安羅替尼對(duì)兒童T-急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究

楊好好 岑夢(mèng)姣 王佳萍

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）由骨髓、血液和髓外部位淋巴祖細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和增殖引起，70%的患者為兒童[1]。雖然化療藥物治療兒童ALL 有一定療效，但引起的藥物不良反應(yīng)不容忽視[2-4]。因此，尋找靶標(biāo)明確、更為低毒有效的治療藥物對(duì)提高患者的生存質(zhì)量具有重大意義。安羅替尼具有抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤生長的作用[5-6]，多種實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)正在開展[7-8]。研究表明，安羅替尼通過抑制磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路降低B 細(xì)胞-ALL（B cell-ALL，BALL）細(xì)胞的活力[9]。然而，安羅替尼是否具有其他潛在的靶點(diǎn)仍待闡明。Abelson 酪氨酸蛋白激酶1（Abelson tyrosine kinase 1，ABL1）是一種酪氨酸激酶，由于染色體易位形成斷點(diǎn)聚集區(qū)域（breakpoint cluster region，BCR）-ABL1 融合基因，部分BCR 基因和ABL1基因融合成一個(gè)新的BCR-ABL1 融合基因，導(dǎo)致產(chǎn)生異常的蛋白激酶BCR-ABL1[10]。研究發(fā)現(xiàn)，靶向PI3K/PKB/mTOR 信號(hào)通路的藥物在ABL1 融合陽性的細(xì)胞中具有更好的抑制效果[11]。因此，ABL1 可能是治療ALL 的潛在靶點(diǎn)。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及生物信息學(xué)分析，探討安羅替尼在兒童T 細(xì)胞-ALL（T cell-ALL，T-ALL）中的潛在作用，并分析其作用機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 鹽酸安羅替尼由正大天晴藥業(yè)提供（規(guī)格：12 mg；批號(hào)：H20180004），兒童T-ALL 細(xì)胞CCRF-CEM 和J.gamma1（分別來源于3 歲11 個(gè)月和14歲患兒）購于浙江如耀生物科技有限公司，膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶（annexin V/propidium iodide，Annexin V/PI）雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：556547）購于美國BD公司，BCR-ABL1（批號(hào)：3009）、ABL1（批號(hào)：2862）、p-PKB（批號(hào)：4047）、PKB（批號(hào)：11848）、p-PI3K（批號(hào)：17366）、PI3K（批號(hào)：4255）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號(hào)：5174），凋亡蛋白Caspase-3（批號(hào)：9662）、cl-Caspase-3（批號(hào)：9661）、cl-PARP（批號(hào)：5625）、Bax（批號(hào)：14796）、Bcl-2（批號(hào)：4223）抗體均購自美國CST 公司，細(xì)胞培養(yǎng)采用的RPMI1640 培養(yǎng)基（批號(hào)：BL303A）購于北京白鯊易公司，F(xiàn)BS（批號(hào)：10099141）、青霉素-鏈霉素（批號(hào)：15070063）均購于美國Gibco 公司，PKB激活劑SC79（305834-79-1）購于德國Merck 公司。倒置顯微鏡（型號(hào)：ECLIPSE Ti2）購于日本Nikon 公司，多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：SpectraMax M）購于美國molecular devices 公司，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiDoc-It Imaging System）購于美國UVP 公司，流式細(xì)胞儀（型號(hào)：Attune）購于美國Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將CCRF-CEM 和J.gamma1細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。每2～3 d 取出，以800 r/min 離心3 min 后棄上清液，并以1∶2～1∶4 傳代，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞活性檢測(cè) 收集處于對(duì)數(shù)增長期且生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，將細(xì)胞懸液按1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到96 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育過夜。加入稀釋好的不同濃度的安羅替尼，使終濃度為0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、15 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，每孔加入20 μL 細(xì)胞計(jì)數(shù)套件-8（cell counting kit-8，CCK-8）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度（OD）值，計(jì)算抑制率，抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值）×100%，并計(jì)算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 通過Annexin V/PI 雙重染色，確定細(xì)胞凋亡水平。根據(jù)CCK-8 法測(cè)得的IC50，分別設(shè)置安羅替尼低、中、高濃度組（1.25、2.5 和5 μmol/L）及對(duì)照組（0 μmol/L），細(xì)胞經(jīng)不同濃度處理24 h 后，800 r/min 離心5 min，棄上清液，將細(xì)胞懸浮在結(jié)合緩沖液中。加入5 μL Annexin V 和5 μL PI 溶液到細(xì)胞懸液中，室溫避光孵育15 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期（細(xì)胞開始發(fā)生凋亡的初期階段）和晚期（細(xì)胞凋亡的進(jìn)一步發(fā)展階段）的凋亡率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè) 通過Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得安羅替尼的簡(jiǎn)化分子線性輸入規(guī)范（simplified molecular input line entry system，SMILE）號(hào)，而 后 利 用SEA（sea. bkslab. org/）、MolTarPred（moltarpred.marseille.inserm.fr/）和Swisstarget（swisstargetprediction.ch/index.php）等在線小分子靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站，對(duì)安羅替尼的作用靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)。從Genecard（https://www.genecards.org/）上獲取與ALL 相關(guān)的基因。通過生物信息網(wǎng)站制作安羅替尼和ALL 的交集（http://www.bioinformatics.com.cn）。從PDB（rcsb.org/）上獲取目標(biāo)蛋白ABL1 的3D 結(jié)構(gòu)（PDB ID：4wa9），利用Vina2進(jìn)行安羅替尼與ABL1 蛋白結(jié)合的模擬對(duì)接。使用Pymol 軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.5 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將安羅替尼潛在作用靶標(biāo)列表導(dǎo)入DAVID 在線數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov），進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

