使用BCA 試劑盒測定總蛋白的濃度。將5×Loading buffer 加入總蛋白進行15 min 的變性處理，處理條件是100 °C 的金屬浴。每組取20 μg 蛋白上樣，進行SDS-PAGE 蛋白電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（孔徑為0.22 μm）。用5%脫脂奶粉將膜上的蛋白進行封閉，封閉時間為1 h。接著進行孵育，孵育條件為一抗（濃度為1∶1 000），在4 °C 的環(huán)境下過夜孵育。對膜進行洗滌，洗滌次數(shù)為6 次，每次洗滌時間為5 min。洗滌結(jié)束后加入山羊抗兔二抗（濃度為1∶5 000），在溫室中孵育1 h。對膜進行第二次洗滌，洗滌次數(shù)為3 次，每次洗滌時間為5 min。最后，在凝膠成像系統(tǒng)中加入化學(xué)發(fā)光試劑，顯影蛋白然后采集圖像。確定GAPDH 作為內(nèi)參，使用Image J 軟件分析蛋白條帶的灰度表達，計算蛋白的相對表達量。

1.3.8 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和圖表繪制使用GraphPad Prism 9.0 軟件進行，每個實驗均獨立重復(fù)3 次。呈正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）的形式表示，當P＜0.05 時，則視為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 分離16HBE 外泌體的特征

經(jīng)透射電鏡觀察外泌體的典型特性，發(fā)現(xiàn)16HBE 細胞釋放的外泌體具有近似100 nm 直徑的球形囊泡狀結(jié)構(gòu)（如圖1 所示）。這一結(jié)果表明所采用的外泌體分離技術(shù)有效且可靠，所獲得的外泌體適于后續(xù)處理MRC-5 細胞。

圖1 透射電鏡觀察香煙處理16HBE 外泌體囊泡結(jié)構(gòu)Fig 1 Observation of the structure of 16HBE exosome vesicles treated with cigarettes by transmission electron microscopy

2.2 CES 顯著促進16HBE 分泌外泌體miR-34a

通過RT-PCR 檢測香煙模擬物處理支氣管上皮細胞上清外泌體miR-34a 的相對表達豐度，如圖2所示香煙模擬物處理組中miR-34a 表達量（3.22±0.33）顯著高于對照組（1.04±0.07）（t=11.09，P＜0.001）。

圖2 CES 處理組與對照組細胞上清外泌體miR-34a 相對表達水平Fig 2 Relative expression level of exosome miR-34a in supernatant of CES - treated cells and control

2.3 CES 誘導(dǎo)16HBE 外泌體miR-34a 促進MRC-5增殖

使用從CSE 處理的16HBE 細胞上清中分離的外 泌 體miR-34a（exo-CES）對MRC-5 細 胞 進 行 培養(yǎng)，采用CCK-8 檢測細胞的生長情況，比較exo-CES 組與對照組 MRC-5 細胞的增殖活力變化。結(jié)果顯示， exo- CES 組（2.51±0.13）MRC-5 細胞的增殖活力顯著高于空白對照組（1.71±0.19）（t=16.31，P＜0.000 1），見圖3。

圖3 exo-CES 促進MRC-5 細胞增殖Fig 3 exo-CES promoted the proliferation of MRC-5 cells

2.4 miR-34a 對CASP2 的調(diào)控作 用

為探究miR-34a mimic 對COPD 成纖維細胞的影響，使用mir-34a mimic 培養(yǎng)MRC-5 細胞后采用CCK-8 檢測MRC-5 細胞的增殖情況。結(jié)果顯示，miR-34 mimic 組（2.77±0.10）MRC-5 細胞的增殖活力顯著高于NC 組（1.60±0.12），見圖4B。通過Targetscan 數(shù) 據(jù) 庫 途 徑 預(yù) 測mir-34a 與CASP2 結(jié)合，結(jié)合位點見圖4E，雙熒光素酶實驗檢測結(jié)果顯示（見 圖4F），CASP2-WT+miR-34a 組（0.38±0.02）熒光強度顯著低于NC 組（1.00±0.05）（t=20.61，P＜0.001），而CASP2-MUT+ miRNA-34a組（0.94±0.02）熒光強度與 NC 組（1.00±0.03）無顯著差異（t=2.777，P=0.05），由此證明CASP2是miR-34a 的靶基因。此外，Western blot 檢測的結(jié)果顯示，miR-34 mimic 組（2.76±0.22）的miR-34a表達顯 著 高 于 于NC 組（1.04±0.08）（t=12.69，P＜0.001），見 圖4A；miR-34 mimic 組（0.46±0.06）CASP2的 表 達 顯 著 低 于NC 組（1.07±0.12）（t=7.94，P＜ 0.01），見圖4C。

圖4 miR-34a 轉(zhuǎn)染促進MRC-5 肺成纖維細胞增殖并抑制CASP2 基因表達Fig 4 miR-34a transfection promotes MRC-5 lung fibroblast proliferation and inhibits the expression of CASP2