1.2.6 凋亡蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。收集經(jīng)安羅替尼處理后的CCRF-CEM 和J.gamma1 細(xì)胞，在冰上加入RIPA 細(xì)胞裂解液裂解10 min，4 ℃下12 000 r/min，離心后取出上清液并用雙硫鍵還原劑（bicinchoninic acid，BCA）法進(jìn)行定量，加熱煮沸使蛋白變性。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺膠電泳分離總蛋白，隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗于4 ℃孵育過夜，將膜用TBST 洗滌3 次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，再洗膜3 次，加入ECL 用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。用Image J 對(duì)蛋白條帶進(jìn)行量化，以GADPH 為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 ABL1/PI3K/PKB 信號(hào)通路蛋白檢測(cè) 采用Western blot 法。收集經(jīng)0、1.25、2.5、5 μmol/L 安羅替尼處理48 h 后的CCRF-CEM 和J.gamma1 細(xì)胞，檢測(cè)不同濃度安羅替尼對(duì)BCR-ABL1 的影響。之后，根據(jù)安羅替尼對(duì)ABL1 的抑制作用，并可能抑制下游PI3K/PKB 通路，給予5 μmol/L SC79 進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證該通路中的蛋白表達(dá)量變化。蛋白提取和檢測(cè)方法同1.2.6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度安羅替尼對(duì)ALL 細(xì)胞增殖及形態(tài)的影響 在不同濃度安羅替尼作用下，CCRF-CEM 和J.gamma1 細(xì)胞的增殖受到抑制，且抑制率隨濃度的增加而增加（F=317.6、342.1，均P＜0.05），見圖1A。CCRFCEM 和J.gamma1 細(xì)胞在48 h 的IC50值分別為3.39、2.36 μmol/L。顯微鏡下顯示，隨著安羅替尼濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量減少，輕微皺縮，推測(cè)存在細(xì)胞凋亡，見圖1B。

圖1 不同濃度安羅替尼對(duì)CCRF-CEM 和J.gamma1 細(xì)胞增殖及細(xì)胞形態(tài)的影響（A：不同濃度安羅替尼對(duì)CCRF-CEM 和J.gamma1細(xì)胞的抑制率；B：不同濃度安羅替尼作用下CCRF-CEM 和J.gamma1 細(xì)胞顯微鏡下所見，×100）

2.2 不同濃度安羅替尼對(duì)T-ALL 細(xì)胞凋亡的影響隨著安羅替尼濃度的增加，ALL 細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率隨著濃度的增加而增加，與對(duì)照組比較，高濃度組CCRF-CEM、J.gamma1 早期及晚期凋亡率均增加（均P＜0.01），見表1。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯示，安羅替尼抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，促進(jìn)了凋亡促進(jìn)蛋白Bax 和cl-PARP 的表達(dá)，提高了Caspase-3的活化，并呈現(xiàn)劑量依賴性，高濃度組cl-PARP 和Bax升高最為顯著（P＜0.05），見圖2。

表1 不同濃度安羅替尼作用下CCRF-CEM、J.gamma1 細(xì)胞的凋亡率比較

圖2 不同濃度安羅替尼對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（A：CCRF-CEM 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的電泳圖；B：J.gamma1 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的電泳圖；C：CCRF-CEM 細(xì)胞免疫印跡量化結(jié)果；D：J.gamma1 細(xì)胞免疫印跡量化結(jié)果；與對(duì)照組比較，aP＜0.05）

2.3 安羅替尼靶標(biāo)分析以及與ABL1 分子對(duì)接結(jié)果KEGG 通路富集得到13 條信號(hào)通路，見圖3A（插頁），主要涉及Ras、Rap1、PI3K-PKB、NF-κB 信號(hào)，造血細(xì)胞系，癌癥的碳代謝，表明安羅替尼可能作用于這些信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖。通過多個(gè)靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站的結(jié)果得到交集為ABL1 見圖3B（插頁），分子對(duì)接顯示安羅替尼與ABL1 的潛在結(jié)合能為-8.8 kcal/mol 見圖3C（插頁），與氨基酸殘基Met318 之間產(chǎn)生氫鍵，與氨基酸殘基Leu248、Leu370、Phe382、Ala269、Lys271、Val256、Ala380 之間存在疏水相互作用，表明安羅替尼與ABL1 結(jié)合能較強(qiáng)。