3 討論

作為一種普遍存在的慢性呼吸道疾?。?5］，COPD 在當前的呼吸道疾病研究中，仍然占據(jù)著核心的關(guān)注焦點。慢性阻塞性肺損傷是COPD 的重要臨床癥狀，吸煙可引起氣道上皮損傷及炎癥反應(yīng)，約有20%的人會發(fā)展成慢性阻塞性肺疾?。?6］。2017 年，全世界COPD 病人達5.44 億人，其中以男性及吸煙人群最為普遍［17，18］。據(jù)研究顯示，香煙煙霧的暴露有可能損害氣道的防護作用，削弱氣道上皮細胞的免疫功能［19］，這種影響通過加重炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和加速細胞死亡等方式，最終可能導(dǎo)致COPD 的發(fā)生［20］。目前仍舊無法徹底根治COPD，只能通過緩解其癥狀來拖延其發(fā)展。因此，深化對COPD 發(fā)病機制的理解，以尋求有效的干預(yù)手段，已成為當前COPD 研究中的關(guān)鍵課題和挑戰(zhàn)。

在肺組織內(nèi)，主要的成纖維細胞類型是肺成纖維細胞［21］。在COPD 的組織病理中可以發(fā)現(xiàn)明顯的纖維化，而肺成纖維細胞起著關(guān)鍵的作用［22］。大量的研究發(fā)現(xiàn)，氧化還原狀態(tài)［23］、炎癥細胞介導(dǎo)的氧自由基［24］、增殖因子［25］和細胞因子［26］等均參與肺成纖維細胞的增殖調(diào)控。已有證據(jù)表明，肺成纖維細胞通過產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和細胞因子，使支氣管上皮致炎［27］。另外，肺成纖維細胞的異常增殖可能導(dǎo)致細胞周期凋亡、失調(diào)，致使肺部組織形成瘢痕，從而推動纖維化病變進程［28，29］。在肺成纖維細胞中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1 的表達上升會引發(fā)膠原蛋白等基質(zhì)成分的生成，沉積的膠原增厚氣道壁，由此發(fā)生氣道重塑［30］。這些研究結(jié)果支持了肺成纖維細胞在COPD 的發(fā)展和進展中發(fā)揮著重要的作用，抑制肺成纖維細胞過度增殖可能有助于控制COPD 的病程和炎癥反應(yīng)［29］。

外泌體在細胞環(huán)境中發(fā)揮著囊泡運輸?shù)慕巧?，充當著細胞間物質(zhì)信息溝通的關(guān)鍵載體，影響近鄰或遠距離細胞的多種功能，取決于它們攜帶并遞送到目標細胞的生物活性物質(zhì)，進而對身體的生理和病理功能產(chǎn)生影響［31］。其生物學(xué)獨特屬性使它們成為高效藥物傳遞的理想納米級載體［32］。另外，由外泌體源產(chǎn)生的miRNA 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)參與了許多疾病的發(fā)病過程，并被視為這些疾病的潛在早期診斷和預(yù)后指標［33］。很多研究都顯示，外泌體和miRNA在COPD 病理過程中發(fā)揮了重要的作用［34，35］。

miR-34a 的影響力在多種腫瘤發(fā)展中已被廣泛研 究 和 確 認［36］。 例 如，miR-34a 通 過 調(diào) 控Cdc 42-WASP-Arp 2/3 通路，可能促進F-actin 的改變和ROS 的生成，進一步誘導(dǎo)骨髓增生異常綜合征患者的中性粒細胞凋亡［37］。另一方面，miR-34a 能通過調(diào)整免疫微環(huán)境中的PDL 1，作為腫瘤抑制因子，抑制胃癌的擴大和入侵［38］。值得注意的是，miR-34a的降低可能促使頭頸癌的發(fā)生，其機制可能涉及上調(diào)MET癌基因并調(diào)整腫瘤的免疫逃逸策略［39］。在酒精引發(fā)的肝損傷中，miR-34a 通過引導(dǎo)巨噬細胞Sirt 1 信號通路，對脂肪性肝炎和新生血管的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用［40］。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-34a 能推動腎纖維化的發(fā)生，誘導(dǎo)腎成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)變［41］。此外，miRNA-34a 通過調(diào)整Krüppel 樣因子4 的表達，參與肺上皮細胞在高氧環(huán)境下的老化過程［42］。來自支氣管外泌體的miR-34a 對COPD 肺成纖維細胞是否產(chǎn)生確切的影響，至今尚未明確。

本研究中使用香煙模擬物誘導(dǎo)支氣管上皮細胞16HBE，得到外泌體中miR-34a 表達顯著增的結(jié)果。使用這些16HBE 細胞產(chǎn)生的外泌體miR-34a來培養(yǎng)肺成纖維細胞MRC-5 時，觀察到了MRC-5細胞增殖的明顯變化。并且本研究成功預(yù)測了CASP2 是miR-34a的目標基因，接著通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-34a和CASP2之間存在靶向關(guān)系。另外使用miR-34amimic 抑制了CASP2的表達，進一步確認它對COPD 肺成纖維細胞增殖的調(diào)控作用。這可能是香煙推動COPD 肺成纖維細胞增殖的機制之一，或?qū)镃OPD 的新治療靶點提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

作者貢獻度說明：

李思廣：細胞培養(yǎng)、撰寫論文；林凌桑：細胞處理、細胞檢測；陳潔：統(tǒng)計分析、資料整理；趙潔：實驗指導(dǎo)、修訂論文；丁毅鵬：課題設(shè)計、經(jīng)費支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。