圖3 安羅替尼靶標(biāo)分析以及其與ABL1 分子對(duì)接結(jié)果圖（A：KEGG 富集得到13 條通路，Y 軸代表路徑的名稱，X 軸表示靶向的基因背景的基因的比例，點(diǎn)的大小表示該通路中包含的基因與輸入基因列表交集的基因數(shù)；B：不同網(wǎng)站對(duì)安羅替尼靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的韋恩圖；C：安羅替尼與ABL1 分子對(duì)接示意圖）

2.4 不同濃度安羅替尼對(duì)ABL1/PI3K/PKB 蛋白表達(dá)和細(xì)胞活性的影響 安羅替尼作用于CCRF-CEM 和J.gamma1 細(xì)胞后，BCR-ABL1 的表達(dá)均降低（均P＜0.05）。加入SC79 后，兩種細(xì)胞內(nèi)p-PKB/PKB 表達(dá)均升高（均P＜0.05），逆轉(zhuǎn)了安羅替尼對(duì)ABL1/PI3K/PKB通路的抑制效果，見圖4。

圖4 不同濃度安羅替尼對(duì)ABL1/PI3K/PKB 蛋白表達(dá)和細(xì)胞活性影響（A：不同濃度安羅替尼對(duì)BCR-ABL1 蛋白表達(dá)的電泳圖及量化結(jié)果；B：加入SC79 后，安羅替尼對(duì)BCR-ABL1/PI3K/PKB 表達(dá)的電泳圖及量化結(jié)果；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與SC79 組相比，bP＜0.05）

3 討論

T-ALL 會(huì)導(dǎo)致患者造血功能受損和骨髓衰竭[12-13]。臨床上治療手段有限，仍以化療（如甲氨蝶呤、糖皮質(zhì)激素、長春新堿等）或者骨髓移植為主，但藥物治療往往伴隨著較大的不良反應(yīng)[3,14]，且易出現(xiàn)耐藥[15-16]。因此，開發(fā)新的T-ALL 治療藥物迫在眉睫。安羅替尼是國內(nèi)自主研發(fā)的酪氨酸激酶抑制劑，在多種實(shí)體瘤中具有抗腫瘤作用[17-18]，但是對(duì)于血液腫瘤的應(yīng)用鮮有報(bào)道。最新的研究表明，安羅替尼通過抑制PI3K/PKB/mTOR 途徑誘導(dǎo)B-ALL 細(xì)胞的凋亡，引起G2/M 周期的停滯[9]，這為安羅替尼治療ALL 提供了重要的研究基礎(chǔ)。為探討安羅替尼對(duì)T-ALL 抑制效果，本研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼對(duì)T-ALL 細(xì)胞株J.gamma1 有更好的抑制作用，高濃度能顯著抑制T-ALL 細(xì)胞增殖，并導(dǎo)致細(xì)胞皺縮。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼可劑量依賴性促進(jìn)Caspase-3 的活化以及促凋亡相關(guān)蛋白，如Bax 和cl-PARP 等表達(dá)，最終引起T-ALL 細(xì)胞凋亡，與在其他實(shí)體瘤中的研究結(jié)果一致[19-20]。

通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)安羅替尼靶標(biāo)結(jié)果表明，主要靶標(biāo)可能涉及Ras、Rap1、PI3K-PKB、NF-κB等信號(hào)通路，造血細(xì)胞系，癌癥的中樞碳代謝，表明安羅替尼可能作用于這些信號(hào)通路抑制腫瘤的進(jìn)展。但以上預(yù)測(cè)結(jié)果的具體機(jī)制仍有待研究驗(yàn)證。進(jìn)一步的分子對(duì)接結(jié)果顯示，BCR-ABL1 是安羅替尼治療ALL 的潛在靶標(biāo)，BCR-ABL1 是腫瘤治療重要靶點(diǎn)[21]。ABL1 活化后可進(jìn)一步激活PI3K/PKB，而PI3K/PKB/mTOR 信號(hào)通路在BCR-ABL1 陽性ALL 患者中被顯著激活[22]，通過抑制BCR-ABL1 能夠誘導(dǎo)ALL 細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞活性。給予PKB 激活劑后顯著削弱安羅替尼誘導(dǎo)的ALL 細(xì)胞凋亡，這些結(jié)果均證實(shí)，安羅替尼通過抑制BCR-ABL1/PI3K/PKB 信號(hào)通路抑制CCRFCEM 和J.gamma1 細(xì)胞的增殖。臨床上，甲磺酸伊馬替尼特異性靶向BCR-ABL1 融合基因，不僅廣泛用于慢性粒細(xì)胞白血病的治療[23]，而且也使T-ALL 患者獲得持久的血液學(xué)緩解[24]，提示靶向抑制BCR-ABL1 也有望在T-ALL患者中獲益。

綜上所述，安羅替尼可能通過BCR-ABL1/PI3K/PKB 信號(hào)通路發(fā)揮抗ALL 作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究也為安羅替尼治療BCR-ABL1 陽性的ALL 患者提供了重要的研究基礎(chǔ)，后續(xù)將重點(diǎn)考察安羅替尼在T-ALL 動(dòng)物模型中的應(yīng)用，并探討最佳的給藥劑量。